全 文 ：ISSN 1000-0933
CN 11-2031/Q
中国生态学学会 主办
出版
w
w
w
.eco
lo
g
ica.cn
生
态
学
报
中国科学院生态环境研究中心
第 31卷 第 14期 Vol.31 No.14 2011
生态学报
Acta Ecologica Sinica第三
十
一
卷
第
十
四
期
二
○
一
一
年
七
月
2011-14 2011.7.6, 4:58 PM1
摇 摇 摇 摇 摇 生 态 学 报
摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 (SHENGTAI XUEBAO)
摇 摇 第 31 卷 第 14 期摇 摇 2011 年 7 月摇 (半月刊)
目摇 摇 次
厦门市三个产业土地利用变化的敏感性 黄摇 静,崔胜辉,李方一,等 (3863)……………………………………
黄河源区沙漠化及其景观格局的变化 胡光印,董治宝,逯军峰,等 (3872)………………………………………
岩溶山区景观多样性变化的生态学意义对比———以贵州四个典型地区为例
罗光杰,李阳兵,王世杰,等 (3882)
……………………………………
……………………………………………………………………………
基于城市地表参数变化的城市热岛效应分析 徐涵秋 (3890)……………………………………………………
北京市土地利用生态分类方法 唐秀美,陈百明,路庆斌,等 (3902)………………………………………………
长白山红松臭冷杉光谱反射随海拔的变化 范秀华,刘伟国,卢文敏,等 (3910)…………………………………
臭冷杉生物量分配格局及异速生长模型 汪金松,张春雨,范秀华,等 (3918)……………………………………
渔山岛岩礁基质潮间带大型底栖动物优势种生态位 焦海峰,施慧雄,尤仲杰,等 (3928)………………………
食物质量差异对树麻雀能量预算和消化道形态特征的影响 杨志宏,邵淑丽 (3937)……………………………
桂西北典型喀斯特区生态服务价值的环境响应及其空间尺度特征 张明阳,王克林,刘会玉,等 (3947)………
隔沟交替灌溉条件下玉米根系形态性状及结构分布 李彩霞,孙景生,周新国,等 (3956)………………………
不同抗病性茄子根系分泌物对黄萎菌的化感作用 周宝利,陈志霞,杜摇 亮,等 (3964)…………………………
镧在草鄄菇鄄土系统中的循环与生物富集效应 翁伯琦,姜照伟,王义祥,等 (3973)………………………………
鄱阳湖流域泥沙流失及吸附态氮磷输出负荷评估 余进祥,郑博福, 刘娅菲,等 (3980)………………………
柠条细根的分布和动态及其与土壤资源有效性的关系 史建伟,王孟本,陈建文,等 (3990)……………………
土壤盐渍化对尿素与磷酸脲氨挥发的影响 梁摇 飞,田长彦 (3999)………………………………………………
象山港海域细菌的分布特征及其环境影响因素 杨季芳,王海丽,陈福生,等 (4007)……………………………
近地层臭氧对小麦抗氧化酶活性变化动态的影响 吴芳芳,郑有飞,吴荣军,等 (4019)…………………………
抑制剂和安全剂对高羊茅根中酶活性和菲代谢的影响 龚帅帅,韩摇 进,高彦征,等 (4027)……………………
南苜蓿高效共生根瘤菌土壤的筛选 刘晓云,郭振国,李乔仙,等 (4034)…………………………………………
汉江上游金水河流域土壤常量元素迁移模式 何文鸣,周摇 杰,张昌盛,等 (4042)………………………………
基于地理和气象要素的春玉米生育期栅格化方法 刘摇 勤,严昌荣,梅旭荣,等 (4056)………………………
日光温室切花郁金香花期与外观品质预测模型 李摇 刚,陈亚茹,戴剑锋,等 (4062)……………………………
冀西北坝上半干旱区南瓜油葵间作的水分效应 黄摇 伟,张俊花,李文红,等 (4072)……………………………
专论与综述
鸟类分子系统地理学研究进展 董摇 路,张雁云 (4082)…………………………………………………………
自然保护区空间特征和地块最优化选择方法 王宜成 (4094)……………………………………………………
人类活动是导致生物均质化的主要因素 陈国奇,强摇 胜 (4107)…………………………………………………
冬虫夏草发生的影响因子 张古忍,余俊锋,吴光国,等 (4117)……………………………………………………
自然湿地土壤产甲烷菌和甲烷氧化菌多样性的分子检测 佘晨兴,仝摇 川 (4126)………………………………
研究简报
塔里木河上游典型绿洲不同连作年限棉田土壤质量评价 贡摇 璐,张海峰,吕光辉,等 (4136)………………
高山森林凋落物分解过程中的微生物生物量动态 周晓庆,吴福忠,杨万勤,等 (4144)…………………………
生物结皮粗糙特征———以古尔班通古特沙漠为例 王雪芹,张元明,张伟民,等 (4153)…………………………
不同海拔茶园害虫、天敌种群及其群落结构差异 柯胜兵,党凤花,毕守东,等 (4161)…………………………
期刊基本参数:CN 11鄄2031 / Q*1981*m*16*306*zh*P* ￥ 70郾 00*1510*33*
室室室室室室室室室室室室室室
2011鄄07
封面图说: 内地多呈灌木状的沙棘,在青藏高原就表现为高大的乔木,在拉萨河以及雅鲁藏布江沿岸常常可以看到高大的沙棘
林和沼泽塔头湿地相映成趣的美丽景观。
彩图提供: 陈建伟教授摇 国家林业局摇 E鄄mail: cites. chenjw@ 163. com
第 31 卷第 14 期
2011 年 7 月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol. 31,No. 14
Jul. ,2011
http: / / www. ecologica. cn
基金项目:国家自然科学基金项目(41071148);福建省重点学科项目资助
收稿日期:2010鄄05鄄13; 摇 摇 修订日期:2010鄄09鄄15
*通讯作者 Corresponding author. E鄄mail: tongch@ fjnu. edu. cn
佘晨兴,仝川.自然湿地土壤产甲烷菌和甲烷氧化菌多样性的分子检测.生态学报,2011,31(14):4126鄄4135.
She C X, Tong C. Molecular detection of diversity of methanogens and methanotrophs in natural wetland soil. Acta Ecologica Sinica,2011,31 (14):
4126鄄4135.
自然湿地土壤产甲烷菌和甲烷氧化菌
多样性的分子检测
佘晨兴1,2,仝摇 川2,*
(1. 福建师范大学环境科学与工程学院, 福州摇 350007;
2. 湿润亚热带生态鄄地理过程省部共建教育部重点实验室, 福建师范大学亚热带湿地研究中心, 福州摇 350007)
摘要:产甲烷菌和甲烷氧化菌是介导自然湿地甲烷循环的重要功能菌群。 开展产甲烷菌和甲烷氧化菌多样性的检测研究有助
于揭示微生物介导的甲烷循环以及自然湿地甲烷排放的时空异质性。 传统基于培养的检测方法已被证实无法充分描述产甲烷
菌和甲烷氧化菌的多样性,而分子检测方法为自然湿地土壤产甲烷菌和甲烷氧化菌的多样性检测提供了一种更准确和科学的
工具。 综述了自然湿地土壤产甲烷菌和甲烷氧化菌的定性和定量分子检测方法,包括末端限制性片段长度多态性(T鄄RFLP)、
变性梯度凝胶电泳(DGGE)、荧光原位杂交(FISH)和实时定量 PCR(real鄄time qPCR),重点分析了分子检测中两类重要的标记
基因,总结了不同类型自然湿地产甲烷菌和甲烷氧化菌群落多样性的最新成果,提出了我国在该领域今后应深入研究探讨的一
些问题及建议。
关键词:自然湿地;产甲烷菌;甲烷氧化菌;多样性;分子生态学技术
Molecular detection of diversity of methanogens and methanotrophs in natural
wetland soil
SHE Chenxing1, 2, TONG Chuan2, *
1 College of Environmental Science and Engineering, Fujian Normal University, Fuzhou 350007, China
2 Key Laboratory of Humid Subtropical Eco鄄geographical Process of Ministry of Education, Research Centre of Wetlands in Subtropical Region, Fujian Normal
University, Fuzhou 350007, China
Abstract: Methane is one of the most important greenhouse gases and plays an essential role in atmospheric chemistry. The
largest single source of methane is natural wetlands, which have been suggested to contribute significantly to the interannual
variability of global methane emissions. Methanogens and methanotrophs are the main functional microbial groups mediating
methane cycles of natural wetlands. Biogenic methane is produced by methanogenic archaea or methanogens as the final step
in anaerobic degradation of organic matter. However, only about half of the produced methane is emitted to the atmosphere,
while the remainder is oxidized by a diverse group of bacteria referred to as methane oxidizing bacteria ( MOB) or
methanotrophs. It is evident that the studies on the diversity of methanogens and methanotrophs can assist with revealing
microbial鄄mediated methane cycles and the temporal鄄spatial heterogeneity of methane emission from natural wetlands.
