全 文 ：第 34 卷第 23 期
2014年 23月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol.34,No.23
Dec.,2014
http: / / www.ecologica.cn
基金项目:环境保护部环保公益性行业科研专项(201009023)
收稿日期:2013鄄03鄄05; 摇 摇 网络出版日期:2014鄄03鄄18
*通讯作者 Corresponding author.E鄄mail: daichuanchao@ njnu.edu.cn
DOI: 10.5846 / stxb201303050350
杜威,江萍,王彦苏,吕立新,王宏伟,卜元卿,刘常宏,戴传超.白僵菌施加对水稻三种抗氧化酶活力及叶际微生物多样性的影响.生态学报,2014,
34(23):6975鄄6984.
Du W, Jiang P, Wang Y S, L俟 L X, Wang H W, Bu Y Q, Liu C H, Dai C C.Effects of Beauveria bassiana on paddy antioxidant enzymes activities and
phyllosphere microbial diversity.Acta Ecologica Sinica,2014,34(23):6975鄄6984.
白僵菌施加对水稻三种抗氧化酶活力
及叶际微生物多样性的影响
杜摇 威1,江摇 萍1,王彦苏1,吕立新1,王宏伟1,卜元卿2,刘常宏3,戴传超1,*
(1. 南京师范大学生命科学学院, 江苏省微生物资源产业化工程技术研究中心,江苏省微生物与功能基因组学重点实验室,南京摇 210023;
2. 环境保护部南京环境科学研究所,南京摇 210042;3. 南京大学生命科学学院,南京摇 210093)
摘要: 为了考察白僵菌使用后的生态安全性,研究了白僵菌施加对水稻 3种保护酶活力及叶际微生物多样性的影响。 使用荧
光定量 PCR对喷洒白僵菌孢子悬液的水稻叶际提取总 DNA 并进行荧光定量 PCR 扩增,发现白僵菌可以在水稻叶际残留达
30 d之久,并且初始喷施浓度越大,衰减速率越高。 与施加化学农药相比,施加白僵菌没有对水稻叶片的 3 种抗氧化酶活力带
来不利影响。 白僵菌处理组 SOD、POD活力在第 10天时高于对照组 20.38%、8.65%,而 CAT活力在第 30天时最高高于对照组
33.67%,在第 30天时,化学农药导致 CAT活力相比较对照组下降了 42.71%。 使用 DGGE分析表明白僵菌对水稻叶际细菌、真
菌微生物群落结构影响较小,并且白僵菌处理组微生物群落结构相似度、香农指数及条带数均较高。 结果表明白僵菌是一种环
境友好型的微生物农药。
关键词: 白僵菌;水稻;实时定量 PCR;微生物区系;抗氧化酶系
Effects of Beauveria bassiana on paddy antioxidant enzymes activities and
phyllosphere microbial diversity
DU Wei1, JIANG Ping1, WANG Yansu1, L譈 Lixin1, WANG Hongwei1, BU Yuanqing2, LIU Changhong3,
DAI Chuanchao1,*
1 Jiangsu Engineering and Technology Research Center for Industrialization of Microbial Resources, Jiangsu Key Laboratory for Microbes and Functional
Genomics, College of Life Science, Nanjing Normal University, Nanjing 210023, China
2 Nanjing Institute of Environmental Science, Ministry of Environment Protection, Nanjing 210042, China
3 College of Life Science, Nanjing University, Nanjing 210093, China
Abstract: Beauveria bassiana is a well鄄known entomopathogenic fungi with worldwide distribution that can be used as a
microbial pesticide. To date, studies of B. bassiana have focused on its insecticidal mechanism, symbiosis with plants and
