全 文 ：第 34 卷第 21 期
2014年 11月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol.34,No.21
Nov.,2014
http: / / www.ecologica.cn
基金项目:高等学校学科创新引智计划(B12006); 重庆市自然科学基金项目(cst2011jjA80023); 西南大学博士启动基金(SWU112074); 中央高
校基本科研业务费专项(2362014xk09, XDJK2014C150)
收稿日期:2013鄄10鄄24; 摇 摇 修订日期:2014鄄07鄄03
*通讯作者 Corresponding author.E鄄mail: cuigreeny@ 163.com
DOI: 10.5846 / stxb201310242565
崔翠,王利鹃,周清元,谭尊飞,曲存民,张正圣.低温胁迫下烤烟幼苗叶片光合作用和抗氧化能力基因差异表达谱.生态学报,2014,34(21):
6076鄄6089.
Cui C, Wang L J, Zhou Q Y, Tan Z F, Qu C M, Zhang Z S.Expression profiling of genes related to photosynthesis and antioxidant capacity in flue鄄cured
tobacco seedlings subjected to chilling stress.Acta Ecologica Sinica,2014,34(21):6076鄄6089.
低温胁迫下烤烟幼苗叶片光合作用和
抗氧化能力基因差异表达谱
崔摇 翠*,王利鹃,周清元,谭尊飞,曲存民,张正圣
(西南大学, 农学与生物科技学院,重庆摇 400715)
摘要:对低温(5—7 益)胁迫下烤烟“K326冶幼苗叶片光合指标、膜氧化水平及其抗氧化指标进行测定,并利用数字化基因表达
谱技术进行基因差异表达分析。 低温胁迫后烤烟幼苗叶绿素含量、光合能力显著下降,脯氨酸含量、丙二醛含量上升,超氧化物
歧化酶活性、过氧化氢酶活性、抗坏血酸含量和谷胱甘肽含量均显著上升。 低温胁迫后有 2357个基因发生了显著差异表达,其
中 1673个基因表达上调、684个基因表达下调,其分子功能、细胞位置和主要代谢过程均涉及光系统、膜氧化系统和抗氧化系
统。 对涉及到的代谢过程进行分析,结果表明:光合天线蛋白调控基因表达量均显著下降、光合作用的主要调控基因表达量多
数表现为显著下调、而与氧化能力相关的谷胱甘肽代谢差异表达基因大多数显著上调。 基因差异表达谱分析结果和低温胁迫
后叶片光合能力、抗氧化能力生理生态指标测定结果基本一致,为进一步研究低温胁迫对作物的生态影响和研究基因克隆与功
能提供基础。
关键词:烤烟;低温胁迫;数字化基因表达谱;抗氧化能力
Expression profiling of genes related to photosynthesis and antioxidant capacity in
flue鄄cured tobacco seedlings subjected to chilling stress
CUI Cui*, WANG Lijuan, ZHOU Qingyuan, TAN Zunfei, QU Cunmin, ZHANG Zhengsheng
College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, China
Abstract: Tobacco is an important economical leaf crop and complex model organism that is cultivated worldwide. Low
temperature is the one of major factors causing abiotic damage to flue鄄cured seedlings; this damage can affect the growth and
development of flue鄄cured tobacco seedlings and can decrease the yield and quality of flue鄄cured tobacco leaves. Currently,
technologies for cultivating seedlings by using water and oxygen have been widely adopted in southern tobacco鄄cultivating
regions. However, temperature is dependent on climate, which is difficult to control artificially. Low temperatures during the
early spring season limit the culture of strong seedlings in southern tobacco鄄cultivation areas. The objective of this study was
to analyze physiological and ecological adaptations of flue鄄cured tobacco seedlings by measuring parameters related to levels
of photosynthetic, oxidant, and antioxidant factors in the cell membranes of leaves. We also used digital gene expression
profiling technology to analyze the differential expression of genes in flue鄄cured tobacco seedlings after chilling stress.
Seedlings of flue鄄cured tobacco strain K326 were used as experiment materials. Tobacco seedlings with 5—6 true leaves
were divided in two groups. One group of flue鄄cured seedlings was placed in a light incubator at a low temperature range of
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5 益 (night) to 7 益 (day) for 3 days as chilling stress treatment. Seedlings in the other (control) group remained at the
initial temperature and illumination conditions and grew at a normal temperature range of 23 益 (night) to 25 益 (day),
with other similar conditions. After chilling stress for 3 days, total chlorophyll ( Chl), chlorophyll a ( Chl a), and
chlorophyll b (Chl b) contents decreased significantly by 2.88%—6.82%, and the net photosynthetic rate (Pn), stomatal
conductance (Gs), and transpiration (Tr) decreased significantly by 14.14%—68.50% compared with that of seedlings
grown under the favorable temperature. Intercellular CO2 concentration (Ci) showed no obvious changes. In terms of the
membrane oxidant levels of leaves from flue鄄cured tobacco seedlings, proline and malondialdehyde (MDA) contents and
electrolyte permeability increased significantly by 3. 88%—144. 22% compared with that of control seedlings, while the
oxyradical generation rate decreased significantly by 10.66%. Additionally, the membrane antioxidant capacity of flue鄄cured
tobacco seedlings and the activities of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) increased significantly by 6.07%
and 45.64%, respectively, compared with that grown under the favorable temperature, while peroxidase (POD) activity
was significantly reduced. The vitamin C (Vc) and glutathione (GSH) contents increased significantly by 197.36% and
14郾 15%, respectively, compared with that of the control. Under chilling stress conditions, 2357 genes from K326 seedlings
were differentially expressed significantly compared with that of seedlings grown under the favorable temperature. Of these,
1673 genes were upregulated, and 684 genes downregulated. Gene ontology analysis revealed that these differentially
expressed genes were mainly involved in transcription factors, transmembrane transporter proteins, antioxidant systems,
signaling pathways, and others. Gene ontology analysis revealed relationships with the photosystem, photosynthetic
membrane, chloroplast, plastid, cytoplasm, membrane, ribosomes, and more. In particular, 524 differentially expressed
genes were associated with plastid expression. The molecular functions of these differentially expressed genes were mainly
associated with oxidoreductase activity and the antioxidant system of the cell membrane of flue鄄cured seedlings. Differential
expression was also observed for genes involved in biological processes such as response to stress, photosynthesis, light
reaction of photosynthesis, hormone鄄mediated signaling pathways, and more. After analysis of metabolism pathways related
to differential gene expression, our results showed that genes related to photosynthesis鄄antenna proteins and photosynthesis
were downregulated, while genes involved in oxidant capacity, such as Vc, GSH, and proline metabolism, were
upregulated. Leaves of flue鄄cured tobacco seedlings suffered oxidant damage under chilling stress condition, but the
promotion of antioxidant ability by chilling stress had an active protective effect on flue鄄cured tobacco seedlings. Therefore,
flue鄄cured seedlings had some capacity to adapt to chilling stress by adjustment of gene expression, which altered pathways
involved in photosynthetic, oxidant, and antioxidant metabolism to reduce the damage resulting from the stress conditions.