Traditional methods based on laboratory culture techniques have been proven inadequate to describe the vast microbial
diversity, because those methods miss more than 99% of the organisms while enriching those thriving in cultures but not
numerically or functionally important in the environment. Introduction of molecular methods independent of culture
techniques has vastly improved the potential to describe microbial diversity. The 16S ribosomal RNA (rRNA) gene is by far
http: / / www. ecologica. cn
the most frequently used phylogenetic marker for studying microbial ecology and diversity in the environment. An additional
approach includes the sequencing of functional genes that are unique to the physiology of the group of microorganisms
studied. Methanogen and methanotroph communities have been characterized by employing the 16S rRNA gene or functional
genes as molecular markers in different types of natural wetlands. The functional gene of methanogens is mcrA, which
encodes subunits of Methyl鄄coenzyme M reductase; whilst the functional genes of methanotrophs include pmoA, mmoX and
mxaF, which encode subunits of particulate methane monooxygenase, soluble methane monooxygenase, and methanol
dehydrogenase, respectively. Sequence鄄based mcrA or pmoA phylogeny is consistent with the 16S rRNA-based phylogeny.
Thus, the mcrA or pmoA gene is a favorable functional gene and widely used to detect methanogens and methanotrophs in
soils of natural wetlands. Studies to date have differentiated communities by analysis of clone libraries or by community
fingerprinting by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), temperature gradient gel electrophoresis (TGGE), or by
terminal restriction fragment length polymorphism (T鄄RFLP) relying on differences in restriction fragment lengths between
taxa. Additionally, fluorencence in situ hybridization (FISH) and real鄄time quantitative PCR (real鄄time qPCR) have also
been applied for quantification of natural wetland鄄inhabiting methanogens and methanotrophs. Members of orders
Methanosarcinales, Methanomicrobiales, Methanobacteriales, and of Rice cluster I have frequently been detected in natural
wetlands. Methanogen communities generally change with the depth of soils in natural wetlands. Shifts related to vegetation,
pH and temperature have also been reported. There are studies revealing the presence of both type 玉 and type 域
methanotrophs in natural wetlands. Type 玉 methanotrophs generally dominate in nutrient鄄rich environments, whereas type
域 methanotrophs generally dominate in nutrient鄄poor environments. This paper reviews the molecular biological tools used
for detecting the diversity of methanogens and methanotrophs in soils of natural wetlands, such as T鄄RFLP, DGGE, FISH
and real鄄time qPCR. Furthermore, two types of important marker genes in molecular detection are examined and the latest
achievements in studies of the diversity of methanogens and methanotrophs in different types of natural wetlands are
summarized. Based on review of literature, further studies on diversity of methanogens and methanotrophs in natural
wetlands in China are suggested.
Key Words: natural wetland;methanogens;methanotrophs;diversity;molecular ecology technique
作为水陆相互作用形成的独特生态系统,自然湿地虽然只占地球陆地表面很小的部分,却是大气中甲烷
(CH4)的重要来源之一,估计每年释放量约为 100—231 Tg,对全球气候变化影响巨大[1]。 在自然湿地土壤
中,产甲烷菌和其他细菌形成一种特殊的互营关系,持续降解生物质并接受末端电子产生甲烷;而相当一部分
甲烷在从土壤和水体释放到大气之前,被甲烷氧化菌重新吸收利用[2]。 因此,产甲烷菌和甲烷氧化菌是介导
自然湿地甲烷循环的重要功能菌群。 探索自然湿地土壤产甲烷菌和甲烷氧化菌的多样性有助于深入认知自
然湿地甲烷代谢循环的微生物学机制,为人类最终有效调控湿地甲烷代谢,减少甲烷排放通量提供科学基础。
自然环境中微生物群落极其复杂,传统依赖于培养的方法已被证实无法充分描述微生物的多样性,可能
会错失 99%以上的微生物种类[3]。 分子生态学方法的应用,有效地克服了传统分析检测方法的不足,提高了
分析检测的速度及结果的准确度和完整性,从分子水平上较为客观地揭示了微生物的多样性。 近 10 多年来,
分子生态学方法已成为自然湿地土壤产甲烷菌和甲烷氧化菌多样性研究的关键手段,并取得了丰硕的成
果[4鄄8]。 我国也已在青藏高原若尔盖湿地开展了产甲烷菌和甲烷氧化菌的一些相关研究[9鄄11]。 本文对自然湿
地土壤产甲烷菌和甲烷氧化菌的定性和定量分子检测方法,特别是标记基因以及不同类型自然湿地产甲烷菌
和甲烷氧化菌群落多样性的最新研究进展进行了综述,并提出今后我国应重点给予关注的一些问题和研究方
向,旨在促进我国在该领域开展系统、深入的研究,填补相应空白。
1摇 自然湿地产甲烷菌和甲烷氧化菌多样性检测的标记基因
标记基因是一种已知序列或已知功能的基因,能够起着特异性标记的作用,因此可用来标记具有特定遗
7214摇 14 期 摇 摇 摇 佘晨兴摇 等:自然湿地土壤产甲烷菌和甲烷氧化菌多样性的分子检测 摇
http: / / www. ecologica. cn
传特征的微生物。 选择一个合适的标记基因是微生物多样性分子检测中面临的首要问题。 16S rRNA基因携
带大量可用于设计引物的序列信息,是目前应用最广泛的标记基因;而功能基因则可标记具有特定生理和代
谢功能的微生物,也是多样性分子检测中一类重要的标记基因。
1. 1摇 16S rRNA基因
Woese等[12]通过对核糖体 RNA(rRNA)序列的比对分析,完美定义了生命的三域,强调了 rRNA 作为系
统发育标记基因的重要性。 16S rRNA分子存在于所有的细胞生命形式中,它包含高度保守的区域,并穿插着
许多可变区域。 可变区域允许序列的比对,而保守区域则被认为是古菌、细菌和真核生物的特征序列,可用于
设计各种引物或探针,使序列的扩增或鉴定达到种的水平。 在 3 种 rRNA(5S,16S / 18S 和 23S / 28S)类型中,
16S rRNA已成为应用最为广泛的标记基因[13]。
许多研究以 16S rRNA基因作为标记基因,对自然湿地中产甲烷菌的多样性进行了表征[5, 14鄄15]。 可特异
性扩增产甲烷菌 16S rRNA基因的一些引物对(如 146f / 1324r、0357F / 0691R)已被设计出来[16鄄17](表 1),并成
