全 文 ：第 35 卷第 18 期
2015年 9月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol.35,No.18
Sep.,2015
http: / / www.ecologica.cn
基金项目:国家自然科学基金项目(31172114, 30800097); 福建省杰出青年科学基金项目(2012J06009)
收稿日期:2014鄄01鄄26; 摇 摇 网络出版日期:2014鄄11鄄19
*通讯作者 Corresponding author.E鄄mail: jyang@ iue.ac.cn
DOI: 10.5846 / stxb201401260195
王丽娜, 余正, 田 野, 张文静, 杨军.基于克隆文库技术分析瘤棘砂壳虫的食物组成.生态学报,2015,35(18):6183鄄6188.
Wang L N, Yu Z, Tian Y, Zhang W J, Yang J.Diet composition of Difflugia tuberspinifera ( testate amoeba) based on a clone library technique.Acta
Ecologica Sinica,2015,35(18):6183鄄6188.
基于克隆文库技术分析瘤棘砂壳虫的食物组成
王丽娜1,4, 余摇 正1,4, 田摇 野1,3, 张文静2, 杨摇 军1,*
1 中国科学院城市环境研究所, 城市环境与健康重点实验室, 水生态健康研究组, 厦门摇 361021
2 厦门大学海洋与地球学院, 厦门摇 361102
3 中国地质大学(武汉)环境学院, 武汉摇 430074
4 中国科学院大学, 北京摇 100049
摘要:瘤棘砂壳虫是东亚特有的原生动物,广泛分布于长江与珠江中下游以及福建地区的湖泊和水库,作为水生态系统的捕食
者,在维持水生态系统的结构与功能方面发挥着重要作用。 利用 18S rRNA基因 PCR扩增和克隆文库测序等分子生物学技术
方法,从基因水平研究瘤棘砂壳虫的食物组成。 结果表明:所获得的 46条序列在 97%相似度水平含有 11类 OTUs(Operational
taxonomic units,操作分类单元),其中包括轮虫 6个,桡足类 5个,说明瘤棘砂壳虫的捕食类群以轮虫和桡足类为主,同时也证明
单细胞生物可以直接以多细胞的后生动物为食。 此外,通过克隆文库测序技术分析原生动物的食物组成比例,不仅是一种方
便、高效、快速,重复性高的方法,同时也为分析原生动物的生态功能提供了一种新的视角。
关键词:18S rRNA基因; 克隆文库; 砂壳虫; 捕食; 原生动物
Diet composition of Difflugia tuberspinifera ( testate amoeba) based on a clone
library technique
WANG Lina1,4, YU Zheng1,4, TIAN Ye1,3, ZHANG Wenjing2, YANG Jun1,*
1 Aquatic EcoHealth Group, Key Laboratory of Urban Environment and Health, Institute of Urban Environment, Chinese Academy of Sciences, Xiamen
361021, China
2 College of Ocean and Earth Sciences, Xiamen University, Xiamen 361102, China
3 School of Environmental Studies, China University of Geosciences (Wuhan), Wuhan 430074, China
4 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
Abstract: Difflugia is a morphologically diverse genus of the free鄄living shelled amoeboid protozoa that are important
components of freshwater ecosystems and play crucial roles in nutrient cycles and energy flow through food webs. Difflugia
tuberspinifera is an endemic species of East Asia and is widely distributed in freshwater lakes and reservoirs in China.
Clearly, this species plays a critical role in maintaining the structure and function of freshwater ecosystems. However, little
is known about its diet composition and predatory behavior at both species and gene levels. This testate amoeba ( D.