Importantly, the results of gene expression analysis and physiological ecological adaptation were consistent. Hence, it is
possible to analyze ecological adaptation and differential gene expression of crops under stress, and such studies will
facilitate further analysis of gene ontology functions and gene expression relationships.
Key Words: flue鄄cured tobacco; chilling stress; digital gene expression profile; differentially expressed genes
摇 摇 低温冷害是限制农业生产的主要因子之一。 低
温会使叶绿素分解,细胞受到伤害,质膜相对透性增
大[1],叶绿素含量降低[1鄄4]。 叶绿体是低温胁迫的直
接目标[5],低温削弱植物通过光合作用利用光能的
能力[6鄄8]。 植物在一定低温范围内通过提高保护酶
含量来维持体内自由基产生与清除间的动态平衡。
若低温胁迫严重,就会导致自由基含量增高,造成膜
脂过氧化,丙二醛含量上升,细胞膜系统受到伤
害[9]。 温度逆境也诱导植物本身具有的抗氧化物
质,如过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷
胱甘肽及抗坏血酸等含量上升来抵御逆境
伤害[1,10]。
生物对各种生物、理化及致病因子的应答,本质
上都是基因差异表达的结果。 比较同一类细胞或不
同类细胞在不同生理状态或生长发育阶段下的基因
表达差异,对研究生物生长发育调控及代谢机制具
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有重要意义[11]。 近年来,利用 mRNA 差异显示技术
和基因芯片技术等研究逆境对作物生长发育的影响
取得了重要进展,对作物逆境生理和遗传育种研究
发挥了积极作用[12鄄16]。 高通量测序的数字化基因表
达谱(Digital gene expression profile, DGE)技术是新
发展起来的分析生物转录组基因表达的方法, 能更
加真实、全面地评价细胞中全部基因的表达情况,也
能够检测未知基因的表达,是发现新基因的一种有
效方法[17鄄18]。 在转录水平上对外界非生物胁迫下植
物应答机制的研究主要集中在拟南芥、水稻等植物
上,胁迫类型以干旱、冷害、盐胁迫等为主[19鄄23]。 关
于烟草在低温胁迫下基因的特异表达研究较少,本
研究模拟南方烟区“倒春寒冶,研究低温胁迫对烤烟
幼苗光合能力、膜氧化及抗氧化能力的影响,再通过
高通量的数字化基因表达谱技术,分析低温胁迫下
烤烟幼苗抗寒相关基因的差异表达谱,寻找低温胁
迫后与烟草光合作用、抗氧化能力有关的功能基因,
为深入分析烟草低温胁迫伤害机理、挖掘抗寒相关
基因,提高烟草适应性栽培等方面提供理论指导。
1摇 材料与方法
1.1摇 材料培养与处理
试验材料为生产上大面积栽培的 Msk326
(K326),由云南烟草科学研究所选育。 选取大小一
致且饱满的烤烟种子浸种催芽出苗后,分别移栽于
装有营养土的塑料钵内,在 3 叶期选取大小基本一
致烟苗,每钵定苗 3 株,置于光照培养箱中培养生
长。 培养条件:温度为 23—25 益;光照强度为 6000
lx,每日光照 12 h。 烟苗长至 5—6 片真叶时,5—
7 益低温胁迫处理 3 d(标记为 B),常温 23—25 益培
养为对照(标记为 A)。 取其相同部位叶片进行 RNA
提取和相关生理指标测定。
总 RNA提取试剂盒为 WASON(RNAex Reagent
System 郁)试剂盒,上海华舜生物工程有限公司生
产,其它均采用国产分析纯试剂。
1.2摇 试验方法
1.2.1摇 生理生化指标测定
取处理(B)和对照(A)叶片,参考崔翠方法[24],
分别测定总叶绿素 Chl 含量,Chl a 及 Chl b 含量,
Pn,Gs, Tr, Ci,电解质渗透率, Pro 及 MDA 含量,
POD、CAT 和 SOD 活性,GSH 及 Vc 含量等生理指
标。 每处理 4 次重复,测定数据利用 Micorsoft excel
软件进行处理,利用 DPS 统计软件进行差异显著性
检验。
1.2.2摇 低温胁迫后烤烟幼苗叶片基因差异表达谱的
分析
RNA提取方法参考试剂盒操作手册进行,分别
取对照(A)和处理(B)叶片混合成两个样品池,从两
个样品池中各取混合烟叶叶片组织 0.5 g 左右,提取
6 滋g总 RNA,-78 益保存。 测序由深圳华大基因科
技有限公司承担。 采用边合成边测序法(Sequencing
by synthesis,SBS)测序[25]。 测序所得原始图像数据
经 base calling 转化为序列数据。 对测序得到的原始
标签去除 3忆adaptor 序列、低质量序列(含未知碱基)
以及长度过小或过大,拷贝数为 1 的 tag,确定 Clean
tag。 对初步筛选获得的 Clean tags 进行标准化处
理[26],统计不同 tag 的分布特征,分析测序饱和度。
将 Clean tags 与基因序列进行比对,确定 Clean tag 代
表的基因。 通过 tags 统计相应基因的表达量。
从 NCBI 网站检索 mRNA Unigene 序列上所有
CATG位点,生成 CATG+17碱基的参考标签数据库。
将全部 clean tags与参考标签数据库比对,允许最多
1个碱基错配,对其中唯一比对到 1 个基因的标签
(Unambiguous tags)进行基因注释,统计每个基因对
应的原始的 clean tag 数目,然后对原始 clean tag 数
做标准化处理,获得标准化的基因表达量,衡量基因
的表达水平。 标准化的方法为:每个基因包含的原
始 clean tag 数 /该 样 本 中 总 clean tag 数 伊
1000000[26]。 参 照 Audic S. 等 发 表 在 Genome
Research 上的数字化基因表达谱差异基因检测
方法[17]。
参考李余良等方法[15]把所有差异表达基因向
GO(Gene ontology)数据库(http: / / www.genetntology.