功应用于自然湿地中产甲烷菌多样性的检测。 但是,Banning 等[18]研究发现,这些引物也扩增了广古菌门
(Euryarchaeota)和泉古菌门(Crenarchaeota)中不产甲烷的古菌,为了消除非特异性扩增,他们设计了 3 对引
物,覆盖许多已知产甲烷菌 16S rDNA序列的多样性。 此外,产甲烷菌更直接的检测方法是采用古菌的通用引
物(如 A109f / A912rt、A109f / A934r等)进行 16S rRNA 基因的扩增,并通过系统发育分析进行产甲烷菌的分
类鉴定[19鄄20](表 1)。
表 1摇 用于研究产甲烷菌群落的一些 PCR引物
Table 1摇 Some PCR primers for study of methanogenic communities
靶标基因
Targeted gene
引物
Primer
引物序列(5忆—3忆)
Primer sequence(5忆—3忆)
产物大小(bp)
Product size(bp)
参考文献
Reference
Methanogen 16S rRNA 146f / 1324r GGSATAACCYCGGGAAAC / GCGAGTTACAGCCCWCRA 1178 [16]
0357F / 0691R CCCTACGGGGCGCAGCAG / GGATTACARGATTTCAC 350 [17]
Archaeal 16S rRNA A109f / A912rt ACKGCTCAGTAACACGT / GTGCTCCCCCGCCAATTCCTTTA 803 [19]
A109f / A934r ACKGCTCAGTAACACGT / GTGCTCCCCCGCCAATTCCT 825 [20]
自然湿地中甲烷氧化菌的多样性检测同样也可用 16S rRNA 基因作为标记基因进行表征[6鄄7]。 最早用来
检测甲烷氧化菌的 16S rRNA 基因探针是 9琢 和 10酌[21鄄22],分别靶标丝氨酸途径(Serine pathway)和核酮糖单
磷酸盐途径(RuMP pathway)的甲基营养细菌,但这些探针最大缺点是只能靶标甲基营养细菌而不是特定类
群的甲烷氧化菌。 Holmes等[23]设计了第一对属特异性的引物(Mb1007、 Mc1005、 Mm1007 和 Ms1020),分别
靶标甲基杆菌属(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基单胞菌属(Methylomonas)和甲基弯曲菌属
(Methylosinus)的甲烷氧化菌。 最近,Chen 等[24]也设计了分别靶标玉型和域型甲烷氧化菌的新引物,这些引
物可扩增几乎所有已知甲烷氧化菌的 16S rRNA 基因,包括甲基热菌属(Methylocaldum)、甲 基 球 形 属
(Methylosphaera)、甲基细胞菌属(Methylocella)和甲基帽菌属(Methylocapsa)的甲烷氧化菌,而先前的引物则
不扩增这些属的甲烷氧化菌。 目前,靶标特定甲烷氧化菌 16S rRNA基因的探针或引物只有少数被用于自然
湿地环境中,但这些探针及引物是将来开展相关研究很有用的资源(表 2)。
1. 2摇 功能基因
功能基因的优势在于可以专一性标记具有特定功能的微生物,克服了系统发育分散的问题。 甲基辅酶 M
还原酶(MCR,EC 2. 8. 4. 1)是甲烷生成中一种重要的酶,参与甲烷生成的最后一步反应,催化甲基还原以形
成甲烷[25]。 这种酶存在于所有已知的产甲烷菌中,但不存在于不产甲烷的古菌和细菌中[26]。 MCR 由 琢、茁
和 酌 三个亚基组成,由操纵子 mcrBDCGA所编码。 其中,mcrA 基因负责编码 MCR 的 琢鄄亚基,含有与 MCR 催
化位点相关的保守序列区。 mcrA 的系统发育遵循 16S rRNA 的系统发育,允许根据 mcrA 序列进行产甲烷菌
的分类鉴定[27]。 用于扩增产甲烷菌 mcrA基因的引物主要有 MCR引物、ME引物和 ML引物等[27鄄29](表 3)。
8214 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 31 卷摇
http: / / www. ecologica. cn
表 2摇 靶标甲烷氧化菌的一些 16S rRNA基因探针
Table2摇 Some 16S rRNA gene probes targeting methanotrophs
探针 Probe 序列(5忆—3忆) Sequence(5忆—3忆) 靶标类型 Targeted type 参考文献 Reference
10酌 GGTCCGAAGATCCCCCGCTT RuMP pathway methylotrophs [22]
9琢 CCCTGAGTTATTCCGAAC Serine pathway methylotrophs [22]
Mb1007 CACTCTACGATCTCTCACAG Type 玉 methanotrophs:Methylobacter(Methylomicrobium) [23]
Mc1005 CCGCATCTCTGCAGGAT Type 玉 methanotrophs:Methylococcus [23]
Mm1007 CACTCCGCTATCTCTAACAG Type 玉 methanotrophs:Methylomonas [23]
Ms1020 CCCTTGCGGAAGGAAGTC Type 域 methanotrophs:Methylosinus [23]
Type 玉F ATGCTTAACACATGCAAGTCGAACG Type 玉 methanotrophs [24]
Type 玉R CCACTGGTGTTCCTTCMGAT Type 玉 methanotrophs [24]
Type 域F GGGAMGATAATGACGGTACCWGGA Type 域 methanotrophs [24]
Type 域R GTCAARAGCTGGTAAGGTTC Type 域 methanotrophs [24]
表 3摇 用于扩增产甲烷菌功能基因的一些 PCR引物
Table 3摇 Some PCR primers used for amplification of functional gene of methanogens
靶标基因
Targeted gene
引 物
Primer
引物序列(5忆—3忆)
Primer sequence(5忆—3忆)
产物大小(bp)
Product size(bp)
参考文献
Reference
mcrA MLf / MLr GGTGGTGTMGGATTCACACARTAYGCWACAGC ( GGVGFTQYATA ) /TTCATTGCRTAGTTWGGRTAGTT(NYPNYAMN) 470 [27]
MCRf / MCRr TAYGAYCARATHTGGYT / ACRTTCATNGCRTARTT 490 [28]
ME1 / ME2 GCMATGCARATHGGWATGTC / TCATKGCRTAGTTDGGRTAGT 760 [29]
这些引物在扩增长度、靶标位点及简并水平上各不相同,有报道指出,所用的两对引物在产甲烷菌类群的覆盖
面上存在差异性[18]。 引物的适用范围与其研究环境密切相关, MCR引物主要用于稻田土壤或水稻根际产甲
烷菌的检测[30鄄31],而 ME引物和 ML引物则被用于更广的环境中,如自然湿地、淡水沉积物、反刍动物瘤胃等
环境[18, 32鄄33],因此具体使用时应有所选择。
用于检测自然湿地中甲烷氧化菌多样性的功能基因主要包括 pmoA 和 mmoX,其它一些功能标记基因对
于甲烷氧化菌来说是非专有的,但也可用来检测这些甲烷氧化菌,如 mxaF(编码甲醇脱氢酶的大亚基)和
nifH(编码固氮酶还原酶) [34]。 在这些功能基因中,应用最多的功能基因是 pmoA,它负责编码颗粒性甲烷单
加氧酶(pMMO)的 琢鄄亚基,这种酶存在于除 Methylocella silvestris 之外的所有甲烷氧化菌中[35]。 A189f / A682r
是最早用于扩增 pmoA的寡核苷酸引物[36],并已广泛用于揭示各种环境中甲烷氧化菌的群落特征。 此外,其
它一些用于扩增 pmoA的引物也相继被设计出来用于甲烷氧化菌多样性的检测[37鄄39](表 4)。 基于 pmoA序列
的系统发育分析大体与 16S rRNA系统发育分析一致,pmoA作为有效的标记基因已被广泛用于自然湿地甲烷
氧化菌的多样性检测[40]。 另一类功能基因 mmoX则负责编码可溶性甲烷单加氧酶(sMMO),也可作为甲烷氧
化菌的标记基因。 用于扩增 mmoX的一些引物也相继被设计出来用来检测环境中的甲烷氧化菌[41鄄43](表 4)。
不过,研究发现 mmoX基因所标记的多样性相对有限[41鄄43],可能因为 mmoX 是一个高度保守的基因或引物的
设计源于有限的 sMMO序列信息,且只有一个分支的甲烷氧化菌含有这些基因,因此可能会低估环境中甲烷
氧化菌的多样性[41]。
2摇 自然湿地产甲烷菌和甲烷氧化菌多样性检测的分子方法
利用各种分子生态学技术对克隆基因文库或群落的指纹图谱进行分析是微生物多样性分子检测的另一
个重要环节。 目前,自然湿地土壤产甲烷菌和甲烷氧化菌多样性检测中采用的分子分析方法主要包括:末端
限制性片段长度多态性分析( terminal restriction fragment length polymorphism,T鄄RFLP)、变性梯度凝胶电泳
(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)、荧光原位杂交技术(fluorescent in situ hybridazation,FISH)和实
时定量 PCR ( real鄄time quantitative PCR)等。 此外,微阵列 (Microarray)、稳定同位素示踪 ( Stable isotope
9214摇 14 期 摇 摇 摇 佘晨兴摇 等:自然湿地土壤产甲烷菌和甲烷氧化菌多样性的分子检测 摇
http: / / www. ecologica. cn
probing,SIP)等技术也逐渐被引入到该研究领域[4],使得自然湿地产甲烷菌和甲烷氧化菌多样性的分子检测
手段更加丰富。
表 4摇 用于扩增甲烷氧化菌功能基因的一些 PCR引物
Table 4摇 Some PCR primers used for amplification of functional genes of methanotrophs
靶标基因
Targeted gene
引物
Primer
序 列(5忆—3忆)
Sequence(5忆—3忆)
产物大小(bp)
Product size(bp)
参考文献
Reference