antagonism of plant pathogens; however, few studies of its influence on the microecological phyllosphere and at
physiological level of the plant have been conducted. To investigate the ecological security of B. bassiana in the paddy
phyllosphere, we evaluated the effects of different concentrations of B. bassiana spore suspensions and a chemical pesticide
(acephate) on paddy phyllosphere microbial flora and protective enzyme activities by a potted trial. B. bassiana were then
induced to express the egfp gene (green fluorescent protein gene) through transformation with a vector, after which real鄄
time polymerase chain reaction ( PCR) was used to quantify the organisms and measure their dynamics in a paddy
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phyllosphere. We also evaluated the effects of different concentrations of B. bassiana suspensions on the phyllosphere
microflora using DGGE. To accomplish this, B. bassiana specific DNA primers were designed based on the green fluorescent
protein sequence marked B. bassiana. Amplification of B. bassiana DNA using the eGPF鄄F1 / eGFP鄄R1 primers yielded a
single 289bp鄄long product with a detection limit of 10fg / 滋L of B. bassiana genomic DNA. The pot experiments, which were
conducted in the botanical garden of Nanjing Normal University, consisted of the following seven treatments: sterile water
applied as a control ( CK), inoculation with the larva of Chilo suppressalis (A), application of the B. bassiana spore
suspension at 7.5伊104 spores / ml (B), 7.5伊105 spores / ml (C), 7.5伊106 spores / ml (D), or 7.5伊107 spores / ml (E),
application of acephate emulsifiable concentrates (F). Each treatment group was covered with gauze (3 m 伊 0.7 m 伊 1.5
m) after treatment. Fluorescence quantitative PCR analysis of the rice phyllosphere DNA revealed that B. bassiana was
maintained for at least 30 days on the leaves of paddy plants after application, but when a higher initial dosage of the B.
bassiana was applied, the B. bassiana population on the phyllosphere decreased more rapidly. When compared with