org / )的各个项目映射,找出与整个 Tag库背景相比,
在差异表达基因中显著富集的 GO 条目和显著性富
集的 Pathway,分析其中与光合及抗氧化能力相关的
差异表达基因。
2摇 结果与分析
2.1摇 低温胁迫处理对烤烟幼苗叶片部分光合能力
和抗氧化指标的影响
叶绿素与光合作用密切相关,同时也是衡量植
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物抗寒力高低的一项重要指标。 结果如表 1 所示,
低温处理 3 d后的叶绿素含量,无论是叶绿素 a (Chl
a)还是叶绿素 b (Chl b)含量均显著下降,说明低温
胁迫严重阻碍了叶绿素合成;低温处理后烤烟叶片
光合能力降低,低温导致净光合速率、气孔导度、蒸
腾速率显著下降。 氧自由基的积累对细胞存在着巨
大伤害,处理 3 d后烤烟幼苗叶片电解质渗透率、脯
氨酸含量及丙二醛含量均显著上升,说明低温胁迫
已对烤烟幼苗叶片细胞膜造成一定伤害,但其氧自
由基生成速率(形成速率)显著下降;另外,膜保护酶
中 CAT及 SOD活性显著上升,而 POD 活性则显著
下降;抗氧化物质 Vc 和 GSH 含量均显著上升。 从
结果来看,低温胁迫 3 d后,K326幼苗叶片光合能力
下降,细胞膜氧化,但其自身抗氧化能力显著提升。
低温处理 3d后烤烟 K326 幼苗在光合能力、膜氧化
及抗氧化能力方面均发生显著变化。
表 1摇 低温胁迫后烤烟幼苗叶片部分生理指标
Table 1摇 Some physiological parameters of leaves of tobacco seedling under chilling stress
主要生理生化指标
The physiological and biochemical parameters
对照
CK
处理
treatment
增幅 / %
range of increasing
光合能力 Photosynthetic capacity
叶绿素含量 Chlorophyll contents / (mg / g) 0.74 0.71 -4.05*
叶绿素 a 含量 Chla contents / (mg / g) 0.52 0.51 -2.88*
叶绿素 b 含量 Chlb contents / (mg / g) 0.22 0.21 -6.82*
净光合速率 Pn / (滋mol m-2 s-1) 2.02 0.64 -68.50*
叶片气孔导度 Gs / (mmol m-2 s-1) 0.05 0.04 -20.91*
胞间二氧化碳浓度 Ci / (滋mol mol-1) 329.59 329.10 -0.15
蒸腾速率 Tr / (mmol m-2 s-1) 1.52 1.30 -14.14*
膜氧化及抗氧化 Membrane oxidation and antioxidant
脯氨酸含量 Proline content / (mg g-1 min-1) 21.03 51.35 144.22*
丙二醛 MDA content / (滋mol / g) 5.03 5.23 3.88*
电解质渗透率 Electrolyte permeability / % 0.39 0.44 12.82*
氧自由基生成速率 Oxyradical Generation rate / (nmol mg-1 min-1) 3.47 3.10 -10.66*
SOD活性 SOD content / (U g-1 min-1) 60.42 64.09 6.07*
CAT活性 CAT content / (U g-1 min-1) 2.41 3.51 45.64*
POD活性 POD content / (吟470 g-1 min-1) 5.15 4.90 -4.95*
Vc含量 Vc content / (mg / 100g 56.90 169.20 197.36*
GSH含量 GSH content / (滋g / g) 127.26 145.27 14.15*
摇 摇 *表示差异显著(P<0.05)
2.2摇 基因差异表达谱分析
2.2.1摇 RNA质量检测和测序质量评估
分别提取低温胁迫(B)及常温培养(A)的烤烟
幼苗叶片的总 RNA,样品经 NANODrop 2000C 核酸
检测仪检测,OD260 / OD280 均在 1.8—2.2 范围内,
纯度较高。 按照检测的浓度,将相同处理的总 RNA
等量混合。 用 DNase I 降解基因组 DNA,电泳显示
RNA均保持完整性。 总 RNA 用电泳检测表明,28S
rRNA和 18S rRNA条带清晰可见,无拖带现象,说明
RNA完整性较好,可满足实验要求。
测序得到对照样品 A 和处理样品 B 原始序列数
据,经去除杂质后得到高质量 tag(Clean tag)分别有
3490430条和 3506495 条,占总 tag 数的 95. 91%和
94.69%;仅有 5%左右的 tag 拷贝数小于 2 或只有接
头序列。 通过测序分析,最终得到的 clean tag 的数
量均达到总测序量 90%以上,说明样品制备和测序
质量良好。 对 2个样品 Clean tag拷贝数分布进行分
析,显示拷贝数大于 100 的高表达 Tags 在对照和处
理中分别占 63.79%和 55.50%,在数量上占绝对优
势; 拷贝数小于 5的低表达 Tags虽然在总拷贝数中
分别只占 5.94%和 7.24%,但是在种类上非常丰富,
均达到 57%以上,从整体上评估测序数据正常。
从 NCBI网站上(http: / / www.ncbi.nlm.nih.gov / )
下载和烟草相关的参考基因有 24432 条,参考 tag 有
74261 条。 通过软件检索 Unigene 上所有 CATG 位
点,生成 CATG+17 碱基的参考标签数据库,其中参
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考基因中有 CATG 位点的基因有 22263 个,唯一的
参考标签有 72259个。 将 clean tags分别与参考标签
数据库比对,并统计每个基因对应 clean tag 的数目。
对照(A)一个 tag完全比对上一个基因的标签(允许
1个碱基错配)数目为 1066364,占总数的 30.55%,
种类为 16983种,占总数的 13.47%;而处理(B)一个
tag完全比对上一个基因的标签(允许 1 个碱基错
配)数目为 889559,占总数的 25.37%,种类为 18619,
占总数的 12.03%。
2.2.2摇 低温胁迫后烤烟幼苗叶片基因表达谱分析