tuberspinifera) was first found in the Wujiang River, Guizhou Province, China. Subsequently, more detailed studies on its
morphology and biometry have been done on natural populations from Yangtze River and Pearl River valleys, and Fujian
reservoirs. Recently, Han et al. illustrated that D. tuberspinifera is an active and agile hunting carnivore that can capture
swimming prey including micro鄄particulates, rotifers, and other metazoans. In previous studies, however, the specimen
identifications were done by microscopic examination, which requires a broad and deep taxonomic knowledge and is very
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laborious, time鄄consuming, and somewhat variable because of insufficient taxonomic resolution. In order to facilitate the
identification of diet composition in D. tuberspinifera, an inexpensive, efficient, rapid and easy鄄to handle gene clone library
has been developed for diet detection and analysis. The plankton samples were collected from the Hubian Reservoir in
Xiamen city in September of 2010. Individual cells were isolated using a glass capillary under an inverted microscope and
washed 3—5 times with distilled water before DNA extraction and PCR amplification. The 18S rRNA gene was amplified by
the universal eukaryotic primers, and the purified PCR products were ligated into the pGEM鄄T vector and transformed into
Escherichia coli DH5琢鄄competent cells. In total, 46 plasmids containing target gene fragments were successfully identified
and sequenced. Each sequence was compared with sequences available in the GenBank database using BLAST, and the
closest relatives were identified for diet or food composition analysis. Finally, 11 OTUs (operational taxonomic units) were
identified at 97% sequence similarity level, and they belonged to either Rotifera (52%) or Copepoda (48%). Our results,
combined with existing data, suggested that: 1) the diet composition of Difflugia tuberspinifera is composed of both rotifera
and copepoda species; 2) unicellular protozoa are not only the food of metazoa, but they can also prey on multicellular
micro鄄metazoa; 3) molecular methods are universally applicable, and the SSU rRNA (small subunit ribosomal RNA) gene
clone library is an efficient, rapid, and repeatable approach to study the diet composition of protozoa.
