全 文 ：小球藻鉴定基因的筛选及高产油微藻的分子鉴定
何 茹 1, 2 ,刘君寒 1 ,王士安 1 ,李福利1＊　
(1.中国科学院青岛生物能源与过程研究所 ,山东青岛 266101;2.中国科学院研究生院 ,北京 100049)
摘要　[目的 ]选择合适的小球藻种属鉴定基因 ,对高产油微藻进行分子鉴定。 [方法 ]从分子鉴定常用的 4条基因[核基因组rDNA的
18SrRNAgene、内转录间隔区(ITS)、内转录间隔区 2(ITS-2)和叶绿体rbcL基因 ]中筛选出最为适用的小球藻鉴定基因 , 并对从自然水
体中分离筛选出的 5株油脂含量在 30%以上的小球藻(Chlorelasp.)进行了分类鉴定。 [结果] ITS序列变异程度高 , 片段长度短 ,序列
长度在种间变异较大 ,而在小球藻种内高度保守 ,且种间距离(0.439 6±0.135 9)远大于种内距离(0.045 7±0.084 3), 适用于小球藻属
内种的鉴定。应用 ITS序列分别将 5株高产油藻鉴定为 1株C.vulgaris、2株C.sorokiniana藻和 2株Chlorelasp.。 [结论]为建立藻类的
鉴定基因库提供了参考。
关键词　产油微藻;分子鉴定;内转录间隔区;18SrRNA基因;遗传距离
中图分类号　S132　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2011)25-15230-03
ScreeningoftheGeneforChlorelaIdentificationandIdentificationofOil-producingMicroalgae
HERuetal　(QingdaoInstituteofBioenergyandBioprocessTechnology, ChineseAcademyofSciences, Qingdao, Shandong266101)
Abstract　[ Objective] TheaimwastoselectsuitablegeneforChlorelaidentificationandtoidentifytheoil-producingmicroalgae.[ Method]
Fourcandidategenesequences, thenucleargenomicrDNAofthe18SrRNAgene, internaltranscribedspacer(ITS), internaltranscribed
spacerⅡ (ITSⅡ)andthechloroplastrbcLgene, wereselectedforChlorelamolecularidentification.Throughthesefourcandidategenes,
thegeneticvariabilityanddistinguishabilitybetweenintra-speciesandinter-specieswasanalyzedtochoosetherightgenesforidentificationof
thehighoil-contentChlorela.Onthisbasis, applicationofthesegenesegmentswereclassifiedandidentifiedforfivefresh-waterisolatedChlo-
rella, whichoil-contentismorethan30%.[ Result] ITSgenewasasuitablegenebecauseofitshighvariationandshortfragmentlength,
meanwhileitsgeneticdistanceintra-species(0.439 6 ±0.135 9)waslargerthaninter-species(0.045 7 ±0.084 3).Itssequencelength
variedbetweendiferentspecieswhereashighlyconservedinthesamespecies.BytheapplicationofITSsequences, respectively, fivehigh
oil-contentstainswereidentifiedasoneC.vulgaris, twostrainsofC.sorokinianaandtwostrainsofalgaeChlorellasp.[ Conclusion] This
studyhadprovidedreferencefortheestablishmentofidentificationgenepoolofChlorella.