经过 Unigene标签库进行基因注释后,通过基因
比对,设定 FDR臆0.001[25],且倍数差异在 2 倍以上
(∣ log2 ratio ∣逸1)作为阈值来分析判断基因在 2
个温度状态下是否差异表达,筛选出差异表达基因。
低温胁迫后(处理 B)与对照 A 相比较(图 1),有
2357个基因发生了显著的差异表达,其中有 1673 个
基因表达上调,log2 ratio 值大于 10 的有 62 个,5.00
— 9.99之间的有 185 个,1.00 — 4.99 之间有 1426
个;684个基因表达下调,log2 ratio 值小于 -10 的有
11个, - 9. 99— - 5. 00 之间的有 51 个, - 4. 99—
-1郾 00之间的有 622个。
图 1摇 低温胁迫下烤烟幼苗差异表达基因
Fig.1摇 Differentially expressed genes(DEGs)of leaves of tobacco
seedling under chilling stress
通过 GO 功能富集分析 ( Gene ontology,简称
GO),对差异表达显著的基因进行功能分类注释(图
2)。 图 2结果表明,从差异表达基因所处的细胞位
置来看,低温胁迫后烤烟幼苗与对照烟苗发生显著
差 异 表 达 的 基 因 主 要 集 中 在 光 合 系 统
(Photosystem)、光合膜 ( Photosynthetic Membrane)、
类囊体(Thylakoid Part)、叶绿体(Chloroplast)、质体
( Plastid Part )、 细 胞 质 ( Cell Plastid )、 细 胞 膜
(Membrane)等位置,其中与细胞质有关基因发生差
异表达最为显著,有 524个基因发生差异表达,占总
差异表达基因的 45.1%;与生物膜有关的差异表达
基因达到 420个,占总差异表达基因的 36.1%;细胞
器部分,差异表达基因达到 358 个,占总差异表达基
因的 30.8%;此外,质体及细胞内细胞器部分等位置
差异表达基因亦均达到 27%以上。 从分子功能分析
结果看,低温胁迫导致烤烟幼苗基因的氧化还原能
力、跨膜运输能力、结构分子活力发生显著改变。 其
中与氧化还原能力相关基因差异最为显著,差异表
达基因达到 196个,占总差异表达基因的 16.3%;与
跨膜运输能力相关的差异表达基因为 104 个,占总
差异表达基因的 8.6%;在结构分子活力方面,差异
表达基因达到 74 个,占总差异表达基因的 6. 1%。
发生显著差异表达的生物过程主要集中在胁迫响
应、代谢物质及能源的初始反应、光合及光反应,对
激素刺激的细胞响应、激素调节的信号途径等方面。
其中胁迫刺激响应的生物过程差异最为显著,差异
表达基因达到 426 个,占总差异表达基因的 36.3%;
与温度胁迫响应相关差异表达基因为 223 个,占总
差异表达基因的 19.0%;与先导代谢物及能源相关
差异表达基因 74 个,占总差异表达基因的 6. 3%。
因此,从差异基因所处的位置、分子功能和影响的生
物过程来看,调控烤烟幼苗光合作用和抗氧化能力
的基因在低温胁迫后发生了较大的差异表达,为进
一步分析提供了基础。
2.2.3摇 低温胁迫对烤烟幼苗叶片光合能力的影响
在生物体内,不同基因相互协调行使其生物学
功能,基于 Pathway的分析有助于进一步了解基因的
生物学功能。 KEGG 是有关 Pathway 的主要公共数
据库[27],以 KEGG Pathway 为单位,应用超几何检
验,进行 Pathway 显著性富集分析,在 Qvalue臆0.05
时,低温对光合天线蛋白(捕光色素蛋白复合体,
light鄄harvesting chlorophyll protein complex, 简 写
LHC)和光合能力影响差异显著。 参照 Kanehisa
laboratories的光合作用天线蛋白示意图 3 (a),标记
显著差异基因于图 3(b),并将对应的差异表达基因
列于表 2。 从图 3 ( b ) 和表 2 来看,光系统玉
( photosystem 玉, 简 写 PS 玉 ) 和 光 系 统 域
(photosystem 域,简写 PS域)中部分捕光叶绿素 a / b
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图 2摇 低温胁迫下烤烟幼苗叶片表达基因的功能分类
Fig.2摇 Classification on functional of differentially expressed genes of leaves of tobacco seedling under chilling stress
图 3摇 KEGG数据库中光合作用鄄天线蛋白示意图(a); 低温胁迫下烤烟幼苗与光合天线蛋白相关差异表达基因(b)
Fig.3 摇 The skechmap of antenna proteins related photosynthesis in KEGG database ( a ); Differential expression genes related
photosynthesis鄄antenna proteins of tobacco seedling under chilling stress(b)
绿色方框代表表达基因下调
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色素天线蛋白 ( Lhca1、Lhca2、Lhca3、Lhca4、Lhca5、
Lhcb1、Lhcb2、Lhcb3、Lhcb4、Lhcb5)等均在低温胁迫
下发生显著下调。 说明低温胁迫导致烤烟幼苗对光
电子的捕获能力下降。
表 2摇 与光合作用鄄天线蛋白相关的差异表达基因相关信息
Table 2摇 Information of differential expression genes related to photosynthesis鄄antenna proteins
基因登 ID gene ID log2 ratio 假定功能 Putative function 蛋白 Protein
CAA45523.1 -3.85 photosystem I light鄄harvesting chlorophyll a / b鄄binding protein Lhca1
AAA34140.1 -3.14 chlorophyll a / b鄄binding protein Lhca1
P10708.1 | CB12_SOLLC -3.74 chlorophyll a鄄b binding protein 7, chloroplastic Lhca2
