全 文 ：　第 19 卷 第 2 期
2010 年 6 月
淮海工学院学报(自然科学版)
Journa l of Huaihai Institute of Technolo gy(Natu ral Science Edi tion)
Vol.19　No.2
Jun.2010
　　DOI:10.3969/ j.issn.1672-6685.2010.02.021
条斑紫菜HSP90基因实时荧光定量 PCR检测方法的构建＊
周向红a ,阎斌伦a , b ,王　萍a ,易乐飞a , b
(淮海工学院 a.海洋学院;b.江苏省海洋生物技术重点建设实验室 , 江苏 连云港　222005)
摘　要:以管家基因 18S rRNA为内参 ,采用 SYBR G reen I 荧光染料法 ,构建了条斑紫菜 HSP90
基因实时荧光定量 PCR的检测方法 ,为条斑紫菜 HSP90和 18S rRNA 基因筛选出定量引物各 1
对 ,获得的扩增曲线基线平整 、指数区明显 、斜率大且固定。两基因的熔解曲线显示单特异峰 , Tm
分别为 88.5 和 85 ℃。两基因标准曲线的斜率分别为 -3.307 和 -3.308 , 扩增效率都约为
100.6%,C t值在 13 ～ 32范围内有良好的线性关系。构建的实时荧光定量 PCR检测方法灵敏度
高 、特异性强 ,准确可靠 、重复性好 ,检测周期短 ,为进一步研究 HSP90基因在胁迫下的表达差异奠
定了基础。
关键词:条斑紫菜;HSP90基因;18S rRNA 基因;实时荧光定量 PCR;SYBR G reen I
中图分类号:Q75　　　文献标识码:A　　　文章编号:1672-6685(2010)02-0081-04
Establishment of Real-time PCR for HSP90 Gene of
Porphyra yezoensis Udea
ZHOU Xiang-hong a , YAN Bin-luna , b , WANG Pinga , YI Le-feia , b
(a.Schoo l of M arine Science;b.Jiang su Key Lab of Ma rine Bio technolog y , Huaihai Institute of Technolog y ,
Lianyungang 222005 , China)
Abstract:The method of real-time PCR fo r HSP90 gene of Porphy ra yezoensis Udea w as estab-
lished w ith 18S rRNA as the reference gene , using SYBR G reen I.The optimal primers fo r
HSP90 and 18S rRNA gene w ere selected and amplif ication curve had f lat baseline , distinct expo-
nential area , larg e and stable slope.The melting curve o f the tw o genes show ed a sing le peak
wi th a Tm o f 88.5 ℃ and 85 ℃ respectively.Standard curve s slope o f the tw o genes w as
-3.307 and -3.308 respect ively.Amplification ef ficiency of the tw o genes w as 100.6%.The
linear range o f standard curve for relative quantif ication w as 13—32.The real-t ime PCR method
developed in this study is highly sensit ive , specific , accurate , reproducible and quick , which pro-
vides the basis fo r further investigat ion of HSP90 expression under st ress.