Keywords　Oil-producingmicroalgae;Molecularidentification;Internaltranscribedspacers;18SrRNAgene;Geneticdistance
基金项目　中国科学院知识创新工程重要方向性项目(KGCX2-YW-
374-3);山东省科技攻关项目(2008GG20007002)。
作者简介　何茹(1986-),女 ,湖南邵阳人 ,硕士研究生 ,研究方向:微
生物生理学 , E-mail:heru@qibebt.ac.cn。 ＊通讯作者 ,研究
员 ,博士 , 博士生导师 ,从事微生物资源研究 , E-mail:lifl@
qibebt.ac.cn。
收稿日期　 2011-05-18
　　小球藻是一种优良的生物能源原料 ,其分布广泛 、生长
速度快 、环境适应能力强且油脂含量高 [ 1] 。小球藻不仅可进
行自养 ,还可进行异养培养 ,其种类繁多 ,不同种对不同环境
的适应能力相差大 ,如不同小球藻能够存活的生长温度从 26
～42℃不等 [ 2] 。对筛选的藻种进行分类鉴定 ,再根据不同
藻种的特点选择合适的培养条件 ,对于小球藻的培养和油脂
的生产具有重要意义。
传统的藻类种属鉴定以形态学手段为主 ,主要是利用光
学和电子显微镜对微藻细胞的细微结构进行观察描述 。而
小球藻细胞小 、形态多样且细胞随着生理周期有一定的变
化 ,从而使得形态鉴定对从业人员要求很高 [ 3] 。分子生物学
鉴定是现代分类学的重要手段 ,该方法具有快速 、准确 、数据
可共享及易掌握的特点 ,是对微藻形态学鉴定有效的补充和
验证。分子鉴定方法多样 ,如随机引物扩增片段多态性
(RAPD)和简单序列重复区间扩增多态性(ISSR)等方法 ,基
因鉴定是其中一种简单 、快速的鉴定方法 ,广泛应用于物种
鉴定和进化树发生 、进化分析等研究 ,在昆虫 、鸟类 、哺乳动
物和一些植物中得到广泛应用 ,但在藻类中相关研究较少 ,
多集中在硅藻和红藻研究。用于基因分子鉴定的基因片段
种类多 ,细胞色素氧化酶基因 I(CytochromoOxidaseI, CoxI)
在动物分子分类中研究很多 [ 4] ,但并不适用于高等植物和绿
藻的分类研究。核基因组中的核糖核酸小亚基基因(18S
rRNAgene, 18S)、转录间隔序列区(InternalTranscribedSpac-
ers, ITS)和转录间隔序列区 2(InternalTranscribedSpacers2,
ITS-2)是研究的几个热门基因 [ 5-7] ,被广泛应用于药用植物 、
衣藻 、硅藻和栅藻等藻类的分类研究。叶绿体基因核酮糖-
1, 5-二磷酸羧化酶 /加氧酶大亚基基因(LargeSubunitofRib-
ulose-1, 5-bisphosphatecarboxylaseoxygenase, rbcL)被用于植
物和藻类的分类研究 [ 5, 8] 。藻类分子鉴定相对于动物和一些
植物的发展较为缓慢 ,至今尚未找到通用的鉴定基因 ,且无
鉴定标准。为此 ,笔者在借鉴已有的关于高等植物和藻类鉴
定基因研究的基础上 ,选用分子鉴定常用的 4条基因 [5-8] ,
经过系列试验从中选出了 1种或几种最为适用的小球藻鉴
定基因 ,并通过试验分析划分出了种属遗传距离界限 ,旨在
为建立藻类的鉴定基因库提供参考。
1　材料与方法
1.1　材料　试验中所有淡水藻的培养均采用 BG-11培养
基 ,指数生长期的藻种液以 20%的接种量接种 ,培养光照强
度为 10 000 lx,光 、暗周期为 14∶10h。采集对数期的藻细胞 ,
离心 ,冷冻干燥备用。
1.2　方法
1.2.1　高油脂藻种筛选 。将长势优良的藻种以 20%的接种
量接种于柱式反应器(300ml培养基),每组试验设置 3个平
行样品置光照培养箱中同期培养 ,通入的气体为含 3%CO2
的空气 。培养末期 ,收集藻细胞(5 000 r/min, 5min),称重法
提取藻细胞油脂 ,计算油脂含量。称重法:生长进入平稳期后
离心收集藻细胞 ,冷冻干燥称重。称重法提取干细胞油脂 ,气