pmoA A189f / A682r GGNGACTGGGACTTCTGG / GAASGCNGAGAAGAASGC 525 [36]
f326 / r643 TGGGGYTGGACCTAYTTCC / CCGGCRCRACGTCCTTACC 358 [37]
II 223 F / II646 R CGTCGTATGTGGCCGAC / CGTGCCGCGCTCGACCATGYG 444 [38]
A189f / Mb601 R GGNGACTGGGACTTCTGG / ACRTAGTGGTAACCTTGYAA 432 [38]
A189f / mb661r_nd GGNGACTGGGACTTCTGG / CCGGCGCAACGTCCTTACC 510 [39]
mmoX A166f / B1401r ACCAAGGARCARTTCAAG / TGGCACTCRTARCGCTC 1,230 [41]
534f / 1393r CCGCTGTGGAAGGGCATGAA / CACTCGTAGCGCTCCGGCTC 863 [42]
mmoX206f / mmoX886r ATCGCBAARGAATAYGCSCG / ACCCANGGCTCGACYTTGAA 719 [43]
2. 1摇 产甲烷菌和甲烷氧化菌群落分析的分子方法
目前,对于自然湿地土壤产甲烷菌和甲烷氧化菌的群落组成和结构的分析,采用较多的分子手段是末端
限制性片段长度多态性分析(T鄄RFLP)和变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术。
2. 1. 1摇 末端限制性片段长度多态性技术(T鄄RFLP)
T鄄RLFP技术是目前微生物分子生态学研究中最有力的研究手段之一,主要应用于微生物群落组成和结
构及微生物系统发育等研究。 该技术已在自然湿地产甲烷菌和甲烷氧化菌的群落多样性检测中发挥着极其
重要的作用[5, 44鄄46]。 Merila等[44]以 mcrA作为标记基因,利用 T鄄RFLP技术分析了芬兰 5 个泥炭地中产甲烷菌
的多样性,检测到的类群包括:Methanosarcinaceae, FC 和 RCI。 Horz 等[45]以 pmoA 为标记基因,使用 T鄄RFLP
技术探讨了甲烷氧化菌群落结构与全球气候变化之间的响应关系,发现温度可影响甲烷氧化菌的群落组成,
温度的提高会降低土壤中域型甲烷氧化菌的相对丰度。 此外,利用 T鄄RFLP 技术分析时也可直接以古菌 16S
rRNA基因作为标记基因。 Cadillo鄄Quiroz等[5]以古菌 16S为标记基因,利用 T鄄RFLP技术在美国密执安泥炭沼
泽检测到的产甲烷菌有: Methanosaetaceae,Methanosarcinaceae,Methanomicrobiales (E1,FC,Methanospirillaceae),
Methanobacteriaceae,RCI和 RCII,揭示了中性沼泽中产甲烷菌群落的多样性。 Dettling 等[46]同样以古菌 16S
为标记基因,利用 T鄄RFLP技术在美国芝加哥酸性苔藓泥炭沼泽检测到的产甲烷菌包括:Methanomicrobiales
(FC,E1),RCI,RCII和 Methanosaetaceae,研究发现酸性苔藓泥炭沼泽与中性苔草泥炭沼泽中产甲烷菌的群落
存在差异性。 T鄄RFLP技术也存在一定的局限性,它只能分析 500 bp以下的 DNA 片段,携带的系统发育信息
量较小,另外指纹图谱所能包含的条带有限,只能得到一些优势菌群的信息,而弱势菌群往往检测不到,难以
全面反映自然湿地中产甲烷菌和甲烷氧化菌的多样性。
2. 1. 2摇 变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)
自 1993 年 Myuzer等[47]首次将 DGGE检测技术应用于微生物分子生态学研究领域,该技术现已广泛应
用于各种环境中微生物群落结构及其种群动态变化的监测。 DGGE 技术在自然湿地产甲烷菌和甲烷氧化菌
的群落检测中也是一种非常有力的研究手段,得到许多研究者的青睐[6, 11, 14鄄15]。 Ganzert 等[14]以产甲烷菌
16S为标记基因,利用 DGGE 技术在西伯利亚 Laptev 海岸湿地检测到的产甲烷菌包括:Methanosarcinaceae,
Methanomicrobiales和 RCII,揭示了产甲烷菌群落垂直变化的特点。 Rooney鄄Varga 等[15]以古菌 16S 为标记基
因,利用 DGGE 技术在美国阿拉斯加泥炭地检测到的产甲烷菌有:Methanobacteriaceae,Methanomicrobiales
(FC)和 Methanosaetaceae,发现产甲烷菌的群落变化与植被类型、pH 和温度的变化相关。 Bodelier 等[6]利用
DGGE技术在荷兰淡水沼泽湿地中检测到的甲烷氧化菌有:Methylobacter sp. 和 Methylocystis sp. ,研究发现
Methylobacter属的出现与土壤剖面深度相关,可能是不同剖面深度甲烷氧化活性发生变化的缘故。 Yun 等[11]
0314 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 31 卷摇
http: / / www. ecologica. cn
以 pmoA作为标记基因,利用 DGGE技术在青藏高原若尔盖湿地中检测到 4 种类群的甲烷氧化菌,它们都属
于玉型甲烷氧化菌,其中 2 类属于不可培养的甲烷氧化菌,另 2 类为Methylobacter和Methylococcus属的甲烷氧
化菌,研究发现土壤厌氧层中的甲烷氧化菌比好氧层中的甲烷氧化菌具有更高的多样性。 DGGE技术的优点
是可以同时检测分析多个样品,但也存在一些不足,它只能对微生物群落中数量大于 1%的优势种群进行分
析[47];此外,不同的 DGGE实验条件很可能导致不同的带型谱图,这无疑会对基于序列信息的探针设计和系
统发育分析产生一定的影响。
2. 2摇 产甲烷菌和甲烷氧化菌丰度分析的分子方法
从环境中获取产甲烷菌和甲烷氧化菌的数量信息,对于准确评价产甲烷菌和甲烷氧化菌的生态功能具有
重要的意义。 荧光原位杂交技术和实时定量 PCR 技术突破了传统基于培养的检测方法如最大或然计数法
(most probable number,MPN)的缺陷[40],为直接获取产甲烷菌和甲烷氧化菌的数量信息提供了新手段,并在
自然湿地产甲烷菌和甲烷氧化菌的丰度检测中发挥着极其重要的作用。
2. 2. 1摇 荧光原位杂交技术(FISH)
FISH技术是以荧光标记取代同位素标记的一种新的原位杂交方法,其特点是可以进行样品的原位杂交,
应用于环境中特定微生物种群鉴定、种群数量分析及其特异微生物跟踪检测。 目前,FISH技术已成功用于自
然湿地产甲烷菌和甲烷氧化菌种群的鉴定和种群密度的定量描述,精确程度甚至可以达到种的水平[7, 48鄄49]。
Kotsyurbenko等[48]利用 FISH技术对西伯利亚酸性泥炭沼泽产甲烷菌的多样性进行了研究,发现泥炭中细菌
数量随深度的增加(水位以下 5 cm 至 55 cm)而下降(细胞数从 24伊 107个 / g下降至 4伊107个 / g),而古菌数量
略有增加(细胞数从 1伊 107个 / g提高至 2 伊107个 / g),产甲烷菌 Methanosarcina spp.的数量约占古菌细胞总数
的一半。 Dedysh等[7, 49]利用 FISH技术对西伯利亚和德国酸性苔藓泥炭中甲烷氧化菌的检测,两个地点中泥
炭中检测到的甲烷氧化菌数量分别为(3. 1依0. 2) 伊106个 / g 和(5. 7依 0. 4) 伊106个 / g,其中数量最多的甲烷氧
化菌是 Methylocellas spp. ,约占细胞总数的 60%—96% 。 此外, Methylocella palustris 和 Methylocapsa acidiphila
的数量也较多,而玉型甲烷氧化菌的数量很少(约占 0. 1%—1%),说明域型甲烷氧化菌是酸性苔藓泥炭中主
要的甲烷氧化菌类型。 FISH技术也存在一些缺点,它只能在靶标生物 16S rRNA 已知的情况下才能使用,因
此不能检测出样品中的未知种属的数量,从而影响其检测的准确度。 最近,有学者开始尝试将功能基因 pmoA
与 FISH技术结合起来进行甲烷氧化菌的定量分析[50],这将为今后甲烷氧化菌的定量检测提供一种更有效的
方法。
2. 2. 2摇 实时定量 PCR技术(real鄄time qPCR)
该技术是以 PCR原理为基础发展起来的,主要用于环境样品中特定微生物物种、种群的定量分析,能更
精确地研究特异微生物组成和变化规律。 近年来,该技术在自然湿地产甲烷菌和甲烷氧化菌的丰度检测中也
得到广泛的应用[8, 9鄄11]。 分析时一般可采用 TaqMan探针法对产甲烷菌和甲烷氧化菌的 16S rRNA 基因或功
能基因进行定量检测分析。 此外,还可以采用荧光染料法(SYBR Green),该方法与 TaqMan 探针法相比费用
较低,但由于没有探针的特异性作保证,所以准确性较低。 Steinberg等[8]研发了 SYBR Green 的定量 PCR法,
对编码甲基辅酶 M 还原酶 琢鄄亚基的 mcrA 基因进行定量检测分析,他们还设计了靶标 9 个目标生物的
TaqMan荧光探针,用于检测酸性泥炭样品中不同系统发育类群的产甲烷菌,检测到的类群包括:
Methanosaetaceae, Methanobacteriaceae,Methanocorpusculaceae,Methanosarcina 和 Fen cluster,其中占优势的两
类产甲烷菌分别是:Methanosarcina spp.和 Fen cluster。 国内,Zhang 等[9鄄10]利用实时定量 PCR 技术对青藏高
原若尔盖湿地土壤中占优势的不可培养产甲烷菌 ZC鄄I 以及已分离的产甲烷菌 R15 进行了定量检测,发现
ZC鄄I的数量约占古菌总数的 30% ,土壤中细胞数约为 107个 / g;R15 的数量约占古菌总数的(17. 2依2郾 1)% ,土
壤中细胞数约为 107个 / g。 Yun等[11]利用实时定量 PCR技术对若尔盖湿地土壤中甲烷氧化菌的丰度进行了
分析,发现土壤好氧层中甲烷氧化菌的数量是厌氧层中甲烷氧化菌数量的 1. 5 倍。
3摇 不同类型自然湿地产甲烷菌和甲烷氧化菌的群落多样性
自然湿地的类型多种多样,主要类型有沼泽性泥炭湿地,包括草本泥炭沼泽和藓类泥炭沼泽、森林沼泽湿
1314摇 14 期 摇 摇 摇 佘晨兴摇 等:自然湿地土壤产甲烷菌和甲烷氧化菌多样性的分子检测 摇
http: / / www. ecologica. cn
地和腐泥沼泽等。 近年来,许多学者利用分子检测方法对不同类型自然湿地中产甲烷菌和甲烷氧化菌的群落