226872 | prf | | 1609235A -2.63 chlorophyll a / b binding protein Lhca3
CAK24966.1 -4.9 chlorophyll a / b binding protein Lhca4
XP_002284724.1 -3.41 predicted: hypothetical protein Lhca5
XP_002893588.1 -3.93 hypothetical protein ARALYDRAFT_473203 Lhcb1
P27495.1 | CB24_TOBAC -3.52 chlorophyll a鄄b binding protein 40, chloroplastic Lhcb1
P27493.1 | CB22_TOBAC -3.72 chlorophyll a鄄b binding protein 21, chloroplastic Lhcb1
P27492.1 | CB21_TOBAC -4.03 chlorophyll a鄄b binding protein 16, chloroplastic Lhcb1
P07369.1 | CB2G_SOLLC -4.69 chlorophyll a鄄b binding protein 3C, chloroplastic Lhcb1
P27494.1 | CB23_TOBAC -4.45 chlorophyll a鄄b binding protein 36, chloroplastic Lhcb2
ABG73416.1 -2.91 chloroplast pigment鄄binding protein CP24 Lhcb2
AAO62942.1 -3.78 chlorophyll a / b binding protein Lhcb2
AAO62942.1 -3.47 chlorophyll a / b binding protein Lhcb2
P27489.1 | CB23_SOLLC -4.16 chlorophyll a鄄b binding protein 13, chloroplastic Lhcb3
ABG73415.1 -4.17 chloroplast pigment鄄binding protein CP29 Lhcb4
ABG73417.1 -3.47 chloroplast pigment鄄binding protein CP26 Lhcb5
ABG73416.1 -3.94 chloroplast pigment鄄binding protein CP24 Lhcb6
摇 摇 参照 Kanehisa laboratories 的光合作用示意图 4
(a),将差异表达基因分别标记在图 4(b),并将对应
基因列于表 3。 表 3结果表明,低温胁迫后烤烟幼苗
与光合作用有关的差异表达基因有 35 个,其中 11
个基因表达上调,24个基因表达下调。 从图 4(b)和
表 3来看,在 PS域上,上调表达的基因主要有影响
PS域中核心编码蛋白 CP47 及分子量为 44kDa、
22kDa等蛋白质相关的基因,这些基因主要控制光
合作用中叶绿体类囊体上 PsbC、PsbB、PsbS 和 PsbZ
等蛋白;在下调表达的基因中,部分调节 PS域中水
裂解酶、水氧化蛋白及分子量为 10kDa 的多肽等相
关基因表达下调,导致 PS域中 6 个核心编码蛋白
(PsbO、PsbP、PsbQ、PsbR、PsbW和 PsbY)表达下调;
下调表达基因部分降低 PS玉亚基(PS玉鄄D1、PS玉鄄
H、芋)的前体及 PS玉反应中心亚基(域、IX A、X
psaK、XI、XIB)的生成,因此,导致 PS玉中有 9 个核
心编码蛋白 ( PsaD、PsaE、PsbF、 PsaG、PsaH、PsaK、
PsbL、PsaO和 PsaN)相关基因均在转录表达水平上
显著下调。 细胞色素 b / f 复合物 (Cytochrome b6鄄f
complex) 是类囊体膜上可分离出来的多亚基膜蛋
白。 在本研究中,控制光合电子传递的细胞色素 b6 /
f复合物的部分基因 Cytb6发生了上调表达(PetB 蛋
白表达上调)、与光合电子传递链有关的蛋白 PetF、
PetH上调,而 PetE 蛋白下调。 此外,ATP 合成酶复
合体有关的基因 c蛋白基因上调,b蛋白基因下调及
ATP 合成酶(如 ATP 合酶 啄 链,ATP 合酶 c 链)发生
上调表达。 总之,在光合作用中下调表达的 24 个基
因中,涉及到光合作用的原初反应、光合电子链的传
递、光合磷酸化、光合碳同化等主要的代谢通路;部
分基因的上调表达,也提高了烤烟幼苗对低温胁迫
的适应。
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图 4摇 KEGG数据库中光合作用示意图(a);低温胁迫下烤烟幼苗与光合作用相关的差异表达基因(b)
Fig.4摇 The skechmap of photosynthesis in KEGG database( a); Differential expression genes related photosynthesis of tobacco seedling
under chilling stress(b)
红色方框表示基因上调
表 3摇 低温胁迫烤烟幼苗与光合作用差异表达基因的相关信息
Table 3摇 Information of differential expression genes related to photosynthesis of tobacco seedling under chilling stress
基因登 ID gene ID log2 ratio 假定功能 Putative function 图中位置 Position
O04397.1 | FENR2_TOBAC 1.109 ferredoxin鄄NADP reductase, root鄄type isozyme,chloroplastic 1.18.1.2
XP_002271630.1 -1.1 predicted: hypothetical protein 3.6.3.14 / b
BAH11228.1 2.725 ATP synthase CF0 C chain 3.6.3.14 / c
XP_002523293.1 2.194 ATP synthase delta chain, putative 3.6.3.14 / DeltA
P32980.1 | ATPD_TOBAC -1.9 ATP synthase delta chain, chloroplastic 3.6.3.14 / DeltA