相色谱分析脂肪酸组分。称重法测定油脂含量:螺旋盖管中加
责任编辑　乔利利　责任校对　卢瑶安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2011, 39(25):15230-15232
干藻粉 50 mg,每个样品 3次重复 ,加入氯仿 4.0 ml、甲醇 2.0
ml,旋紧螺盖 ,蜗旋振荡 10s后置于摇床中 200r/min振荡 12
h。 3 500r/min离心 10min,移上清置锥底离心管中 ,加甲醇
2.0 ml、蒸馏水 3.6ml。 3 500r/min离心 5 min,取下层氯仿层
置于预先称重的新螺旋盖管中 ,氮吹仪吹干(60 ℃, 20 ～ 30
min)后置于真空烘箱中 60 ℃干燥 2.5h,称重记录。
1.2.2　DNA提取。取 30 mg冻干藻粉 ,采用 CTAB法进行
藻细胞基因组 DNA提取。
1.2.3　PCR扩增与电泳 。试验引物(表 1)由上海生工生物
工程技术服务有限公司合成。 PCR反应体系(总体积 50.0
μl)为:模板 DNA 1.0 μl, dNTP(10 mmol/L)1.0 μl,引物
(10.0μmol/L)各 1.0 μl, 10×PCRBufer5.0 μl, TaqPoly-
merase(5 U/μl)0.5 μl,超纯水 40.5 μl。 ITS基因片段的
PCR扩增程序为:95 ℃预变性 5 min;95 ℃变性 30s, 55 ℃退
火 30 s, 72 ℃延伸 45s,共 30个循环;72 ℃延伸 10 min。将
PCR产物在 1.2%琼脂糖凝胶上电泳 ,在凝胶成像仪上观察
结果。ITS-2基因的 PCR扩增条件除退火温度为 56 ℃外 ,其
他与 ITS基因相似。 18SrDNA和 rbcL基因 PCR扩增条件和扩
增程序参照 Nozaki等的方法 ,选择大片段的扩增条件 [ 10] 。
表 1　各基因片段的引物序列
Table1　Primersequencesofeachgenefragment
DNA片段
DNAfragment
引物序列
Primersequences
参考文献
Reference
ITS NS7m:5′-GGCAATAACAGGTCTGT-3′ [ 9]
R1850:5′-CCTCACGGTACTTGTTC- 3′
ITS-2 5.8SR:5′-TCGATGAAGAACGCAGCG- 3′ [ 9]
R1850:5′-CCTCACGGTACTTGTTC- 3′
rbcL rbcL1:5′-ATGGTTCCACAAACAGAAAC-3′ [ 10]
rbcL1421:5′-TTGTCAATAGTATCAAATTC-3′
18SrDNA 18SF:5′-AACCTGGTTATCCTGCCAGT- 3′ [ 11]
18SR:5′-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTACG- 3′
18Sm:5′-ATTGGAGGGCAAGTCTGGTG- 3′
1.2.4　序列分析和分类鉴定 。将测序得到的全部序列片段
用 Chromas-Pro软件进行峰图分析 ,手动删除不可信区段 。
DNAMAN拼接长序列片段 ,并手动检验改错 ,得到完整片
段 。采用 CLUSTAL1.8比对多序列 , BioEdit剪切编辑序列 ,
用 Mega4.0进行距离值计算和系统树构建。结合系统发育
树结果和 BLAS分析结果确定藻株的分类地位。
2　结果与分析
2.1　高产油藻株的筛选　经过柱式反应器扩大通气培养和
油脂含量评价 ,共筛选出 5株高油脂含量的藻株 ,油脂含量
均在 30%以上(表 2)。经形态鉴定 ,初步鉴定这 5株藻为小
球藻 ,但无法确定其确切分类地位 ,因此利用分子生物学方
法对这 5株高产油藻种进行鉴定 ,明确其分类地位。
2.2　小球藻各鉴定片段分析　根据所测得的 5株小球藻的
序列数据 ,结合从 GenBank中下载的 18SrDNA序列 29条 、
ITS序列 39条 、ITS-2序列 36条和 rbcL序列 23条 ,其中包括