多样性进行了研究,检测地点主要集中在分布有泥炭沼泽的 40毅N到 70毅N的北方温带和寒温带地区,研究的
自然湿地类型主要包括受人类干扰强度较弱、或未干扰的沼泽性泥炭湿地[4鄄5, 7, 46, 48鄄49, 51鄄53, 57鄄58]和森林沼泽湿
地[54鄄55, 59],少数涉及腐泥沼泽[6, 56](表 5,表 6)。
表 5摇 不同类型自然湿地产甲烷菌的群落多样性
Table 5摇 Diversity of methanogens community in different types of natural wetlands
类型
Type
名称及地点
Name and sites
检测到的产甲烷菌
Detected methanogens
参考文献
Reference
草本泥炭沼泽
Fen Oligotrophic Salmisuo fen, Finland Methanomicrobiales (FC), Methanosarcinaceae, RCI [51]
Michigan Hollow minerotrophic fen, USA
Methanomicrobiales (E1,FC, Methanospirillaceae), RCI,
RCII,Methanosaetaceae, Methanosarcinaceae,
Methanobacteriaceae
[5]
藓类泥炭沼泽
Bog Ombrotrophic Bakchar Bog, Siberia
RCII,Methanobacteriaceae, Methanosarcinaceae,
Methanomicrobiales [48]
Chicago Bog and Michigan Hollow, USA Methanomicrobiales (FC, E1), RCI, RCII,Methanosaetaceae [46]
Oligotrophic Chicago Bog, McLean Bog,
NY, USA
Methanomicrobiales (FC, E1), RCII, RCI,
Methanosarcinaceae, Methanosaetaceae [52]
Sphagnum鄄Picea bog, Germany Methanomicrobiales(FC),Methanobacteriaceae, Methanosarcinaceae [53]
森林沼泽
Swamp Labrador Hollow conifer swamp, USA
Methanosarcinaceae, Methanosaetaceae, RCII,
Methanobacteriaceae, Methanomicrobiales (FC) [54]
Okefenokee Swamp, USA Methanosarcinaceae, Methanomicrobiales(FC),Methanosaetaceae [55]
腐泥沼泽
Marsh The Blue Cypress Marsh, USA
Methanomicrobiaceae, Methanosarcinaceae,
Methanocorpusculaceae [56]
表 6摇 不同类型自然湿地甲烷氧化菌的群落多样性
Table 6摇 Diversity of methanotrophs community in different types of natural wetlands
类型
Type
名称及地点
Name and sites
检测到的甲烷氧化菌
Detected methanotrophs
参考文献
References
草本泥炭沼泽
fen Oligotrophic fens, Finnish type I methanotrophs [57]
藓类泥炭沼泽
bog Ombrotrophic bogs, Finnish type I and type II methanotrophs [57]
Acidic ombrotrophic bogs, West Siberia Methylocystis, Methylosinus, Methylococcus capsulatus [7, 49]
泥炭地
peatlands
Drained fenland peat soil from Suffolk,
United Kingdom
Methylocystis / Methylosinus, Methylocella palustris,
Methylobacters spp. [58]
Sphagnum / Eriophorum covered peatlands,
United Kingdom Methylocystis, Methylocella, Methylocapsa鄄related species [4]
森林沼泽
Swamp A forested swamp near Ithaca, New York type I and type II methanotrophs [59]
腐泥沼泽
Marsh A freshwater marsh, the Netherlands Methylobacter sp. , Methylocystis sp. [6]
在自然湿地土壤中经常检测到的产甲烷菌类群包括:甲烷八叠球菌目(Methanosarcinales),甲烷微菌目
(Methanomicrobiales),甲烷杆菌目(Methanobacteriales),此外 Rice cluster 玉的产甲烷菌也经常被检测到。 不
同类型自然湿地其生态环境各异,导致土壤中产甲烷菌的多样性也各不相同(表 5)。 在草本泥炭沼泽中经常
检测到的类群有:Methanomicrobiales (FC),Methanosarcinaceae,RCI;在藓类泥炭沼泽中经常检测到的类群有:
Methanomicrobiales (FC),RCII,Methanosarcinaceae;在森林沼泽中经常检测到的类群有:Methanosarcinaceae,
2314 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 31 卷摇
http: / / www. ecologica. cn
Methanomicrobiales ( FC), Methanosaetaceae;在腐泥沼泽中经常检测到的类群有: Methanomicrobiaceae,
Methanosarcinaceae,Methanocorpusculaceae。
自然湿地土壤甲烷氧化菌多样性的检测结果表明:存在玉型甲烷氧化菌和域型甲烷氧化菌。 这两类甲烷
氧化菌在自然湿地中的生态位各不相同,玉型甲烷氧化菌较适宜生长在高氧、低甲烷浓度和富营养的环
境[60];而域型甲烷氧化菌更适应生长在低氧、高甲烷浓度和贫营养的生境[61]。 不同类型自然湿地因其生态
环境各异,导致土壤中甲烷氧化菌的多样性也各不相同(表 6)。 在草本泥炭沼泽中,只检测到玉型甲烷氧化
菌;而在雨养藓类泥炭沼泽中,玉型甲烷氧化菌和域型甲烷氧化菌均被检测到[57]。 最近,Tuomivirta 等[62]利
用引物 A189f / A621r成功地从草本泥炭沼泽中扩增到与域型甲烷氧化菌相关的 pmoA序列,因此,先前在草本
泥炭沼泽中未检测到域型甲烷氧化菌也可能与引物的错配有关。
此外,许多研究发现域型甲烷氧化菌是酸性泥炭地(包括酸性苔藓泥炭沼泽)中的优势类群。 Dedysh
等[7, 49]对德国和俄罗斯酸性苔藓泥炭沼泽甲烷氧化菌的多样性进行了检测,发现 60%—95%的甲烷氧化菌
属于域型的甲烷氧化菌,其中 Methylocystis, Methylocella和 Methylocapsa占优势。 Morris等[58]在英国酸性泥炭
中检测到的甲烷氧化菌有:Methylocystis /Methylosinus,Methylocella palustris 和 Methylobacters spp. ,从 C13 鄄DNA
回收的 pmoA序列大部分与域型甲烷氧化菌相似,表明在酸性泥炭环境中域型甲烷氧化菌是优势菌群。 最
近, Chen等[4]利用磷脂脂肪酸分析(PLFA)结合稳定同位素示踪、微阵列等技术对英格兰酸性泥炭地中甲烷
氧化菌的多样性进行分析,检测到甲烷氧化菌的主要类型有:Methylocystis 和 Methylocella,该结果同样表明
域型甲烷氧化菌是酸性泥炭地中的优势类群。
4摇 总结与展望
分子检测方法的应用极大地促进了自然湿地土壤产甲烷菌和甲烷氧化菌多样性的研究,为揭示产甲烷菌
和甲烷氧化菌的多样性及其生态功能提供了大量信息。 鉴于这些分子方法各有其优缺点,在实际研究中还需
将两种甚至两种以上的方法结合起来互相印证,方可起到扬长避短、相互补充的作用,同时还可将分子检测方
法与传统的分离和培养方法相结合,以期获得更加丰富而准确的群落结构及种群丰度变化等方面的信息。 迄
今为止,对于自然湿地中产甲烷菌和甲烷氧化菌多样性的检测研究主要集中在北半球的泥炭地(包括草本和
藓类泥炭沼泽),而关于其它区域不同湿地类型中产甲烷菌和甲烷氧化菌的多样性知识仍不完整,因此今后
的检测范围有待于进一步扩大。 此外,已有研究表明淡水湿地土壤中也存在甲烷的厌氧氧化过程(Anaerobic
oxidation of methane, AOM) [63],而介导这一厌氧氧化过程的甲烷氧化菌将是未来自然湿地土壤甲烷氧化菌多
样性检测研究的重点对象。
我国幅员辽阔,自然湿地类型多样。 近年来,我国已在青藏高原若尔盖湿地开展了产甲烷菌和甲烷氧化
菌的一些相关研究,并取得了一定的成果,但研究的广度和深度都有待于进一步提高。 鉴于此,建议今后应用
分子检测方法在以下几个方面开展深入的研究:(1)我国主要自然湿地类型产甲烷菌和甲烷氧化菌的多样性
特征;(2)不同类型自然湿地土壤中产甲烷菌和甲烷氧化菌多样性与湿地优势植物之间的相互关系;(3)自然湿
地产甲烷菌和甲烷氧化菌多样性与环境因子的关系及其响应;(4)影响自然湿地产甲烷菌和甲烷氧化菌种群数
量与活性的植物根系分泌物的种类及其化学性质;(5)产甲烷菌和甲烷氧化菌的时空异质性对于自然湿地甲烷
排放通量时空异质性的贡献;(6)自然湿地产甲烷菌和甲烷氧化菌种群的时空变化及其主要影响因素。
References:
[ 1 ]摇 Intergovernmental Panel on Climate Change ( IPCC). Climate Change 2007: The Physical Science Basis. The Fourth Assessment Report of
Working Group. Cambridge: Cambridge University Press, 2007.