chemical pesticide, B. bassiana did not significantly affect the antioxidant activity of three enzymes in paddy leaves.
Specifically, the enzymatic activities of SOD and POD in B. bassiana treatment groups were 20. 38 and 8.65% higher,
respectively, than those in the CK group on the tenth day, while the activity of CAT was 33.67% higher than that of the CK
group on day 30. However, the enzymatic activity of CAT in the F group was 42.71% lower than that of the CK group on day
10. DGGE cluster analysis showed that B. bassiana did not significantly influence the bacterial or fungal community
structures on the paddy phyllosphere, and the microbial community structure similarity, Shannon index and band number in
the B. bassiana treated group were higher than in the negative control group. These results indicated that B. bassiana is an
environmental friendly microbial pesticide. Future studies of B. bassiana should focus on its effects on other endophytes in
plants. Studies to evaluate the role of B. bassiana could lead to a new paradigm on its successful use in biological control
programs.
Key Words: Beauveria bassiana; paddy; real鄄time PCR; microflora; antioxidant enzyme
摇 摇 白僵菌是一种典型的杀昆虫真菌,作为一种微
生物农药在全世界广泛使用[1],白僵菌能够寄生在
多种昆虫体内并产孢[2],它可以拮抗许多植物茎内
和叶际病原菌如灰霉病菌[3]、立枯丝核菌[4]等,除了
能够抑制病原菌菌丝生长,还能诱导多种病原菌的
细胞裂解[5]。 目前已经报道白僵菌可以成为很多植
物的内生菌,例如其在可可豆[6]、咖啡幼苗[7]、玉
米[8]中共生,也有研究表明其可以在一些树种如西
部白松[9]、椰枣[10]等树中共生。
国内外关于白僵菌的研究集中于其杀虫机制以
及与植物体的共生、拮抗病原菌等。 对于其在土壤
和叶际微生态系统中的行为研究较少,李永利等研
究发现低温、壤土及土壤含水量为 15%的条件下有
利于白僵菌的宿存[11],王滨等研究了白僵菌在土壤
中的宿存情况,发现前 2个月内处于波动状态,随后
下降较快,但在宿存过程中产孢量不受影响[12]。 但
是在叶际微生态系统中白僵菌的残留以及其对叶际
微生态系统和植物本身的生理水平影响的研究几乎
没有。 在植物叶际生存的微生物称为叶际微生
物[13],对叶际微生物的研究远落后于根际微生物的
研究[14],而叶际微生物作为一类重要的群体具有固
氮[15],抵御病害[16]及改变宿主微环境等功能,对外
界变化也较敏感,因此研究白僵菌施用后对植物叶
际的微生物群落结构、植物生理代谢水平影响及其
在植物叶际的残留动态对于评价微生物农药白僵菌
的生物安全性有重要意义。
超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过
氧化氢酶(CAT)等 3种抗氧化酶类能够有效的反映
植物的生理代谢水平变化,可作为评价外界环境条
件变化对植物生理代谢影响的指标。 微生物群落结
构变化也可作为评价外界环境变化影响的指标。 目
前,广泛利用分子生物学手段进行环境风险评
价[17],由于传统涂布平板法的局限性,DGGE 作为一
种分子生物学手段能够有效的反映环境中微生物群
落结构的变化。
实时定量 PCR 技术定量检测环境中某种特定