YP_001936513.1 2.333 photosystem II 44 kDa protein PsbC
ADD30625.1 11.42 photosystem II CP47 chlorophyll apoprotein PscB
AAP03871.1 -3.54 oxygen evolving complex 33 kDa photosystem II protein PsbO
CAA45699.1 -4.42 23 kDa polypeptide of water鄄oxidizing complex ofphotosystem II PsbP
CAA44292.1 -4.31 23鄄kDa ploypeptide of photosystem II oxygen鄄evolving complex PsbP
P18212.2 | PSBP2_TOBAC -2.43 oxygen鄄evolving enhancer protein 2鄄2, chloroplastic; PsbP
XP_002279556.1 -1.38 predicted: hypothetical protein PsbP
BAD97359.1 -3.33 PsbQ PsbQ
AAU03361.1 -2.65 photosystem II oxygen-evolving complex protein 3 PsbQ
Q40519.1 | PSBR_TOBAC -1.78 photosystem II 10 kDa polypeptide, chloroplastic; S PsbR
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续表
基因登 ID gene ID log2 ratio 假定功能 Putative function 图中位置 Position
Q9SMB4.1 | PSBS_TOBAC 1.039 recName: Full
=Photosystem II 22 kDa
protein, chloroplastic PsbS
ACU13646.1 -3.49 unknown PsbW
XP_002285325.1 -2.02 predicted: hypothetical protein PsbY
YP_001109497.1 3.512 hypothetical protein Poptr_cp018 PsbZ
BAA02871.1 -3.74 PS玉鄄D1 precursor PsaD
P29302.1 | PSAD_NICSY -2.64 photosystem 玉 reaction center subunit 域, chloroplastic; PsaD
Q41228.1 | PSAEA_NICSY -3.43 photosystem 玉 reaction center subunit chloroplastic; PsaE
Q41229.1 | PSAEB_NICSY -2.71 photosystem 玉 reaction center subunit 郁 B, chloroplastic PsaE
AAP03872.1 -4.11 putative photosystem 玉 subunit 芋 precursor PsaF
CBI39855.3 -2.2 unnamed protein product PsaG
BAA04634.1 -3.62 PS玉鄄H precursor PsaH
AAP03873.1 -3.15 photosystem I reaction center subunit X psaK PsaK
AAO85557.1 -2.87 photosystem I subunit 欲 PsaL
ACZ72945.1 -3 photosystem I reaction center subunit PsaN
CAB75430.1 -5.3 putative 16kDa membrane protein PsaO
P06247.2 | CYB6_TOBAC 4.362 cytochrome b6 PetB
ACV32157.1 -2.64 chloroplast plastocyanin precursor petE
ACU15698.1 5.601 unknown PetF
XP_002275771.1 1.1 predicted: hypothetical protein isoform 2 PetF
O04397.1 | FENR2_TOBAC 1.1 ferredoxin鄄NADP reductase, root鄄type isozyme,chloroplastic PetH
2.2.4摇 低温胁迫对烤烟幼苗叶片抗氧化能力的影响
5—7 益低温胁迫后 K326 烤烟幼苗代谢通路
中,谷胱甘肽代谢途径是基因显著差异表达显著富
集的最主要生化代谢途径之一。 结合 KEGG数据库
中谷胱甘肽代谢图将差异基因标注在图 5,并将相关
基因信息列于表 4。 表 4结果表明,低温诱导烤烟幼
苗谷胱甘肽代谢过程差异表达基因共有 26 个,其中
上调表达的基因有 23 个,3 个基因下调表达。 上调
表达的基因主要是与谷胱甘肽鄄s鄄转移酶(GSTs)、抗
坏血酸过氧化物酶、磷脂过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧
化物酶、6鄄磷酸葡萄糖酸盐脱氢酶等酶蛋白有关的
基因。 其中,与谷胱甘肽 S鄄转移酶(GST)相关的基
因有 13 个发生了上调表达,占总上调表达基因的
50.00%;谷胱甘肽二硫化物和谷胱甘肽之间的代谢
过程中差异基因 8 个,占总差异基因的 29.63%,其
中,APIC 基因 (基因登录号为 P46440. 1 | GSTF2 _
TOBAC)上调表达最显著,较对照上升近 1000 倍,C鄄
7(基因登录号为 CAA45741. 1)上调表达达到 500
倍,均在清除细胞内活性氧及保护细胞抵御活性亲
电物质时起重要作用。
表 4摇 低温胁迫烤烟幼苗谷胱甘肽代谢差异表达基因的相关信息
Table 4摇 Information of differential expression genes related to glutathione metabolism of tobacco seedling under chilling stress
基因登 ID gene ID log2 ratio 假定功能 Putative function 图中位置 Position
ACN35899.1 1.578 unknown 1.1.1.44