Key Words: 18S rRNA gene; clone library; Difflugia; predation; prozotoa
砂壳虫(Difflugia)广泛分布于世界各地,是淡水生境中丰度和多样性最高的有壳虫原生动物,特别是在
湖泊水库物质循环和能量流动等关键生态过程中发挥重要的作用。 然而,长期以来对有壳虫食性了解极为有
限,并且以往的研究主要限于显微镜观察,认为其主要以藻类和真菌为食物[1]。 瘤棘砂壳虫 (Difflugia
tuberspinifera)是东亚特有的淡水自由生原生动物,首次在中国贵州乌江渡被发现[2],虫体大小 100—120 滋m,
广泛分布于我国长江与珠江中下游以及福建地区的湖泊和水库中[3鄄6]。 近年来,韩博平等[6鄄7]首次报道瘤棘
砂壳虫以摄食水中的微小颗粒及轮虫为主,说明单细胞生物可以捕食多细胞的后生浮游生物。 事实上,原生
动物是经典食物链与微食物网的关键连接点,因此,在维持水生态系统结构、功能等方面具有重要的地位和
意义[8]。
目前国际学者对砂壳虫的研究重点聚焦于形态学、分类学、生态学、系统发育等方面。 杨军等[3, 9]综合运
用现代分类学技术方法对瘤棘砂壳虫进行了系统分类描述,利用 X 射线能谱仪分析淡水瘤棘砂壳虫壳体元
素,发现其壳体化学元素组成介于海洋和土壤有壳虫之间;Wanner 等[10]通过形态计量学方法,揭示了有壳虫
适应不同环境的各种机制;Gomaa等[11]基于 SSU rRNA基因序列在分子水平上进一步确定砂壳虫系统发育地
位。 韩博平等[6]基于显微观察首次发现瘤棘砂壳虫能够捕食轮虫,这些研究结果都为砂壳虫捕食特性的研
究奠定了一定的基础。 近几年,在福建多个水库中发现大量瘤棘砂壳虫,为了更清楚地了解瘤棘砂壳虫的捕
食习性和食物组成,首次尝试将分子生物学技术引入到砂壳虫食物组成的研究中。 本研究采用构建克隆文库
的分子生物学方法分析砂壳虫食物组成。 通过采集样品,分离活体瘤棘砂壳虫,对总 DNA 提取,设计 18S
rRNA基因特异引物,构建克隆文库并进行有效序列的分析,进而分析食物的物种组成。 此方法操作简单,试
验周期短,重复性好,为研究砂壳虫摄食行为特点提供了新的研究手段。
1摇 材料与方法
1.1摇 样品采集
2010年 9月在厦门市湖边水库(24毅30忆N,118毅09忆E)水体表层水平及垂直方向上利用网孔直径为 64 滋m
的浮游生物网拖拽捞取样品,将水样转入 50 mL PVC瓶,并快速送至实验室。 在倒置显微镜下挑取瘤棘砂壳
虫虫体,超纯水清洗体表 3—5次,以避免外源 DNA 的污染。 选取 50 个个体装入 1.5 mL 的无菌离心管中。
置于-20 益保存,以备进行总 DNA提取。
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1.2摇 DNA提取
配制异硫氰酸胍法 DNA提取液[12],将瘤棘砂壳虫转移到含有 100 滋L DNA 提取液的离心管中,轻微震
荡。 混匀后,置于 65 益水浴锅加热 10—30 min,利用无菌枪头破碎虫体。 再加入 100 滋L 异丙醇,震荡混匀,
置于 4益冰箱中沉淀过夜。 次日,取出冰箱中的样品,在 4 益,14000 r / min 条件下离心 20 min,弃上清液。 将
预冷的 250 滋L 70%乙醇加入沉淀物 DNA中,混匀漂洗,在 4 益,14000 r / min条件下离心 5 min,弃上清液。 再
加入 250 滋L无水乙醇洗涤 DNA,在 4 益,14000 r / min条件下离心 5 min,弃上清液。 将沉淀物置于无菌处风
干 1 min,加入适量蒸馏水溶解所提取的 DNA,置于-20 益冰箱中保存备用。
1.3摇 基因的 PCR扩增及纯化
选择 18S rRNA 基 因 通 用 引 物 Euk鄄A ( 5忆鄄AACCTGGTTGATCCTGCCAGT鄄 3忆) 和 Euk鄄B ( 5忆鄄
TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC鄄3忆)为 PCR扩增引物[13]。 PCR反应体系为 50 滋L,包括 5 滋L 10 伊 Ex PCR
缓冲液(10 mmol / L,Mg2+终浓度为 1.5 mmol / L),4 滋L dNTP(10 mmol / L),0.25 滋L Ex Taq 酶(5 U / 滋L),PCR
前后引物各 1 滋L(10 滋mol / L),36.75 滋L ddH2O和 2 滋L DNA模板。 PCR反应条件如下:95 益预变性 4 min;
40个循环为 94 益变性 30 s,54 益退火 30 s,72 益延伸 1.5 min;最后 72 益延伸 10 min。
PCR产物用经 EB 染色的 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。 从凝胶上切下特异性扩增的目的条带,置于无菌
的 1.5 mL Eppendorf管中,利用凝胶回收试剂盒(Wizard 襃 SV Gel and PCR Clean鄄up System)纯化回收 18S
rRNA基因片段。
1.4摇 测序及序列分析
将纯化后的 PCR产物(18S rRNA基因)连接到 pGEM鄄T载体,然后导入大肠杆菌 DH5琢 感受态细胞。 涂