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微生物的特异性和灵敏度都很高,目前已被作为一
种成熟的技术手段用于微生物生态学研究[18鄄20],选
择合适的靶序列将决定 PCR 检测的特异性和灵敏
度,从而精确的对某种特定微生物定量[21鄄23]。 本文
获得了 1株有绿色荧光蛋白标记并能组成性表达的
白僵菌菌株[24],该基因是以整合到质粒中的形式存
在并转化到白僵菌菌株中,在无筛选压力下可以稳
定遗传。 针对绿色荧光蛋白序列设计了一对特异性
引物,建立了快速定量检测水稻叶际白僵菌残留的
实时定量 PCR 方法。 由于白僵菌和化学农药乙酰
甲胺磷均对水稻害虫二化螟有防治作用,因此本实
验在对水稻植株接种二化螟幼虫的基础上研究了不
同浓度的白僵菌孢子悬液及化学农药对水稻叶际微
生物区系及水稻保护酶系统的影响,评价白僵菌的
生物安全性并在同一体系中比较生物农药和化学农
药的生态影响,为白僵菌的使用提供指导和参考。
1摇 材料与方法
1.1摇 实验材料
(1)供试土壤摇 供试盆栽土壤取自南京师范大
学植物园,土壤 pH值 5.97,有机质 1.08%,总氮 1.21
g / kg,速效氮 98.64 mg / kg,总磷 0. 39 g / kg,速效磷
24郾 67 mg / kg,总钾 0.73 g / kg,速效钾 67.58 mg / kg。
(2)供试水稻(Oryza sativa) 摇 水稻品种为武育
粳 D1,购于江苏省农业科学院。
(3)供试二化螟(Chilo suppressalis) 摇 二化螟幼
虫由南京农业大学高建芬副教授赠送。
(4)供试白僵菌(Beauveria bassiana) 摇 白僵菌
菌株 Bb0062 (带有草丁膦抗性标记基因 bar 和表达
绿色荧光蛋白基因 egfp)由西南农业大学裴炎教授
赠送;将 GFP 标记的白僵菌菌株进行扩繁处理,并进
行荧光检测,确定该白僵菌有很强的荧光活性。 将
平板上培养好的白僵菌刮取孢子并用无菌去离子水
清洗并制成不同浓度孢子悬液用于实验。
(5)供试化学农药摇 化学农药为乙酰甲胺磷,购
于农药市场。
1.2摇 实验设计
盆栽试验地点在南京师范大学植物园。 试验共
设 7个处理,各 6次重复。 处理分别为 CK (空白)、
A (接种二化螟幼虫)、B (1 倍,即白僵菌施用浓度
7.5伊104孢子 / mL)、C (10 倍)、D (100 倍)、E (1000
倍)和 F (化学农药)处理组(除空白处理组外均接
水稻害虫二化螟幼虫),白僵菌处理组每盆喷洒白僵
菌孢子悬液 40 mL,化学农药施用量按说明操作。 试
验用桶高 70 cm,桶口直径 30 cm,每桶放置过筛土
20 kg。 2012 年 5 月 1 日育苗,待幼苗长至 10—15
cm高时将其移秧至新桶中,每桶 4 穴。 整个盆栽试
验期间,视土壤含水量状况不定时灌浇自来水,定期
拔除杂草。 各处理组用 3 m 伊 0.7 m 伊 1.5 m防虫网
遮盖并用竹竿固定。 于 7 月 10 日接种二化螟幼虫
并施用白僵菌孢子悬液和化学农药。
分别在喷施当天,喷施后第 10、30 天和第 60
天,带无菌手套,采用打孔器采集水稻叶片,每个重
复约 5—6g 叶片立即放入无菌样品袋中并进行实
验。 从同一处理的每个重复中各取 1 g 均匀混合并
提取叶际总基因组,各重复的剩余部分去除叶脉后
取 0.5 g单独进行酶活力的测定。
1.3摇 测定项目与方法
1.3.1摇 白僵菌绿色荧光蛋白的引物设计
使用 Primer 5.0 设计引物(eGFP鄄F1 / eGFP鄄R1)
扩增标记白僵菌的绿色荧光蛋白的一段序列,PCR
产物为 289 bp。 上下游引物序列分别是(eGFP鄄F1:
5忆CAGTGCTTCAGCCGCTACCC3忆, eGFP鄄R1: 5忆AGT鄄
TCACCTTGATGCCGTTCTT3忆)。
1.3.2摇 实时定量 PCR
实时定量 PCR 扩增使用 Step OneTM(ABI,USA)
定量 PCR 仪。 荧光定量标准曲线使用梯度稀释的
白僵菌基因组 DNA为模板。 PCR 扩增反应为 25 滋L
体系:2 滋L DNA 模板,上下游引物各 1 滋L,10 滋L
SYBR Premix Ex Taq, ROX 0.4 滋L,H2O 6 滋L。 扩增
反应程序: 94益预变性 5 min;94益 30 s,60益 50 s,
40 个循环。 所有的荧光定量 PCR 反应条件和体系
完全一致。
1.3.3摇 POD、SOD、CAT 3种酶活力测定
水稻叶片的 POD、SOD、CAT 3 种酶活力的测定
使用南京建成公司试剂盒,其活性以每 mg 可溶性蛋
白的催化活力 U表示。
1.3.4摇 叶际微生物的分离及 DNA提取
叶际微生物的分离方法参见文献[25],提取后的
菌体沉淀使用 Ultra CleanTM Soil DNA Isolation 试剂