[ 2 ] 摇 Le Mer J, Roger P. Production, oxidation, emission and consumption of methane by soils: a review. European Journal of Soil Biology, 2001, 37
(1): 25鄄50.
[ 3 ] 摇 Amann R I, Ludwig W, Schleifer K H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation.
Microbiological Reviews, 1995, 59(1): 143鄄169.
[ 4 ] 摇 Chen Y, Dumont M G, McNamara N P, Chamberlain P M, Bodrossy L, Stralis鄄Pavese N, Murrell J C. Diversity of the active methanotrophic
community in acidic peatlands as assessed by mRNA and SIP鄄PLFA analyses. Environmental Microbiology, 2008, 10(2): 446鄄459.
3314摇 14 期 摇 摇 摇 佘晨兴摇 等:自然湿地土壤产甲烷菌和甲烷氧化菌多样性的分子检测 摇
http: / / www. ecologica. cn
[ 5 ]摇 Cadillo鄄Quiroz H, Yashiro E, Yavitt J B, Zinder S H. Archaeal community in a minerotrophic fen and T鄄RFLP鄄directed isolation of a novel
hydrogenotrophic methanogen. Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74(7): 2059鄄2068.
[ 6 ] 摇 Bodelier P L E, Meima鄄Franke M, Zwart G, Laanbroek H J. New DGGE strategies for the analyses of methanotrophic microbial communities using
different combinations of existing 16S rRNA鄄based primers. FEMS Microbiology Ecology, 2005, 52(2): 163鄄174.
[ 7 ] 摇 Dedysh S N, Derakshani M, Liesack W. Detection and enumeration of methanotrophs in acidic Sphagnum peat by 16S rRNA fluorescence in situ
hybridization, including the use of newly developed oligonucleotide proves for Methylocella palustris. Applied and Environmental Microbiology,
2001, 67(10): 4850鄄4857.
[ 8 ] 摇 Steinberg L M, Regan J M. mcrA鄄targeted real鄄time quantitative PCR method to examine methanogen communities. Applied and Environmental
Microbiology, 2009, 75(13): 4435鄄4442.
[ 9 ] 摇 Zhang G S, Tian J Q, Jiang N, Guo X P, Wang Y F, Dong X Z. Methanogen community in Zoige wetland of Tibetan plateau and phenotypic
characterization of a dominant uncultured methanogen cluster ZC鄄I. Environmental Microbiology, 2008, 10(7): 1850鄄1860.
[10] 摇 Zhang G S, Jiang N, Liu X L, Dong X Z. Methanogenesis from methanol at low temperatures by a novel psychrophilic methanogen, “Methanolobus
psychrophilus冶 sp. nov. , prevalent in Zoige wetland of the Tibetan plateau. Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74(19): 6114鄄6120.
[11] 摇 Yun J L, Ma A z, Li Y M, Zhuang G Q, Wang Y F, Zhang H X. Diversity of methanotrophs in Zoige wetland soils under both anaerobic and
aerobic conditions. Journal of Environmental Sciences, 2010, 22(8): 1232鄄1238.
[12] 摇 Woese C R, Kandler O, Wheelis M L. Towards a natural system of organisms: Proposal for the domains Archaea, Bacteria, and Eucarya.
Proceedings of the National Academy of Sciences, 1990, 87(12): 4576鄄4579.
[13] 摇 Head I M, Saunders J R, Pickup R W. Microbial evolution, diversity, and ecology: a decade of ribosomal RNA analysis of uncultivated
microorganisms. Microbial Ecology, 1998, 35(1): 1鄄21.
[14] 摇 Ganzert L, Jurgens G, M俟nster U, Wagner D. Methanogenic communities in permafrost鄄affected soils of the Laptev Sea coast, Siberian Arctic,
characterized by 16S rRNA gene fingerprints. FEMS Microbiology Ecology, 2007, 59(2): 476鄄488.
[15] 摇 Rooney鄄Varga J N, Giewat M W, Duddleston K N, Chanton J P, Hines M E. Links between archaeal community structure, vegetation type and
methanogenic pathway in Alaskan peatlands. FEMS Microbiology Ecology, 2007, 60(2): 240鄄251.
[16] 摇 Marchesi J R, Weightman A J, Cragg B A, Parkes R J, Fry J C. Methanogen and bacterial diversity and distribution in deep gas hydrate sediments
from the Cascadia Margin as revealed by 16S rRNA molecular analysis. FEMS Microbiology Ecology, 2001, 34(3): 221鄄228.
[17] 摇 Watanabe T, Asakawa S, Nakamura A, Nagaoka K, Kimura M. DGGE method for analyzing 16S rDNA of methanogenic archaeal community in
paddy field soil. FEMS Microbiology Letters, 2004, 232(2): 153鄄163.
[18] 摇 Banning N, Brock F, Fry J C, Parkes R J, Hornibrook E R C, Weightman A J. Investigation of the methanogen population structure and activity in
a brackish lake sediment. Environmental Microbiology, 2005, 7(7): 947鄄960.
[19] 摇 Lueders T, Friedrich M W. Effects of amendment with ferrihydrite and gypsum on the structure and activity of methanogenic populations in rice field
soil. Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68(5): 2484鄄2494.
[20] 摇 Gro茁kopf R, Stubner S, Liesack W. Novel euryarchaeotal lineages detected on rice roots and in the anoxic bulk soil of flooded rice microcosms.
Applied and Environmental Microbiology, 1998, 64(12): 4983鄄4989.
[21] 摇 Brusseau G A, Bulygina E S, Hanson R S. Phylogenetic analysis and development of probes for differentiating methylotrophic bacteria. Applied and
Environmental Microbiology, 1994, 60(2): 626鄄636.
[22] 摇 Tsien H C, Bratina B J, Tsuji K, Hanson R S. Use of oligodeoxynucleotide signature probes for identification of physiological groups of
methylotrophic bacteria. Applied and Environmental Microbiology, 1990, 56(9): 2858鄄2865.
[23] 摇 Holmes A J, Owens N J P, Murrell J C. Detection of novel marine methanotrophs using phylogenetic and functional gene probes after methane
enrichment. Microbiology, 1995, 141(8): 1947鄄1955.
[24] 摇 Chen Y, Dumont M G, C佴bron A, Murrell J C. Identification of active methanotrophs in a landfill cover soil through detection of expression of 16S
rRNA and functional genes. Environmental Microbiology, 2007, 9(11): 2855鄄2869.
[25] 摇 Deppenmeier U. The unique biochemistry of methanogenesis. Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, 2002, 71: 223鄄283.
[26] 摇 Bapteste 魪, Brochier C, Boucher Y. Higher鄄level classification of the Archaea: evolution of methanogenesis and methanogens. Archaea, 2005, 1
(5): 353鄄363.
[27] 摇 Luton P E, Wayne J M, Sharp R J, Riley P W. The mcrA gene as an alternative to 16S rRNA in the phylogenetic analysis of methanogen
populations in landfill. Microbiology, 2002, 148(11): 3521鄄3530.
[28] 摇 Springer E, Sachs M S, Woese C R,Boone D R. Partial gene sequences for the A subunit of methyl鄄coenzyme M reductase (mcrI) as a
phylogenetic tool for the family Methanosarcinaceae. International Journal of Systematic Bacteriology, 1995, 45(3): 554鄄559.
[29] 摇 Hales B A, Edwards C, Ritchie D A, Hall G, Pickup R W, Saunders J R. Isolation and identification of methanogen鄄specific DNA from blanket
bog peat by PCR amplification and sequence analysis. Applied and Environmental Microbiology, 1996, 62(2): 668鄄675.
[30] 摇 Ramakrishnan B, Lueders T, Dunfield P F, Conrad R, Friedrich M W. Archaeal community structures in rice soils from different geographical
regions before and after initiation of methane production. FEMS Microbiology Ecology, 2001, 37(2): 175鄄186.
[31] 摇 Conrad R, Klose M, Noll M, Kemnitz D, Bodelier P L E. Soil type links microbial colonization of rice roots to methane emission. Global Change
Biology, 2008, 14(3): 657鄄669.
[32] 摇 Smith J M, Castro H, Ogram A. Structure and function of methanogens along a short鄄term restoration chronosequence in the Florida Everglades.
Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(13): 4135鄄4141.
[33] 摇 Tatsuoka N, Mohammed N, Mitsumori M, Hara K, Kurihara M, Itabashi H. Phylogenetic analysis of methyl coenzyme鄄M reductase detected from
the bovine rumen. Letters in Applied Microbiology, 2004, 39(3): 257鄄260.
[34] 摇 Dedysh S N. Exploring methanotroph diversity in acidic northern wetlands: molecular and cultivation鄄based studies. Microbiology, 2009, 78(6):
655鄄669.
4314 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 31 卷摇
http: / / www. ecologica. cn
[35]摇 Theisen A R, Ali M H, Radajewski S, Dumont M G, Dunfield P F, McDonald I R, Dedysh S N, Miguez C B, Murrell J C. Regulation of methane
oxidation in the facultative methanotroph Methylocella silvestris BL2. Molecular Microbiology, 2005, 58(3): 682鄄692.