XP_002530803.1 1.801 6鄄phosphogluconate dehydrogenase, putative 1.1.1.44
CAA04992.1 3.75 glucose鄄6鄄phosphate dehydrogenase 1.1.1.49
CAA04994.1 -3.11 glucose鄄6鄄phosphate dehydrogenase 1.1.1.49
P80461.1 | GSHRP_TOBAC 1.335 glutathione reductase, chloroplastic 1.8.1.7
AAL35365.1 | AF442387_1 1.048 ascorbate peroxidase 1.11.1.11
ABX79340.1 1.838 cytosolic ascorbate peroxidase 1.11.1.11
BAA12918.1 1.343 cytosolic ascorbate peroxidase 1.11.1.11
Q9THX6.1 | TL29_SOLLC -1.74 thylakoid lumenal 29 kDa protein, chloroplastic 1.11.1.11
Q9FXS3.1 | GPX4_TOBAC 2.54 probable phospholipid hydroperoxide glutathioneperoxidase; 1.11.1.9
4806 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 34卷摇
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基因登 ID gene ID log2 ratio 假定功能 Putative function 图中位置 Position
XP_002276256.1 1.008 predicted: hypothetical protein 1.11.1.9
CAE54353.1 -1.96 putative spermine synthase 2.5.1.16
O48660.1 | SPDE_NICSY 2.48 spermidine synthase; Putrescine aminopropyltransferase 2.5.1.16
AAX20044.1 2.075 probable glutathione鄄S鄄transferase 2.5.1.18
ABQ96852.1 1.13 glutathione S鄄transferase 2.5.1.18
ADB85103.1 2.78 glutathione S鄄transferase omega 2.5.1.18
CAA45741.1 8.741 glutathione S鄄transferase C鄄7 2.5.1.18
CAJ13709.1 2.54 glutathione S鄄transferase 12 2.5.1.18
CBI15230.3 3.867 unnamed protein product 2.5.1.18
CBI32040.3 2.066 unnamed protein product 2.5.1.18
P25317.1 | GSTXA_TOBAC 3.37 probable glutathione S鄄transferase parA 2.5.1.18
P46440.1 | GSTF2_TOBAC 9.642 glutathione S鄄transferase APIC 2.5.1.18
P49332.1 | GSTXC_TOBAC 2.404 probable glutathione S鄄transferase parC; 2.5.1.18
Q03666.1 | GSTX4_TOBAC 3.794 probable glutathione S鄄transferase; PCNT107 2.5.1.18
XP_002305918.1 1.858 predicted protein 2.5.1.18
XP_002509786.1 1.094 glutathione鄄s鄄transferase theta, gst, putative 2.5.1.18
图 5摇 低温胁迫下烤烟幼苗的谷胱甘肽代谢过程中的差异表达基因
Fig.5摇 Differential expression genes related to glutathione metabolism of tobacco seedling under chilling stress
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3摇 讨论
烟草生长最适温度为 25— 28 益。 目前,烤烟大
多采用工厂化集约漂浮育苗,虽然育苗小环境有所
改善,但受自然气温影响仍然很大,当温度降至 12
益以下会造成出苗慢、降低出苗率及苗期生长缓慢。
南方很多烟区在早春育苗阶段常有“倒春寒冶等低温
危害发生,一般 3 d左右,有时甚至达 1周,影响烟苗
质量及移栽后还苗期延长,最终影响烟叶生产中、上
等烟的比例及优质特色烟叶生产。 晋艳等研究了低
温胁迫 0. 5—1. 5 h 后 2 个烟草品种 (云烟 85 和
K326)幼苗的膜透性、脯氨酸含量、膜保护酶和叶绿
素含量变化特点[5],模拟南方烟区“倒春寒冶特点,低
温胁迫 3 d后测定烤烟幼苗光合能力、膜氧化和抗氧
化能力,研究结果对烤烟壮苗培育具有重要参考意
义。 本研究结果表明,低温胁迫后其叶绿素含量、光
合能力显著下降,细胞膜受损,结果与短时间处理[5]
结果一致,但膜保护酶活性和抗氧化物质(谷胱甘肽
和抗坏血酸)含量显著上升,抗氧化能力加强,植物
本身耐低温能力得到提高。 植物在逆境胁迫响应下
受到多个基因的调控,在逆境条件下大量基因表达
发生变化,这些基因对相应逆境耐性的获得起到重
要作用[15]。 基于测序技术的数字化基因表达谱具
有高通量和高灵敏性的优势,不需要获得目标基因
序列,可以从全基因组突破同时研究成千上万个基
因的表达,能很好反映生物在生长发育过程中整个
基因组的基因表达变化情况[27鄄28]。 因此,我们采用
该基因表达谱分析技术分析低温处理 3 d 后烤烟幼
苗叶片的基因差异表达情况,从中进一步验证基因
表达差异和光合能力、抗氧化能力之间的一致性,发
现大量的上调和下调差异表达基因,其中部分基因
表达量较高,为进一步利用这些基因提供了理论
依据。
在高等植物中大部分的叶绿素分子都结合在
PS玉和 PS域的天然色素蛋白复合物上,类囊体膜是
光合作用能量转换所需的脂质双层膜,含有捕光及