盒(Mo BIO Laboratories) 提取 DNA,然后用 1%的琼
脂糖凝胶电泳检测。
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1.3.5摇 PCR 扩增和变性梯度凝胶电泳(DGGE)
DNA 的 PCR 扩增条件见表 1,反应体系均为 50
滋L体系: 10 伊 PCR 缓冲液 5滋L,MgCl2 3. 5滋L ( 20
mmol / L),dNTP 2滋L (10 mmol / L),上下游引物各
1滋L ( 10 滋mol / L ), Taq DNA 聚 合 酶 ( REGEN
BIOTEC 公司) 0. 3 滋L ( 1. 5 U), DNA 模板 1 滋L
(15 ng),无菌超纯水 36 滋L。 PCR 产物用 1%的琼
脂糖凝胶检测。 使用 CBS鄄DGGE 电泳系统 ( CBS
Scientific Co.)进行变性梯度凝胶电泳(DGGE),聚丙
烯酰胺凝胶浓度和变性梯度见表 1,电泳缓冲液为
1伊TAE,PCR 产物上样量为 500 ng,60 益,100 V 电
泳 12 h,EB 染色 20 min,UVP 凝胶影像分析系统
拍照。
表 1摇 PCR鄄DGGE条件
Table 1摇 PCR鄄DGGE conditions
模板
Target
引物
Primer
扩增条件
Polymerase chain
reaction conditions
凝胶浓度
Polyacrylmide gel / %
变性梯度
Denaturing
Gradient / %
细菌 Bacteria
518R(5忆鄄ATTACCGCGGCTGCTGG鄄3忆)
338F(5忆鄄CGCCCGCCGCGCGCGGCG
GGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGGA
CTCCTACGGGAGGCAGC鄄3忆)
94益5min;30cycles,
94益45s,60益30s,
72益45s;72益10min
8 35—65
真菌 Fungi
NS1(5忆鄄GTAGTCATATGCTTGTCTC鄄3忆)
GC鄄Fung(5忆鄄CGCCC GCCGCGCCCCGC
GCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCA
TTCCCCGTACCCGTTG鄄3忆)
94益4min;35cycles,
94益30s,55益30s,
72益1min;72益10min
7 20—50
1.4摇 数据处理
实验结果用算术平均数 依标准误表示,应用
SPSS 13.0 软件进行方差分析,(One鄄Way ANOVA)
检验处理间差异显著性,并用 Duncan 法进行多重比
较,当 P<0.05 时,各个处理间存在显著差异。 使用
Excel 2007 进行作图。
DGGE 指纹图谱使用 Gelcompar 域 软件分析。
其中,聚类分析使用 UPGMA (unweighted pair鄄group
method with arithmetic averages) 方法。 用于计算群
落生物多样性的指标有:
(1) Shannon 指数 H =- 移( ni / N) ln(ni / N)
式中,ni 为单一条带的峰面积;N 为所有峰的总
面积。
(2) 条带数量 S,为所在泳道的条带总数目。
2摇 结果与分析
2.1摇 荧光定量 PCR检测白僵菌在水稻叶际的残留
2.1.1摇 白僵菌绿色荧光蛋白特异性引物设计及验证
通过对白僵菌绿色荧光蛋白序列的扩增效果及
特异性验证筛选了一对合适的引物 eGPF鄄F1 (5忆鄄C
AGTGCTTCAGCCGCTACCC 鄄 3忆) / eGFP鄄R1 ( 5忆鄄
AGTTCACCTTGATGCCGTTCTT鄄 3忆)。 从图 1 中可以
看出,使用 eGPF鄄F1 / eGFP鄄R1 进行常规 PCR 反应,
可以得到单一的扩增条带。
图 1摇 使用引物 eGPF鄄F1 / eGFP鄄R1扩增产物的电泳图谱
Fig.1摇 PCR products using primer eGPF鄄F1 / eGFP鄄R1
泳道:1 CK组 0d;2 A组 0d;3 F组 0d;4白僵菌菌株;5 E组 0d;6
D组 0d;7 C组 0d;8 B组 0d;M1, M2为 2000 Marker
2.1.2摇 白僵菌定量 PCR标准曲线制备
荧光定量 PCR 扩增反应使用梯度稀释的白僵
菌基因组 DNA 做为模板,引物为 eGPF鄄F1 / eGFP鄄
R1。 图 2为白僵菌基因组荧光定量标准曲线,横坐
标(x)为模板质量,纵坐标(y)为达到荧光阈值的循
环数量即 Ct值(y= -3.603x+28.351)。 标准曲线的
相关系数(R2>0.99),这表明白僵菌基因组 DNA 质