Key words:Porphyra yezoensis Udea;HSP90 gene;18S rRNA gene;real-time PCR;SYBRGreen I
　　对热激蛋白(heat shock pro tein , HSP)的分子
生物学研究最早见于 1962年 ,通过观测果蝇(Dro-
sophi la hydei)幼虫唾腺染色体上的涨泡变化 ,
RITOSSA F
[ 1]发现热处理后基因表达发生了显著
改变。进一步研究表明 ,HSP 在整个生物界普遍存
在且高度保守[ 2] 。根据分子质量大小 , HSP 可分为
＊ 收稿日期:2010-05-05;修订日期:2010-05-31
基金项目:江苏省海洋生物技术重点建设实验室开放课题(2008H S004);淮海工学院自然科学基金资助项目(Z2007035)
作者简介:周向红(1977-),女 ,广西钦州人, 淮海工学院海洋学院实验师 ,主要从事生物化学与分子生物学的教学与研究 ,(E-mail)
zx h309309@yah oo.com .cn。
5个主要家族 ,分别是小分子 HSP , HSP60 , HSP70 ,
HSP90和 HSP100[ 3] 。作为细胞内质量控制体系的
重要组分 , HSP 负责新合成蛋白的折叠 、组装 、转运
以及折叠错误和不稳定蛋白的降解[ 3] 。HSP90 是
主要的分子伴侣之一 ,在细胞内含量丰富 ,其主要功
能是调控蛋白折叠 。但与其他 HSP 不同 , HSP90
的大多数底物是信号传递蛋白 ,故在信号传递网络 、
细胞周期调控 、凋亡 、蛋白降解和运输等方面都具有
重要作用[ 3] 。此外 , HSP90在植物免疫 、抗病性及
对胁迫环境的应答中也起着重要作用[ 4-5] 。
条斑紫菜(Porphy ra yezoensis Udea)是红藻
门 、原红藻纲 、红毛菜科的大型海藻 ,在我国北方沿
海大面积栽培 ,具有重要的经济价值[ 6] 。条斑紫菜
叶状体生活在潮间带 ,落潮后藻体暴露在空气中 ,面
临强光照 、失水和高温等各种非生物胁迫 。因此 ,深
入研究条斑紫菜 HSP90在逆境下的表达 ,对正确认
识胁迫信号的传导 、抗逆相关基因的调控以及提高
条斑紫菜抗逆性有重要的理论意义和应用价值。
本研究以管家基因 18S rRNA 为内参 , SYBR
G reen I 作荧光染料 ,构建了条斑紫菜 HSP90 基因
实时荧光定量 PCR(real-time f luorescence quanti-
tative PCR)的检测方法 ,为进一步研究 HSP90 基
因在胁迫下的表达差异奠定了基础 。
1　材料与方法
1.1　主要试剂与仪器
主要试剂有 TRIzol 试剂(Invit rogen), RNase-
Free DNase I(Fermentas), PrimeScript RT reagent
Kit(TaKaRa)和 SYBR Premix Ex TaqIM Ⅱ Kit
(TaKaRa),主要仪器有核酸蛋白定量仪(BioRad)
和实时荧光定量 PCR仪(Bio-Rad)。
1.2　总 RNA分离纯化
首先 ,用 TRIzo l法抽提条斑紫菜总 RNA ,取条
斑紫菜叶状体 ,液氮研磨 ,加 TRIzo l和氯仿混匀 ,离
心后取上清液 ,加异丙醇沉淀 RNA ,以体积分数为
75%的乙醇洗涤 ,无 RNase 水溶解;其次 ,用 DNase
I除去总 RNA 中残留的 DNA ,按 1 μg 总 RNA 加
入 2 U RNase inhibito r 和 1 U DN ase I(RNase-
f ree)的比例配制反应液 ,反应液在 37 ℃水浴 30
min后 ,常规酚/氯仿抽提;最后 ,用适量无 RNase
水溶解总 RNA 。电泳检测总 RNA 的完整性 ,核酸
蛋白定量仪检测总 RNA 的纯度。
1.3　反转录
反转录反应在 10μL 体系中进行 ,反应液中含
有 2 μL 5 ×PrimeScriptTM Buffer , 0.5 μL Prime-