C.minutisima藻 1株 , C.sorokiniana藻 9株 , C.vulgaris藻 24株 ,
C.elipsoidea藻 8株 , C.variabilis藻 7株和 C.pyrenoidosa藻 7
株 ,用于小球藻鉴定基因的选择和 5株小球藻的分类鉴定。
　　试验中用到了 18SrRNAgene、ITS和 ITS-2 3段核基因
(图 1)以及 1段叶绿体基因rbcL, 4段序列的设计引物都是
覆盖序列全长 。核基因 18SrRNAgene和 rbcL基因引物从基
表 2　5株高产油藻的来源及油脂含量
Table2　OriginsandoilcontentsoffivestrainsofChlorelagenus
编号
Numbers
采集地
Locations
生境
Habitats
油脂含量
Oil-content∥%
DMY-2-2 山东青岛 污水沟 57.3
XZL-2 山东潍坊 污水沟 57.2
DZL-5-1 山东潍坊 污水沟 41.4
XFZ-1-1 山东青岛 河水　 37.3
XZL-1 山东潍坊 污水沟 30.0
因片段的两端开始 , ITS引物分别位于小球藻核 18SrDNA末
端和 28SrDNA开始端 , ITS-2引物位于 5.8SrDNA末端和
28SrDNA开始端。经过 BioEdit软件对所有序列进行排列处
理后 ,不同种小球藻 18SrDNA的长度变化在 1 634 ～ 1 645
bp, rbcL基因为 1 127 ～ 1 128 bp, ITS基因在 535 ～ 608 bp,
ITS-2基因在 193 ～236bp。 18SrDNA、rbcL、ITS和 ITS-2各片
段长度在种间变化较大 ,尤其是 ITS和 ITS-2,各片段长度在
种内无变化 ,高度保守 。ITS由 5.8S和 2段转录间区序列
ITS1和 ITS2组成 ,其中 ITS1和 ITS2的变异程度较高 ,而
5.8S保守程度相对较高。由于 ITS2存在于 ITS内部 ,且 2段
序列片段小及高变异 ,因此被作为藻类的分类基因。
图 1　核基因序列示意及核基因片段引物位置
Fig.1　Schematicdiagramofthenucleargenesequencesandthe
locationofthenucleargeneprimers
2.3　小球藻各段基因序列的遗传距离　运用序列分析软件
和遗传距离分析软件 Mega4.0,得到了种内平均距离 、种内
最大距离 、种间平均距离和种间遗传距离的统计数据(表
3)。 18SrRNAgene种内遗传距离为 0.002 5±0.001 5,是几
段序列中最小的 ,其最小种间遗传距离为 0.018 3 ±0.015 7,
也较小 ,但种内最大遗传距离和种间遗传距离很大。ITS序
列的种内遗传距离为 0.045 7±0.084 3,其种内最大遗传距
离为 0.059 0±0.114 9,较最小的种间遗传距离 0.422 6±
0.149 0的范围要小 。ITS-2种内遗最小遗传距离为 0.161 1
±0.190 8,较最小种间遗传距离 0.464 2±0.249 0小。 rbcL
基因种内最小遗传距离 0.069 9±0.078 1较种间最小遗传距
离 0.056 4±0.016 4大。
通过对 6个小球藻种的 61株藻株的遗传距离分析 , 18S
rRNAgene和 rbcL种间最小遗传距离和种内最小遗传距离
都很小 ,且种间最小遗传距离大于种内最小遗传距离 ,在进
行小球藻藻种划分时的界限就不是非常明确 ,种内和种间的
距离会发生混淆 ,无法很好地区分不同的小球藻藻种。ITS
和 ITS-2在小球藻各藻种间的种间最小遗传距离和种内最小
遗传距离相差 10倍左右 ,种间的差距远大于种内差距 ,在二
者进行分子鉴定时不会发生界定范围的重叠 ,能够很好地区
分开小球藻不同的种。而 ITS和 ITS-2都是变异程度很高的
转录间隔区 , ITS内包括保守程度高的 5.8SrDNA序列和变
异度高的 ITS-2,相对而言 , ITS保守程度在一定范围内较
ITS-2好 ,用 ITS作为小球藻分子鉴定的基因可信程度高。