布到含有 50%氨苄青霉素(Ampicillin)的 LB固体培养基上孵育、培养并进行蓝白斑筛选,挑取出白色克隆进
行 PCR检测。 将正确插入目的片段的 50个白色克隆样品进行基因测序分析,应用 DNASTAR软件对测序结
果进行编辑,去除载体序列。 将所获的序列在 NCBI 数据库(http:www.ncbi.nlm.nih.gov / blast)中进行比对,挑
选与其亲缘关系最相近的已知序列以确定其分类归属。 利用 Mothur v.1.22.2 软件分析操作分类单元(OTUs,
Operational taxonomic units),按 97%的相似度进行划分。 基于 OTU结果,计算 Chao1 值、ACE 值[14鄄15],并绘制
稀释曲线。
1.5摇 序列登录号
本研究获得的 18S rRNA基因序列在 GenBank中的登录号为:KF910075—KF910085。
2摇 结果
2.1摇 18S rRNA基因多样性分析
本研究中,PCR扩增获得的 18S rRNA基因片段大小约为 1500 bp。 对挑选的 50 个阳性克隆进行测序分
析,除 4个低质量克隆未成功测序外,共得到 46条序列。
46条基因序列在 97%相似度水平归为 11 类 OTU(图 1)。 多样性指数 Chao1 值为 32,ACE 指数为 74。
其中,OTU1及 OTU2丰度最高,各自包含了 12 条序列,表明 OTU1 及 OTU2 在砂壳虫体内丰度较高(图 2)。
OTU3是 8条序列,OTU4有 7条序列。 其他 7个 OTU均包括 1条序列,相对丰度较低。
2.2摇 食物组成
基于系统发育地位分析表明,所有 OTUs 均可划归为两大类浮游动物:52%的 OTUs 序列属于轮虫
(Rotifera),48%的 OTUs序列是桡足类(Copepoda)的哲水蚤(表 1,图 3)。 其中 6 个 OTUs 属于轮虫,包括 24
条序列;5个 OTUs属于桡足类,包括 22 条序列。 由表 1 可知,轮虫主要种类包括矩形龟甲轮虫(Keratella
quadrata)、对壶状臂尾轮虫(Brachionus urceolaris)、大肚须足轮虫(Euchlanis dilatata)、方块鬼轮虫(Trichotria
tetractis)、萼花臂尾轮虫 ( Brachionus calyciflorus)、剪形巨头轮虫 ( Cephalodella forficula );桡足类包括
Mastigodiaptomus nesus(镖水蚤科一种),拟细真镖水蚤(Eudiaptomus graciloides),Eudiaptomus gracilis(镖水蚤
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科一种),Skistodiaptomus oregonensis(镖水蚤科一种),Leptodiaptomus moorei(镖水蚤科一种)。 以上结果提示,
瘤棘砂壳虫体内出现轮虫及桡足类的 18S rRNA 基因,推测瘤棘砂壳虫不仅以轮虫为食,而且可以捕食桡
足类。
图 1摇 18S rRNA基因序列稀释曲线
Fig.1摇 Rarefaction curves for 18S rRNA gene sequences
图 2摇 18S rRNA基因克隆文库中 OTU0.03等级丰度
摇 Fig. 2 摇 Rank鄄abundance distribution of OTU0.03 based on 18S
rRNA gene clone library
表 1摇 18S rRNA 基因测序条带序列系统发育地位
Table 1摇 Phylogenetic affiliations of 18S rRNA gene sequences from clone library
操作分类单元
Operational taxonomic
units, OTUs
序列登录号
Accession number
分类类群
Taxon
序列最相似物种(序列登录号)
Closest relative (accession number)
相似度 / %
Similarity
1 KF910075 Rotifera Keratella quadrata (DQ297697) 99
2 KF910076 Copepoda Mastigodiaptomus nesus (AY339156) 99
3 KF910077 Rotifera Brachionus urceolaris (DQ089734) 99
4 KF910078 Copepoda Eudiaptomus graciloides (AY339149) 99
5 KF910079 Rotifera Euchlanis dilatata (AY218116) 93
6 KF910080 Copepoda Eudiaptomus gracilis (AY339148) 94
7 KF910081 Copepoda Skistodiaptomus oregonensis (AY339159) 97
8 KF910082 Rotifera Trichotria tetractis (DQ297724) 97
9 KF910083 Rotifera Brachionus calyciflorus (DQ297692) 95
10 KF910084 Copepoda Leptodiaptomus moorei (AY339154) 93