量在 10-1—103 pg 之间能够很好地线性定量扩增。
同时,将白僵菌基因组 DNA继续稀释至 10-2 pg、10-3
pg、10-4 pg、10-5 pg、10-6 pg,用 1 滋L超纯无菌水作对
照进行扩增,研究该方法的检测极限,1 fg / 滋L 白僵
菌基因组 DNA为模板及 1 滋L超纯无菌水代替 DNA
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模板做为阴性对照均未能扩增,表明该体系的检测
下限为 10 fg / 滋L白僵菌基因组 DNA质量,能够满足
一般检测需要。
图 2摇 白僵菌基因组实时定量 PCR 标准曲线
Fig. 2 摇 Standard curve from real time PCR by plotting the
threshold cycle (Ct) vs the log10 quantity of template DNA ( in
pg) for B. bassiana amplified with the primer eGPF鄄F1 /
eGFP鄄R1
2.1.3摇 水稻叶际白僵菌残留量的跟踪检测
从 CK、A、B、C、D、E、F 总共 7 个处理中分别提
取叶际总 DNA,进行定量 PCR。 在所有的采样时间
点,CK、A、F处理中都没有检测到白僵菌的存在,说
明在实验处理中及后续时期白僵菌并未污染此 3 组
处理,能够更好的进行各处理组之间的比较。 由图 3
可以看出,在分别喷施 1倍、10 倍、100 倍、1000 倍白
僵菌孢子悬液的 B、C、D、E 处理组中,在喷施后的第
0、10、30天内均检测到了白僵菌的存在,而在第 60
天时 4 个处理组中均未检测到白僵菌的存在,说明
白僵菌可以在水稻叶片残留至少达 30 d之久。 其中
1000倍白僵菌处理即 E 处理组叶际白僵菌 DNA 含
量在第 0 天为 log10 2. 93 ( pg DNA / g 叶片),而在
第30天时为 log10 0 . 6 9 ( pg DNA / g叶片 ) ,衰减了
99.42%,而 D、C、B 处理组的叶际白僵菌含量分别衰
减了 97.91%、92.41%、74.30%。 说明了白僵菌喷施
浓度越大,衰减速度越快,因此在喷施时应注意浓度
不用过大,以免造成不必要浪费。
图 3摇 定量 PCR研究水稻叶际白僵菌 DNA 含量变化
Fig.3摇 Population dynamics of B.bassiana in rice phyllosphere
measured by qPCR
B:1倍,即白僵菌施用浓度 7.5伊104孢子 mL-1;C:10 倍;D:100
倍;E:1000倍
2.2摇 白僵菌对水稻酶活力影响
2.2.1摇 白僵菌对水稻超氧化物歧化酶活力影响
超氧化物歧化酶 SOD是目前为止发现唯一以超
氧阴离子自由基为底物的酶,对于维护植物体内动
态平衡起着重要作用[26],具有防御活性氧毒性等功
效。 由图 4可知,超氧化物歧化酶活性在整个周期
中随着时间的延长逐渐降低。 白僵菌处理能提高水
稻超氧化物歧化酶活性,其中以 10—30 d 效果最为
明显,在第 10 天时 D 处理组相比较 CK 提高了
20郾 38%,而 A处理组相比较 CK略有下降,推测二化
螟虫害导致水稻酶活力下降,到成熟期,各处理组超
氧化物歧化酶活力趋于一致。
图 4摇 不同处理对 SOD活性的影响
Fig.4摇 Effect of different treatments on SOD activity
CK:空白对照;A:接种二化螟幼虫;B:1倍,即白僵菌施用浓度 7.5伊104孢子 / mL;C:10倍;D:100倍;E:1000倍;F:化学农药处理组; 处理间
数据比较不同的字母表示在 P<0.05 水平上差异显著
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2.2.2摇 白僵菌对水稻过氧化物酶活力影响
过氧化物酶主要起到酶促降解 H2O2的作用,解
除细胞内有害自由基。 由图 5 可知,过氧化物酶活
性在整个周期中呈现逐渐上升的趋势,到第 60 天时
达到最大值。 白僵菌对过氧化物酶活力影响较小,
在第 10天时,F处理组水稻过氧化物酶活力较高,推
测是由于植物的应激反应所导致。
图 5摇 不同处理对 POD活性的影响
Fig.5摇 Effect of different treatments on POD activity
2.2.3摇 白僵菌对水稻过氧化氢酶活力影响
过氧化氢酶 CAT可以分解 H2O2形成 O2和H2O,
与植物代谢强度及抗逆能力密切相关[27]。 由图 6
可以看出,在整个周期内随着时间延长,过氧化氢酶
活力逐渐下降。 F 和 A 处理组过氧化氢酶活力较
低,推测病虫害及化学农药均会降低过氧化氢酶活