ScriptTM ,RT Enzyme Mix I ,25 pmol Olig o dT Primer ,
50 pmol Random 6 mers ,400 ng 总 RNA 。反应条件
为 37 ℃下反应 15 min , 85 ℃保温 5 s ,终止反应。
1.4　引物设计
根据笔者已经克隆并提交至 GenBank 的条斑
紫菜 HSP90 基 因 的 cDNA 序 列 (索 引 号:
GU301885)和 GenBank 上已有的条斑紫菜管家基
因 18S rRNA 基因序列(索引号:DQ666486)分别设
计 3对和 2对引物(见表 1), 引物由生物工程(上
海)有限公司合成 。
表 1　实时荧光定量 PCR 反应引物
Table 1　Primer sequences for quantitative real-time PCR
基因 引物 序列 扩增片段大小
HSP90基因
H SP90Q-1 正向引物 5′GGCTGGCGGCT CT TT CAC 3′反向引物 5′CGGTCT TGT CCTCATCCTCATC 3′　　　　　　　227 bp
H SP90Q-2 正向引物 5′AGAAGG TGGAGAAGGTGGT TGTG 3′反向引物 5′ACCGTCTTG TCCGTCT TGTCAG 3′　　　　　　　235 bp
H SP90Q-3 正向引物 5′GAGGAGTCGGAGGAGGAGAAG 3′反向引物 5′CCAGGCGGT CAGACACAAC 3′　　　　　　　124 bp
18S rRNA 基因
18S rRNAQ-1 正向引物 5′GTGCTGGCGACTCCTCA TT C 3′反向引物 5′GCCTGCTGCCT TCCT TGG 3′　　　　　　　　　　　　　　　　　153 bp
18S rRNAQ-2 正向引物 5′TGCCAGCACTGCG TT CT TACC 3′反向引物 5′AGCCT TCCGACCCAGGACTA TC 3′　　　　　　　　　　　　　　　　　163 bp
1.5　实时荧光定量 PCR的条件优化
在Bio-Rad的 IQ5 PCR仪上使用SYBR Green
I染料法进行实时荧光定量 PCR反应。25μL 的反
应体系中包含 12.5 μL SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ
(2×)、适量引物和 2μL 反转录产物 。反应条件为
95 ℃预变性 1 m in ,然后进入循环 ,共 40 个循环。
82 淮海工学院学报(自然科学版) 2010 年 6 月
每一次反应都设置阳性对照 、阴性对照组和非模板
对照 ,每个反应设 3个复孔。反应结束后 ,从 55 ℃
缓慢升温到 95 ℃,制备熔解曲线。
按照试剂盒推荐的体系 ,在其他条件不变的情
况下 ,依次改变 PCR循环条件(三步法和两步法)、
引物(HSP90 的 3 对引物和 18S rRNA 的 2 对引
物)、引物浓度(0.1 ～ 0.5 μmol/L)、退火温度(58 ～
63 ℃),通过考察产物特异性 、熔解曲线 、标准曲线
等参数来选择最优条件 。将反转录产物进行 10 倍
系列稀释后作模板 ,在最优条件下制作标准曲线。
2　结果
2.1　总 RNA质量
抽取的总 RNA 电泳后显示出整齐的 rRNA 条
带(见图 1),核酸蛋白定量仪检测结果显示总 RNA
的 A260/ A280 =1.9 ～ 2.1 , A260/ A230 =2.1 ～ 2.3 , 说
明总 RNA片段完整 ,纯度高 ,适合后续试验 。
2.2　实时荧光定量 PCR的条件优化
用两步法和三步法均获得了基本一致的结果 ,
由于两步法较三步法简便 ,故后续试验均采用两步
法。由于 HSP90基因的 HSP90Q-1引物出现了非
特异性扩增(见图 2a ,箭头指示非特异性扩增),
18S rRNA基因的 18S rRNAQ-1 引物在非模板对
照中也出现了非特异性扩增(见图 2b),所以舍弃这
两对引物。 HSP90基因的 HSP90Q-2引物的标准
曲线稍差于 HSP90Q-3 引物。因此后续试验中 ,