将光能转化为化学能所必需的色素蛋白及酶系统。
其中,PS域捕光色素蛋白复合物在类囊体膜上的含
量最为丰富,它所结合的叶绿素约占类囊体膜上色
素量的 50%[29]。 通常 PS玉捕光色素蛋白 (LHC)含
有 Lhca1、Lhca2、Lhca3 和 Lhca4等种蛋白质,PS域捕
光色素蛋白 ( LHCII ) 含有 Lhcb1、 Lhcb2、 Lhcb3、
Lhcb4、Lhcb5等蛋白质,捕光色素蛋白分子量在 20
— 29 kD 之间[30]。 内囊体膜中有两种捕光天线叶
绿素 a / b色素蛋白复合体,PS玉捕光天线叶绿素 a / b
色素蛋白复合体 (LHCI) 和 PS域捕光天线叶绿素
a / b色素蛋白复合体 (包括 LHCII、CP29 、CP26 、
CP24 和 CP22)。 由于 LHCII 结合有叶片叶绿素总
量的 50%,在光合作用光能的吸收中具有重要作用。
CP29、CP26、CP24 和 CP22是 PS域捕光天线叶绿素
a / b色素蛋白复合体中 4 种主要的亚复合物,含有
茁鄄胡萝卜素和叶黄素,参与叶黄素循环,分散过多的
激发能,对抗光抑制,起到保护反应中心的作用,其
中 CP22 和 CP29 更靠近 PS域核心复合物。 本研究
结果表明,低温胁迫后叶绿素 a / b 结合蛋白编码基
因,无论是 CP22 还是 CP29,表达都下调,说明低温
胁迫后叶片叶绿素捕光能力下降。 光合作用的原初
反应,即捕光色素分子吸收光能,将能量快速高效地
传递给光合作用反应中心,进行电荷分离,固定激发
能,经过一系列电子传递步骤,将能量转化为电化学
自由能。 PS域反应中心负责光能的转换、电子和质
子的产生以及分子氧的释放过程的启动。 叶绿体
PsbA和 PsbD 基因编码的 D1和 D2多肽是 PS域 RC
的主要功能蛋白,它们结合着 P680,脱镁叶绿素 a和
茁鄄胡罗卜素,并且含有 PS域电子传递链中最重要的
组分 Z 和 D,还为与水裂解相关的锰簇提供结合位
点[31]。 CP47 和 CP43 与反应中心的 D1 和 D2 蛋白
紧密相连,除了将外周天线叶绿素 a / b 结合蛋白
(LHCII、CP29、CP27、CP24、CP22)捕获的激发能汇
集给反应中心外,还具有核心天线的作用。 本研究
发现,低温胁迫后烟草 CP47(PsbB)和 CP43 (PsbC)
相关基因表达明显上调,可能是为了适应天线蛋白
基因下调的结果,起到一种补偿作用。 光合作用的
开始是从 PS玉开始。 PS玉是电子传递链过程,从初
级接受者(Primary acceptor)开始,经过铁氧化还原
蛋白(Fd)、细胞色素复合体(Cytochrome Complex)、
质体蓝蛋白(含铜蛋白质)(Pc)后再回到 PS玉,本文
中 PS玉相关调控差异基因均表现为下调表达,说明
低温影响电子链的传递。 光合电子传递是由反应中
心启动,由电荷分离所导致的,由 PS域和 PS玉串联
起来进行的,其中细胞色素 b6 / f复合物位于 PS域和
PS玉两者之间。 本文中低温导致烤烟细胞色素 b6 / f
6806 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 34卷摇
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复合物上调,光电子传递部分基因上调,部分基因下
调,这也可能是烤烟幼苗低温适应的结果。 叶绿素
含量高低变化是光合作用重要的影响因素,也会影
响叶片对光能的吸收。 低温胁迫 3d 后烤烟 K326 多
数叶绿素相关基因处于下调,同时,叶绿素含量较对
照显著下降,研究结果表明叶绿素总含量变化和作
为两种捕光天线叶绿素 a / b 色素蛋白复合体基因下
调是相对一致的。 同时,K326 在低温处理后,其净
光合速率、蒸腾速率、叶片气孔导度等均显著下降,
说明其光合能力大大下降,与基因表达谱分析结果
一致。
谷胱甘肽是一种在生物体内广泛存在的活性三
肽,具有作为药物、机体异物的解毒剂、机体抗氧化
剂、氨基酸运输物质、辅酶等各种生化作用[32]。 尤
其是可自发地或在 GPX(谷胱甘肽过氧化物酶)催
化下来清除体内的活性氧,也可通过谷胱甘肽硫转
移酶(GST)催化形成 GSX来清除活性物质以保护细
胞,降低氧化损伤[33]。 低温处理 K326 后进行基因
差异表达分析结果显示,葡萄糖鄄6鄄磷酸脱氢酶、精胺
合酶、叶绿体类囊体 29kDa 蛋白等蛋白质有关的基
因均处于下调表达,说明有机体有一套强大的自我
保护及调控机制来应对环境胁迫。 谷胱甘肽相关基
因的上调及下调表达是其更充分发挥抵御氧化压力
及解毒功能的作用,这种调控与自我保护机制密切
相关。 本文通过测定 K326 烟草幼苗叶片中自由基
生成速率发现,低温处理 3 d 后自由生产速率下降,
从差异基因表达情况来看,谷胱甘肽相关基因多处
于上调(表 3),这和自由基生产速率下降一致。 本
文谷胱甘肽上调基因中,主要包含谷胱甘肽 S 转移
酶、多胺(亚精胺合酶,腐胺氨丙基转移酶)及抗坏血
酸过氧化物酶等类型,均与抵御逆境胁迫有关。 谷
胱甘肽和 Vc 含量在低温处理后显著上升,说明
K326烤烟幼苗通过相关基因上调,提高了其清除自
由基能力。 林元震[34]通过将克隆的葡萄糖鄄 6鄄磷酸
脱氢酶(G6PDH)基因转移到烟草中进行低温胁迫
后发现,随着胁迫时间延长,转化烟草的 SOD、POD
活性升高而 MDA含量下降,说明该基因在烟草中的
表达有助于膜保护性酶 SOD 和 POD 活性提高及细
胞膜稳定,进而提高了转基因烟草的耐低温能
力[34]。 通过低温胁迫处理 K326 后,其 CAT 酶活性
上升,SOD酶活性显著上升,POD酶活性则表现为显
著下降,这可能与差异基因表达谱中 G鄄6鄄PD基因中
部分上调、部分处于下调有关。
植物对低温胁迫的响应是植物体内一个复杂的
过程,主要包括感应低温信号,信号转导,及引起转
录因子与相关功能性基因的差异表达。 植物主要通
过气孔关闭、渗透性物质积累、活性氧清除以及对膜
和蛋白结构的保护等一系列反应作为对低温胁迫的
耐受响应。 本研究差异表达基因涉及到烤烟幼苗对
低温胁迫响应机制的各个方面。 此外,还有大量功
能未知基因,这些基因参与多种代谢途径,功能表达
多表现为上调,少数表达下调,部分呈现超过 10 倍
的表达量,这些基因与烤烟幼苗在低温胁迫下的生
理生态反应将是下一步研究的主要内容之一。 本研
究也获得了一批与耐寒相关的基因,尤其是抗氧化
相关的超量表达基因,为耐寒基因克隆及分子机理
研究奠定了基础。
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