力,其中在第 10 天 时,A 和 F 处理组相比较 CK 分
别下降了 19.55%和 42.70%,化学农药处理导致酶活
力下降幅度更大,在第 30天 时 4个白僵菌处理组过
氧化氢酶活力均提高,其中 C 处理组相比较 CK 提
高了 33.67%,而在第 60天 时,A处理组酶活力仍未
恢复。
图 6摇 不同处理对 CAT活性的影响
Fig.6摇 Effect of different treatments on CAT activity
2.3摇 白僵菌对水稻叶际微生物群落结构的影响
2.3.1摇 水稻叶际细菌 DGGE分析
由图 7和表 2 可以看出,白僵菌对水稻叶际细
菌群落结构影响较小,但聚类分析表明在同一时期
内各处理组聚成一类,说明细菌群落结构随时间具
有一定波动性,而同一时期内各白僵菌处理组之间
细菌群落结构较相似,相比较其他处理组,条带数及
香农指数有所提高。
2.3.2摇 水稻叶际真菌 DGGE分析
由图 8和表 3 可知,真菌的群落结构变化表现
出与细菌相似的特点,即同一时期的各处理组聚成
一簇,而白僵菌处理组群落结构较类似,并且在后期
0896 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 34卷摇
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图 7摇 水稻叶际细菌群落 DGGE指纹图谱聚类分析
Fig.7摇 DGGE cluster analysis (UPGMA) of 16S rRNA profiles
of rice phyllosphere bacterial communities
(0鄄CK、A、B、C、D、E、F):分别指 0 d的 CK、A、B、C、D、E、F处理
组;(10鄄CK、A、B、C、D、E、F):分别指第 10 天的 CK、A、B、C、D、
E、F处理组;(30鄄CK、A、B、C、D、E、F):分别指第 30天的 CK、A、
B、C、D、E、F 处理组;(60鄄CK、A、B、C、D、E、F):分别指第 60 天
的 CK、A、B、C、D、E、F处理组
条带数及香农指数相比较其他处理组有所提高。 A
处理组和 F处理组条带数及香农指数均较小。
图 8摇 水稻叶际真菌群落 DGGE指纹图谱聚类分析
Fig.8摇 DGGE cluster analysis (UPGMA) of 18S rRNA profiles
of rice phyllosphere fungi communities
表 2摇 叶际细菌群落多样性
Table 2摇 Diversity of bacteria in phyllosphere
处理
Treatment
0d
条带数
Band
number
香农指数
Shannon
index
10d
条带数
Band
number
香农指数
Shannon
index
30d
条带数
Band
number
香农指数
Shannon
index
60d
条带数
Band
number
香农指数
Shannon
index
CK 18 2.28 19 2.36 19 2.65 22 2.73
A 18 2.33 19 2.49 17 2.21 14 2.04
B 23 2.75 24 2.76 27 2.94 22 2.72
C 24 2.79 22 2.65 22 2.76 24 2.84
D 21 2.6 22 2.68 23 2.823 25 2.95
E 22 2.56 23 2.72 24 2.98 22 2.81
F 20 2.66 16 1.91 21 2.75 21 2.49
摇 摇 CK:空白对照;A:接种二化螟幼虫;B:1倍,即白僵菌施用浓度 7.5伊104孢子 mL-1;C:10倍;D:100倍;E:1000倍;F:化学农药处理组
表 3摇 叶际真菌群落多样性
Table 3摇 Diversity of fungi in phyllosphere
处理
Treatment
0d
条带数
Band
number
香农指数
Shannon
index
10d
条带数
Band
number
香农指数
Shannon
index
30d
条带数
Band
number
香农指数
Shannon
index
60d
条带数
Band
number
香农指数
Shannon
index
CK 5 1.24 18 2.37 12 1.82 13 2.19
A 8 1.57 6 1.02 9 1.56 12 1.6
B 8 1.62 18 2.23 12 1.96 16 2.38
C 9 1.41 19 2.44 15 2.21 15 2.27
D 5 1.42 17 2.24 14 2.31 13 2.14
E 6 1.12 18 2.24 17 2.32 13 2.24
F 7 1.32 7 1.38 9 1.69 16 2.31