HSP90和 18S rRNA 基因分别采用 HSP90Q-3 和
18S rRNAQ-2引物 。引物浓度最终为 0.2 μmol/
L ,退火温度为 61.5 ℃。
2.3　扩增曲线 、熔解曲线和标准曲线
确立实时荧光定量 PCR的最优条件后 ,对
HSP90和 18S rRNA 基因的扩增曲线 、熔解曲线和
标准曲线进行了分析。每对引物在各自基因上都得
到了“S”形扩增曲线(见图 3a),扩增曲线基线平整 、
指数区明显 、斜率大且固定 ,非模板对照呈水平直
线 ,3个复孔的扩增曲线基本重叠 ,说明扩增曲线良
好 。熔解曲线显示 HSP90和 18S rRNA 基因扩增
产物均为单一的特异峰(见图 3b), Tm 分别为 88.5
和 85 ℃,表明无引物二聚体及非特异性产物 ,扩增
产物特异性高 。对 10 倍稀释的系列模板进行定量
PCR反应 ,得出了 HSP90 和 18S rRN A 基因的相
对定量标准曲线(见图 3c);标准曲线回归方程分别
为 y =-3.307x+16.804和 y=-3.308x +6.160 ,
其中 y 为 Ct值 , x 为稀释倍数以 10为底的对数;相
关系数分别为 0.995和 0.997 ,说明直线线性好 ,定
量准确;扩增效率都为 100.6%,C t值在 13 ～ 32范
围内有良好的线性关系 。
图 1　条斑紫菜总 RNA 电泳
Fig.1　Ge1 electrophoresis of total RNA extracted from
Porphyra yezoensis
图 2　引物筛选
Fig.2　Primer screening
83　第 2 期 周向红等:条斑紫菜 HSP90 基因实时荧光定量 PC R检测方法的构建
图 3　HSP90和 18S rRNA基因的扩增结果
Fig.3　Amplification result of HSP90 and 18S rRNA gene
3　讨论
近年来 ,实时荧光定量 PCR被广泛应用于生物
学 、医学和诊断学研究 ,该技术利用荧光分子实时监
测 PCR 反应过程中扩增产物的含量[ 7] 。SYBR
G reen I能非特异性地掺入到双链 DNA ,激发后发
出荧光 ,故可检测任意基因的扩增产物变化 ,但它不
能区分非特异扩增[ 8] 。本文筛选了多对引物并优化
了反应条件 ,以消除非特异性扩增的影响。又由于
不同组织的起始细胞数目 、RNA 提取和扩增效率都
不相同[ 8] ,本文选择了表达相对稳定的 18S rRNA
基因作对照 ,以矫正 HSP90基因的表达量。
同一目的基因的不同引物对定量存在影响。文
献[ 9]的研究显示 ,在相同条件下 2个目的基因分别
通过 4对引物扩增得到的结果经分析均有显著差异
(P<0.05),进而提出实验中应尽量使目的基因和
内参基因引物间扩增效率一致 ,且尽可能接近于 1 ,
特别是当样本间差异表达倍数较小时 ,对引物的选
择更应慎重 。本研究针对条斑紫菜 HSP90 和
18S rRNA基因分别设计了 3对和 2对引物 ,从中筛
选出各 1对引物 ,其扩增效率都约为 100.6%,且接
近于 1 ,故本研究筛选出的 2对引物设计合理 ,适合
条斑紫菜 HSP90基因的相对定量分析。
条斑紫菜 HSP90和 18S rRNA 基因扩增曲线
呈“S”形 ,基线平整 、指数区明显 、斜率大且固定 ,非
模板对照呈水平直线 , 3个复孔的扩增曲线基本重
叠;熔解曲线上仅有单一的特异峰 ,标准曲线的斜率
分别是 -3.307 和 -3.308 ,相关系数为 0.995 和
0.997 ,扩增效率都约为 100.6%,线性关系良好。
因此本研究构建的实时荧光定量 PCR检测方法灵
敏度高 、特异性强 ,准确可靠 、重复性好 ,为进一步研
究 HSP90基因在胁迫下的表达差异奠定了基础。
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(责任编辑:秦海明 ,鲁雪峰)
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