1523139卷 25期　　　　　　　　　　　　　　　　何茹等　小球藻鉴定基因的筛选及高产油微藻的分子鉴定
表 3　15株小球藻 ITS序列长度比较
Table3　ComparisonofthelengthofITSsequenceof15strainsofChlorela
基因 Gene 种内遗传距离Intraspecificgeneticdistance
种内最大遗传距离
Maximumintraspecificgeneticdistance
种间遗传距离
Interspecificgeneticdistance
种间最小遗传距离
Minimuminterspecificgeneticdistance
18SrRNAGene 0.002 5±0.001 5 0.062 5±1.248 0 1.298 9±1.137 3 0.018 3±0.015 7
ITS 0.045 7±0.084 3 0.059 0±0.114 9 0.439 6±0.135 9 0.422 6±0.149 0
ITS-2 0.069 2±0.120 3 0.161 1±0.190 8 0.491 8±0.250 5 0.464 2±0.249 8
rbcL 0.040 8±0.051 9 0.069 9±0.078 1 0.073 3±0.015 1 0.056 4±0.016 4
2.4　几株高产油藻的分子鉴定　选择 ITS作为几株高产油
藻株的分子鉴定基因。根据 BLAST结果和 Mega4.0构建的
分子系统树(图 2), DMY-2和 C.vulgaris聚为一枝 ,与 CCAP
藻种库的 211/80号藻株的相似程度达到 100%,可以认为
DMY-2也是 C.vulgaris。来自同一采样地点的 XZL-1和
XZL-2藻株均为 C.sorokiniana, 2株藻的油脂含量相差很大 ,
但在基因序列上无差别。XFZ-1-1和 DZL-5-1和 C.pyrenoid-
osa藻株聚为一枝 ,最小遗传距离为 0.136 7,属于 ITS分析的
种内距离 ,但无法明确是否为 C.pyrenoidosa。因为目前已测
序小球藻 ITS还较少 ,未涵盖全部的小球藻属的不同种 ,所
以进一步确定仍有困难。但随着基因数据库的不断扩大 ,利
用基因测序进行分子鉴定的可行性在不断增大 ,成为形态学
分类的重要补充。
图 2　基于ITS序列数据的高产油藻的系统发育树(MP最大似
然法作图 ,自检值 Boostrap-1 000)
Fig.2　PhylogenetictreeofChlorelawithhighoil-contentbased
onITSsequencedata(MPmaximumlikelihoodmethod,
Boostrap-1 000)
3　结论
ITS由于其长度适中(全长 675 bp左右), 1个反应可测
序完成;引物可设计在 18SrDNA末端和 28SrDNA开始端两
端保守程度很高的区段上 ,引物的通用性高;ITS种间遗传距
离远大于种内遗传距离 ,能够很好地用于小球藻属的分类;
ITS进化速度速率相对较快 ,长度和序列上的变异度高 ,适于
藻种间的分类。筛选到的 5株高产油藻株大多来自于污水
环境 , DMY-2为 C.vulgaris, XZL-1和 XZL-2藻株均为 C.soro-
kiniana,另外 2株 XFZ-1-1和 DZL-5-1为小球藻 ,暂未确定种
名。根据 ITS分类结果 ,可针对具体藻种进行不同的环境因
子等因素的优化 , C.sorokiniana是小球藻属的耐高温种群 ,
可利用 XZL-1和 XZL-2进行高温产油的研究。
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(上接第 15229页)
后将该方法用于国民经济中比较重要的水稻优选问题 ,以说
明该方法的可行性和有效性。该方法的提出 ,一方面丰富了
多属性决策中属性权重确定的问题 ,另一方面为科学合理地
选择水稻品种问题提供了必要的理论支撑。
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