1896摇 23期 摇 摇 摇 杜威摇 等:白僵菌施加对水稻三种抗氧化酶活力及叶际微生物多样性的影响 摇
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3摇 讨论
虽然微生物农药白僵菌应用较广泛,但国内外
目前尚没有关于白僵菌对植物叶际影响的研究。 本
文首次对微生物农药白僵菌在叶际的生态影响做了
较为全面的评价,并首次在同一系统中比较了生物
农药白僵菌与化学农药对植物叶际的不同生态
影响。
3.1摇 白僵菌在环境中的残留
生防菌能否起到稳定、持久的防病效果的重要
因素就是其在植物根际能否有效定殖[28]。 而研究
生防菌在叶际的定殖对于评价其作用效果也至关重
要。 微生物农药在施用后面临着衰减残留情况的检
测问题,传统抗生素标记及放射性同位素标记等技
术手段难以直观、准确区分土著微生物和人工接种
微生物[29],绿色荧光蛋白作为分子标记应用较广,
其对细胞无毒,结构稳定[30],但是荧光表达需要一
定条件,在胁迫、寡营养阶段或特殊生长阶段也会出
现荧光表达较弱的问题。 本文建立了一种使用
SYBR Green I 荧光染料快速检测叶际白僵菌残留的
方法。 SYBR Green I 的特异性主要依靠设计的 PCR
引物的特异性。 根据白僵菌绿色荧光蛋白序列设计
了一对特异性引物 eGFP鄄F1 和 eGFP鄄R1,验证特异
性、灵敏性均较高,结果表明白僵菌可以在水稻叶际
残留至少达 30 d,本研究在试验期间受多次的降水、
大风的气候因素的影响,推测白僵菌能够与水稻由
附生转变为半寄生状态。 殷幼平等研究发现绿色荧
光蛋白标记的枯草芽孢杆菌在柑橘叶际定殖达 42 d
之久[31],然而并未比较不同浓度的生防菌衰减速
率,本文研究发现白僵菌初始喷施浓度越大,其在叶
际的衰减速率越快,其中在第 30 天时 B 处理组白僵
菌残留量是初始量的 25.70%,而 E 处理组白僵菌残
留量是初始量的 0.58%。
3.2摇 白僵菌对水稻抗氧化酶活力研究
SOD、POD、CAT 作为保护酶系统的主要指标,
能够反映植物的生理代谢水平。 而目前国内外针对
植物保护酶系统的影响因素研究主要局限于化学农
药[32]、重金属离子[33鄄34]、内生菌[35]、盐胁迫[36]、矿质
元素[37]等,关于微生物农药对植物保护酶系统的影
响研究较少。 本文研究发现白僵菌处理能够提高水
稻超氧化物歧化酶及过氧化氢酶活力,并且不同浓
度白僵菌处理组之间酶活力相差较小,白僵菌能够
与植物互作,改善植物生长状态,推测一方面白僵菌
可以拮抗植物病原菌、诱导植物抗性[38鄄39]及毒杀水
稻害虫二化螟,另一方面白僵菌可能影响水稻土壤
从而间接改善植物生长条件,然而具体机制目前还
不清楚。 在 A 处理组即接种二化螟处理组中,3 种
保护酶活力均有不同程度下降,推测保护酶活力下
降是由水稻虫害导致的。 在 F处理组即化学农药处
理能够降低水稻过氧化氢酶活力,对其他两种酶活
力影响较小,推测是化学农药引起了植物的应激
反应。
3.3摇 白僵菌对水稻叶际微生物群落结构的影响
总体来看,白僵菌处理并未造成叶际细菌群落
较大波动。 在真菌群落结构中,A、F 处理组条带数
及香农指数均较小,说明水稻病虫害及化学农药对
真菌群落结构有较大影响。 在第 10 天时,化学农药
处理后细菌及真菌多样性均较小,这与荆梦[40]等研
究结果是一致的,推测由于化学农药导致某些抗药
性菌群生长而抑制其他菌群的生长,从而导致叶际
菌群结构较单一。
4摇 结论
本文建立了定量检测植物叶际白僵菌残留的荧
光 PCR 方法,结果表明灵敏性及特异性均较高,白
僵菌可以在水稻叶际残留达 30 d 之久,而白僵菌是
以何种方式与水稻互作尚不清楚,同时白僵菌是否
可以进入水稻叶片内部甚至由叶片迁移到茎、根等
部位也是值得研究的。 另外本文研究了白僵菌对水
稻保护酶活力的影响,而白僵菌是以何种机制提高
水稻保护酶活力还有待阐明。 最后,本文研究了白
僵菌对水稻叶际的微生物群落结构影响,DGGE 聚
类分析结果表明白僵菌处理后水稻叶际细菌、真菌
的条带数和香农指数均有所升高说明白僵菌对水稻
叶际微生物群落结构有一定影响,而白僵菌作用于
水稻后对水稻内生菌的定殖是否影响也是值得研究
的,只有阐明以上问题,才能更好的理解白僵菌的作
用机制,更充分的评价微生物农药白僵菌的生物安
全性。
致谢:西南大学生物技术中心裴炎教授提供绿色荧
光蛋白标记的白僵菌菌种,南京农业大学植物保护
2896 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 34卷摇
http: / / www.ecologica.cn
学院高建芬副教授提供二化螟幼虫,特此致谢。
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