11 KF910085 Rotifera Cephalodella forficula (DQ297693) 95
3摇 讨论
3.1摇 瘤棘砂壳虫的食物组成
基于显微镜观测的研究表明,瘤棘砂壳虫属肉食性动物,会攻击其周围任何微小的生物,尤其是大小相近
的微型生物,主要摄食以轮虫为主的浮游生物,包括胶鞘轮虫、独角聚花轮虫、螺形龟甲轮虫、红多肢轮虫、奇
异六腕轮虫、对棘异尾轮虫,以及无节幼体[6鄄7,16]。 瘤棘砂壳虫的捕食行为主要依赖伪足,伪足可以自由伸
缩[17],并且可以准确判断所要捕食对象的位置。 在广东流溪河水库轮虫中,胶鞘轮虫和独角聚花轮虫容易被
瘤棘砂壳虫摄食,因为它们身体柔软、游泳速度慢;而龟甲轮虫、红多肢轮虫的外壳硬,游泳速度快,不易被瘤
棘砂壳虫捕食[7,16]。 针对不同轮虫物种,瘤棘砂壳虫的捕食方式是不一样的。 如遇到身体柔软的胶鞘轮虫,
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图 3摇 18S rRNA基因克隆文库的物种分类组成(n= 46)
摇 Fig.3 摇 Relative abundance of different taxonomic groups based
on 18S rRNA gene clone library (n= 46)
瘤棘砂壳虫一般会攻击它们的背部或尾部,容易捕食成
功;而对于外壳比较硬的龟甲轮虫,选择先攻击它们的
口部,捕食成功率较低[6,16]。 毫无疑问,我们的结果也
进一步表明,作为单细胞的瘤棘砂壳虫能够捕食多细胞
的后生动物(表 1)。
有趣的是,除了在瘤棘砂壳虫体内检测到轮虫 18S
rRNA基因序列外,还检测到相当比例的桡足类,进而
证明湖边水库瘤棘砂壳虫主要以轮虫及桡足类为食。
本研究检测到瘤棘砂壳虫捕食的轮虫及桡足类种属与
韩博平等[6鄄7,16]学者观察到的物种有所差异,推测这与
不同生境及被捕食物种的丰富度相关。 同时,本研究进
一步补充扩展了瘤棘砂壳虫捕食对象的范围。 由于桡
足类的个体相对于瘤棘砂壳虫要大很多,所以捕食相对
较难。 最近,韩博平等[16]观察到瘤棘砂壳虫可以捕食其周围死亡的桡足类,但关于活体桡足类的捕食尚未见
报道。 不过,本文推测瘤棘砂壳虫能够捕食桡足类幼体,因为桡足类幼体个体相对较小,并且经历的幼体阶段
相对较长。
事实上,瘤棘砂壳虫还会捕食藻类,包括甲藻、丝状藻类等[6]。 但在本研究中没有检测到藻类,这并不代
表瘤棘砂壳虫没有捕食藻类。 究其原因,一方面可能是我们所用的 18S rRNA基因引物具有一定特异性,扩增
序列产生一定的偏好性,导致没有检测到藻类。 另一方面,瘤棘砂壳虫捕食的其他类食物数量不够多,或者已
经消化掉了,低于检测线,因而也没能检测到。 未来的深入研究有必要筛选更合适的 PCR 扩增引物和优化
PCR条件。
表 2摇 显微观察方法与分子技术手段的比较
Table 2摇 Comparison of traditional microscopic method and molecular biology technology
方法
Method
显微观察[6鄄7,16]
Microscopic method[6鄄7,16]
分子方法(本研究)
Molecular method (this study)
物种组成
Species composition
轮虫(胶鞘轮虫、聚花轮虫、龟甲轮虫、多肢轮虫、六
腕轮虫、异尾轮虫);
轮虫(龟甲轮虫、臂尾轮虫、鬼轮虫、须足轮虫、巨头轮
虫);
桡足类(桡足类幼体) 桡足类(哲水蚤镖水蚤科 5种)
优点
Advantages
可直观的观察捕食过程;
能分辨所捕食生物的死活
高效、可获得较高的物种多样性;
快速、实验周期短;
方便、易设置重复试验;
对分类学知识要求不高
缺点
Disadvantages
观察捕食行为耗时长,实验周期长;
需要分类学背景的专业人才;
受半透明壳体的影响,对于体内食物观察困难;
一些不完整的虫体难于进行物种鉴定
一些引物具有偏好性;
不能直观的观察捕食过程;
不能区分所捕食生物的死活
3.2摇 基因克隆文库技术是一个有效的食物组成分析方法
传统的单细胞生物食物组成和捕食行为研究主要是利用显微活体观察技术,在观察时需要具有分类学背
景的专业人才,处理大量样本耗时较长,因此分析周期长[18]。 而近年来兴起的分子生物学技术方法的方便、
高效、快速,弥补了活体观察的这一缺陷。 本研究中,利用 18S rRNA基因序列克隆文库的分子生物学技术手
段,能够发现瘤棘砂壳虫体内含有轮虫及桡足类的基因序列,证明此方法可行可信。 因此,单细胞原生动物体
内 18S rRNA基因的检测可以作为一个有用的工具来快速地分析瘤棘砂壳虫的食物组成。 虽然分子生物学技
术手段能够快速检测食物组成,但不能直观地观测其捕食行为过程,因此要配合显微镜活体观察来共同研究
瘤棘砂壳虫的捕食特征(表 2)。
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为进一步深入全面认知瘤棘砂壳虫的捕食行为特征,揭示其在水生态系统结构、功能等方面的重要作用
和意义,建议后续研究综合显微活体观察与分子生物学方法,达到技术方法上相互补充的效果。
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