[36] 摇 Holmes A J, Costello A M, Lidstrom M E, Murrell J C. Evidence that particulate methane monooxygenase and ammonia monooxygenase may be
evolutionarily related. FEMS Microbiology Letters, 1995, 132(3): 203鄄208.
[37] 摇 Fjellbirkeland A, Torsvik V, 覫vre覽s L. Methanotrophic diversity in an agricultural soil as evaluated by denaturing gradient gel electrophoresis
profiles of pmoA, mxaF, and 16S rDNA sequences. Antonie Van Leeuwenhoek, 2001, 79(2): 209鄄217.
[38] 摇 Kolb S, Knief C, Stubner S, Conrad R. Quantitative detection of methanotrophs in soil by novel pmoA鄄targeted real鄄time PCR assays. Applied and
Environmental Microbiology, 2003, 69(5): 2423鄄2429.
[39] 摇 Lin J L, Joye S B, Scholten J C M, Schafer H, McDonald I R, Murrell J C. Analysis of methane monooxygenase genes in Mono Lake suggests that
increased methane oxidation activity may correlate with a change in methanotroph community structure. Applied and Environmental Microbiology,
2005, 71(10): 6458鄄6462.
[40] 摇 McDonald I R, Bodrossy L, Chen Y, Murrell J C. Molecular ecology techniques for the study of aerobic methanotrophs. Applied and Environmental
Microbiology, 2008, 74(5): 1305鄄1315.
[41] 摇 Auman A J, Stolyar S, Costello A M, Lidstrom M E. Molecular characterization of methanotrophic isolates from freshwater lake sediment. Applied
and Environmental Microbiology, 2000, 66(12): 5259鄄5266.
[42] 摇 Horz H P, Yimga M T, Liesack W. Detection of methanotroph diversity on roots of submerged rice plants by molecular retrieval of pmoA, mmoX,
mxaF, and 16S rRNA and ribosomal DNA, including pmoA鄄based terminal restriction fragment length polymorphism profiling. Applied and
Environmental Microbiology, 2001, 67(9): 4177鄄4185.
[43] 摇 Hutchens E, Radajewski S, Dumont M G, McDonald I R, Murrell J C. Analysis of methanotrophic bacteria in movile cave by stable鄄isotope
probing. Environmental Microbiology, 2004, 6(2):111鄄120.
[44] 摇 Meril覿P, Galand P E, Fritze H, Tuittila E S, Kukko鄄oja K, Laine J, Yrj覿l覿 K. Methanogen communities along a primary succession transect of
mire ecosystems. FEMS Microbiology Ecology, 2006, 55(2): 221鄄229.
[45] 摇 Horz H P, Rich V, Avrahami S, Bohannan B J M. Methane鄄oxidizing bacteria in a California upland grassland soil: diversity and response to
simulated global change. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71(5): 2642鄄2652.
[46] 摇 Dettling M D, Yavitt J B, Cadillo鄄Quiroz H, Sun C, Zinder S H. Soil鄄methanogen interactions in two peatlands (bog, fen) in central New York
State. Geomicrobiology Journal, 2007, 24 (3 / 4): 247鄄259.
[47] 摇 Muyzcr G. DGGE / TGGE a method for identifying genes from natural ecosystems. Current opinion Microbiology, 1999, 2(3): 317鄄322.
[48] 摇 Kotsyurbenko O R, Chin K J, Glagolev M V, Stubner S, Simankova M V, Nozhevnikova A N, Conrad R. Acetoclastic and hydrogenotrophic
methane production and methanogenic populations in an acidic West鄄Siberian peat bog. Environmental Microbiology, 2004, 6(11): 1159鄄1173.
[49] 摇 Dedysh S N, Dunfield P F, Derakshani M, Stubner S, Heyer J, Liesack W. Differential detection of type II methanotrophic bacteria in acidic
peatlands using newly developed 16S rRNA鄄targeted fluorescent oligonucleotide probes. FEMS Microbiology Ecology, 2003, 43(3): 299鄄308.
[50] 摇 Kubota K, Ohashi A, Imachi H, Harada H. Visualization of mcr mRNA in a methanogen by fluorescence in situ hybridization with an
oligonucleotide probe and two鄄pass tyramide signal amplification ( two鄄pass TSA鄄FISH). Journal of Microbiological Methods, 2006, 66 (3 ):
521鄄528.
[51] 摇 Galand P E, Fritze H, Yrj覿l覿 K. Microsite鄄dependent changes in methanogenic populations in a boreal oligotrophic fen. Environmental
Microbiology, 2003, 5(11): 1133鄄1143.
[52] 摇 Cadillo鄄Quiroz H, Br覿uer S L, Yashiro E, Sun C, Yavitt J B, Zinder S H. Vertical profiles of methanogenesis and methanogens in two contrasting
acidic peatlands in central New York State, USA. Environmental Microbiology, 2006, 8(8): 1428鄄1440.
[53] 摇 Horn M A, Matthies C, K俟sel K, Schramm A, Drake H L. Hydrogenotrophic methanogenesis by moderately acid鄄tolerant methanogens of a
methane鄄emitting acidic peat. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(1): 74鄄83.
[54] 摇 Basiliko N, Yavitt J B, Dees P M, Merkel S M. Methane biogeochemistry and methanogen communities in two northern peatland ecosystems, New
York State. Geomicrobiology Journal, 2003, 20(6): 563鄄577.
[55] 摇 Utsumi M, Belova S E, King G M, Uchiyama H. Phylogenetic comparison of methanogen diversity in different wetland soils. The Journal of
General and Applied Microbiology, 2003, 49(2): 75鄄83.
[56] 摇 Chauhan A, Reddy K R Ogram A V. Syntrophic鄄archaeal associations in a nutrient鄄impacted freshwater marsh. Journal of Applied Microbiology,
2006, 100(1): 73鄄84.
[57] 摇 Jaatinen K, Tuittila E S, Laine J, Yrjala K, Fritze H. Methane鄄oxidizing bacteria (MOB) in a Finnish raised mire complex: effects of site fertility
and drainage. Microbial Ecology, 2005, 50(3): 429鄄439.
[58] 摇 Morris S A, Radajewski S, Willison T W, Murrell J C. Identification of the functionally active methanotroph population in a peat soil microosm by
stable鄄isotope probing. Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68(3): 1446鄄1453.
[59] 摇 Millera D N, Yavittb J B, Madsena E L, Ghiorsea W C. Methanotrophic activity, abundance, and diversity in forested swamp pools: spatiotemporal
dynamics and influences on methane fluxes. Geomicrobiology Journal, 2004, 21(4): 257鄄271.
[60] 摇 Fisk M C, Ruethe K F, Yavitt J B. Microbial activity and functional composition among northern peatland ecosystems. Soil Biology and
Biochemistry, 2003, 35(4): 591鄄602.
[61] 摇 Edwards C, Hales B A, Hall G H, McDonald I R, Murrell J C, Pickup R, Ritchie D A, Saunders J R, Simon B M, Upton M. Microbiological
processes in the terrestrial carbon cycle: methane cycling in peat. Atmospheric Environment, 1998, 32(19): 3247鄄3255.
[62] 摇 Tuomivirta T T, Yrj覿l覿 K, Fritze H. Quantitative PCR of pmoA using a novel reverse primer with potential methane oxidation in finnish fen.
Research in Microbiology, 2009, 160(10): 751鄄756.
[63] 摇 Smemo K A, Yavitt J B. Evidence for anaerobic CH4 oxidation in freshwater peatlands. Geomicrobiology Journal, 2007, 24(7 / 8): 583鄄597.
5314摇 14 期 摇 摇 摇 佘晨兴摇 等:自然湿地土壤产甲烷菌和甲烷氧化菌多样性的分子检测 摇
ACTA ECOLOGICA SINICA Vol. 31,No. 14 July,2011(Semimonthly)
CONTENTS
The sensitivity of Xiamen忆s three industrial sectors to land use changes HUANG Jing, CUI Shenghui, LI Fangyi, et al (3863)……
Desertification and change of landscape pattern in the Source Region of Yellow River
HU Guangyin, DONG Zhibao, LU Junfeng, et al (3872)
…………………………………………………
…………………………………………………………………………
Comparison of ecological significance of landscape diversity changes in karst mountains: a case study of 4 typical karst area in
Guizhou Province LUO Guangjie, LI Yangbing,WANG Shijie,et al (3882)………………………………………………………
Analysis on urban heat island effect based on the dynamics of urban surface biophysical descriptors XU Hanqiu (3890)……………
Primary exploration on the ecological land use classification in Beijing TANG Xiumei,CHEN Baiming,LU Qingbin,et al (3902)……
Changes of spectral reflectance of Pinus koraiensis and Abies nephrolepis along altitudinal gradients in Changbai Mountain
FAN Xiuhua, LIU Weiguo, LU Wenmin, et al (3910)
……………
……………………………………………………………………………
Biomass allocation patterns and allometric models of Abies nephrolepis Maxim
WANG Jinsong, ZHANG Chunyu, FAN Xiuhua, et al (3918)
…………………………………………………………
……………………………………………………………………
Niche analysis of dominant species of macrobenthic community at a tidal flat of Yushan Island
JIAO Haifeng, SHI Huixiong, YOU Zhongjie, et al (3928)
………………………………………
………………………………………………………………………
The influence of different food qualities on the energy budget and digestive tract morphology of Tree Sparrows passer montanus
YANG Zhihong, SHAO Shuli (3937)
………
………………………………………………………………………………………………
The response of ecosystem service values to ambient environment and its spatial scales in typical karst areas of northwest Guangxi,
China ZHANG Mingyang, WANG Kelin,LIU Huiyu,et al (3947)…………………………………………………………………
Root morphology characteristics under alternate furrow irrigation LI Caixia, SUN Jingsheng, ZHOU Xinguo, et al (3956)……………
Allelopathy of the root exudates from different resistant eggplants to verticillium wilt (Verticillium dahliae Kleb. )
ZHOU Baoli, CHEN Zhixia, DU Liang, et al (3964)
……………………
………………………………………………………………………………
Biological cycle and accumulation of lanthanum in the forage鄄mushroom鄄soil system
WENG Boqi,JIANG Zhaowei,WANG Yixiang, et al (3973)
……………………………………………………
………………………………………………………………………
Evaluation of soil loss and transportation load of adsorption N and P in Poyang Lake watershed
YU Jinxiang, ZHENG Bofu, LIU Yafei, et al (3980)
………………………………………
………………………………………………………………………………
Effects of soil resource availabilities on vertical distribution and dynamics of fine roots in a Caragana korshinskii plantation
SHI Jianwei, WANG Mengben, CHEN Jianwen,et al (3990)
…………
………………………………………………………………………
Effects of soil salinization on ammonia volatilization characteristics of urea and urea phosphate
LIANG Fei, TIAN Changyan (3999)
………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
Distribution of marine bacteria and their environmental factors in Xiangshan Bay
YANG Jifang,WANG Haili, CHEN Fusheng, et al (4007)
………………………………………………………
…………………………………………………………………………
Concentration of O3 at the atmospheric surface affects the changes characters of antioxidant enzyme activities in Triticum aestivum
WU Fangfang, ZHENG Youfei, WU Rongjun, et al (4019)
…
………………………………………………………………………
Effects of inhibitor and safener on enzyme activity and phenanthrene metabolism in root of tall fescue
GONG Shuaishuai, HAN Jin, GAO Yanzheng, et al (4027)
…………………………………
………………………………………………………………………
Screening of highly鄄effective rhizobial strains on Alfalfa (Medicago polymorpha) in soil
LIU Xiaoyun,GUO Zhenguo, LI Qiaoxian, et al (4034)
………………………………………………
……………………………………………………………………………
Geochemical evolution processes of soil major elements in the forest鄄dominated Jinshui River Basin, the upper Hanjiang River
HE Wenming, ZHOU Jie, ZHANG Changsheng, et al (4042)
………
……………………………………………………………………
Integrating geographic features and weather data for methodology of rasterizing spring maize growth stages
LIU Qin,YAN Changrong, MEI Xurong, et al (4056)
……………………………
………………………………………………………………………………
A model for predicting flowering date and external quality of cut tulip in solar greenhouse
LI Gang,CHEN Yaru,DAI Jianfeng,et al (4062)
……………………………………………
……………………………………………………………………………………
Moisture effect analysis of pumpkin and oil sunflower intercropping in semi鄄arid area of northwest Hebei Province
HUANG Wei,ZHANG Junhua,LI Wenhong,et al (4072)
……………………
…………………………………………………………………………
Review and Monograph
Theoretical backgrounds and recent advances in avian molecular phylogeography DONG Lu, ZHANG Yanyun (4082)………………
A review on spatial attributes of nature reserves and optimal site鄄selection methods WANG Yicheng (4094)…………………………
Human activities are the principle cause of biotic homogenization CHEN Guoqi, QIANG Sheng (4107)………………………………
Factors influencing the occurrence of Ophiocordyceps sinensis ZHANG Guren, YU Junfeng, WU Guangguo, et al (4117)……………
Molecular detection of diversity of methanogens and methanotrophs in natural wetland soil SHE Chenxing, TONG Chuan (4126)……
Scientific Note
Soil quality assessment of continuous cropping cotton fields for different years in a typical oasis in the upper reaches of the Tarim
River GONG Lu, ZHANG Haifeng, L譈 Guanghui, et al (4136)…………………………………………………………………
Dynamics of microbial biomass during litter decomposition in the alpine forest
ZHOU Xiaoqing, WU Fuzhong, YANG Wanqin, et al (4144)
…………………………………………………………
……………………………………………………………………
The aerodynamic roughness length of biologicalsoil crusts:a case study of Gurbantunggut Desert
WANG Xueqin, ZHANG Yuanming, ZHANG Weimin, et al (4153)
………………………………………
………………………………………………………………
Differences among population quantities and community structures of pests and their natural enemies in tea gardens of different
altitudes KE Shengbing, DANG Fenghua, BI Shoudong, et al (4161)……………………………………………………………
2009 年度生物学科总被引频次和影响因子前 10 名期刊绎
(源于 2010 年版 CSTPCD数据库)
排序
Order
期刊
Journal
总被引频次
Total citation
排序
Order
期刊
Journal
影响因子
Impact factor
1 生态学报 11764
2 应用生态学报 9430
3 植物生态学报 4384
4 西北植物学报 4177
5 生态学杂志 4048
6 植物生理学通讯 3362
7
JOURNAL OF INTEGRATIVE
PLANT BIOLOGY
3327
8 MOLECULAR PLANT 1788
9 水生生物学报 1773
10 遗传学报 1667
1 生态学报 1. 812
2 植物生态学报 1. 771
3 应用生态学报 1. 733
4 生物多样性 1. 553
5 生态学杂志 1. 396
6 西北植物学报 0. 986
7 兽类学报 0. 894
8 CELL RESEARCH 0. 873
9 植物学报 0. 841
10 植物研究 0. 809
摇 绎《生态学报》 2009 年在核心版的 1964 种科技期刊排序中总被引频次 11764 次,全国排名第 1; 影响因
子 1郾 812,全国排名第 14;第 1—9 届连续 9 年入围中国百种杰出学术期刊; 中国精品科技期刊
摇 摇 编辑部主任摇 孔红梅摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 执行编辑摇 刘天星摇 段摇 靖
生摇 态摇 学摇 报
(SHENGTAI摇 XUEBAO)
(半月刊摇 1981 年 3 月创刊)
第 31 卷摇 第 14 期摇 (2011 年 7 月)
ACTA ECOLOGICA SINICA
摇
(Semimonthly,Started in 1981)
摇
Vol郾 31摇 No郾 14摇 2011
编摇 摇 辑摇 《生态学报》编辑部
地址:北京海淀区双清路 18 号
邮政编码:100085
电话:(010)62941099
www. ecologica. cn
shengtaixuebao@ rcees. ac. cn
主摇 摇 编摇 冯宗炜
主摇 摇 管摇 中国科学技术协会
主摇 摇 办摇 中国生态学学会
中国科学院生态环境研究中心
地址:北京海淀区双清路 18 号
邮政编码:100085
出摇 摇 版摇
摇 摇 摇 摇 摇 地址:北京东黄城根北街 16 号
邮政编码:100717
印摇 摇 刷摇 北京北林印刷厂
发 行摇
地址:东黄城根北街 16 号
邮政编码:100717
电话:(010)64034563
E鄄mail:journal@ cspg. net
订摇 摇 购摇 全国各地邮局
国外发行摇 中国国际图书贸易总公司
地址:北京 399 信箱
邮政编码:100044
广告经营
许 可 证摇 京海工商广字第 8013 号
Edited by摇 Editorial board of
ACTA ECOLOGICA SINICA
Add:18,Shuangqing Street,Haidian,Beijing 100085,China
Tel:(010)62941099
www. ecologica. cn
Shengtaixuebao@ rcees. ac. cn
Editor鄄in鄄chief摇 FENG Zong鄄Wei
Supervised by摇 China Association for Science and Technology
Sponsored by摇 Ecological Society of China
Research Center for Eco鄄environmental Sciences, CAS
Add:18,Shuangqing Street,Haidian,Beijing 100085,China
Published by摇 Science Press
Add:16 Donghuangchenggen North Street,
Beijing摇 100717,China
Printed by摇 Beijing Bei Lin Printing House,
Beijing 100083,China
Distributed by摇 Science Press
Add:16 Donghuangchenggen North
Street,Beijing 100717,China
Tel:(010)64034563
E鄄mail:journal@ cspg. net
Domestic 摇 摇 All Local Post Offices in China
Foreign 摇 摇 China International Book Trading
Corporation
Add:P. O. Box 399 Beijing 100044,China
摇 ISSN 1000鄄0933CN 11鄄2031 / Q 国内外公开发行 国内邮发代号 82鄄7 国外发行代号 M670 定价 70郾 00 元摇