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摇 摇 摇 摇 摇 生 态 学 报
摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 (SHENGTAI XUEBAO)
摇 摇 第 32 卷 第 17 期摇 摇 2012 年 9 月摇 (半月刊)
目摇 摇 次
基于生物生态因子分析的长序榆保护策略 高建国,章摇 艺,吴玉环,等 (5287)…………………………………
闽江口芦苇沼泽湿地土壤产甲烷菌群落结构的垂直分布 佘晨兴,仝摇 川 (5299)………………………………
涡度相关观测的能量闭合状况及其对农田蒸散测定的影响 刘摇 渡,李摇 俊,于摇 强,等 (5309)………………
地下滴灌下土壤水势对毛白杨纸浆林生长及生理特性的影响 席本野,王摇 烨,邸摇 楠,等 (5318)……………
绿盲蝽危害对枣树叶片生化指标的影响 高摇 勇,门兴元,于摇 毅,等 (5330)……………………………………
湿地资源保护经济学分析———以北京野鸭湖湿地为例 王昌海,崔丽娟,马牧源,等 (5337)……………………
湿地保护区周边农户生态补偿意愿比较 王昌海,崔丽娟,毛旭锋,等 (5345)……………………………………
湿地翅碱蓬生物量遥感估算模型 傅摇 新,刘高焕,黄摇 翀,等 (5355)……………………………………………
增氮对青藏高原东缘典型高寒草甸土壤有机碳组成的影响 郑娇娇,方华军,程淑兰,等 (5363)………………
大兴安岭 2001—2010 年森林火灾碳排放的计量估算 胡海清,魏书精,孙摇 龙 (5373)…………………………
基于水分控制的切花百合生长预测模型 董永义,李摇 刚,安东升,等 (5387)……………………………………
极端干旱区增雨加速泡泡刺群落土壤碳排放 刘殿君,吴摇 波,李永华,等 (5396)………………………………
黄土丘陵区土壤有机碳固存对退耕还林草的时空响应 许明祥,王摇 征,张摇 金,等 (5405)……………………
小兴安岭 5 种林型土壤呼吸时空变异 史宝库,金光泽,汪兆洋 (5416)…………………………………………
疏勒河上游土壤磷和钾的分布及其影响因素 刘文杰,陈生云,胡凤祖,等 (5429)………………………………
COI1 参与茉莉酸调控拟南芥吲哚族芥子油苷生物合成过程 石摇 璐,李梦莎,王丽华,等 (5438)……………
Gash模型在黄土区人工刺槐林冠降雨截留研究中的应用 王艳萍,王摇 力,卫三平 (5445)……………………
三峡水库消落区不同海拔高度的植物群落多样性差异 刘维暐,王摇 杰,王摇 勇,等 (5454)……………………
基于 SPEI的北京低频干旱与气候指数关系 苏宏新,李广起 (5467)……………………………………………
山地枣树茎直径对不同生态因子的响应 赵摇 英,汪有科,韩立新,等 (5476)……………………………………
幼龄柠条细根的空间分布和季节动态 张摇 帆,陈建文,王孟本 (5484)…………………………………………
山西五鹿山白皮松群落乔灌层的种间分离 王丽丽,毕润成,闫摇 明,等 (5494)…………………………………
长期施肥对玉米生育期土壤微生物量碳氮及酶活性的影响 马晓霞,王莲莲,黎青慧,等 (5502)………………
基于归一化法的小麦干物质积累动态预测模型 刘摇 娟,熊淑萍,杨摇 阳,等 (5512)……………………………
上海环城林带景观美学评价及优化策略 张凯旋,凌焕然,达良俊 (5521)………………………………………
旅游风景区旅游交通系统碳足迹评估———以南岳衡山为例 窦银娣,刘云鹏,李伯华,等 (5532)………………
一种城市生态系统现状评价方法及其应用 石惠春,刘摇 伟,何摇 剑,等 (5542)…………………………………
黄海中南部细纹狮子鱼的生物学特征及资源分布的季节变化 周志鹏,金显仕,单秀娟,等 (5550)……………
蓝藻堆积和螺类牧食对苦草生长的影响 何摇 虎,何宇虹,姬娅婵,等 (5562)……………………………………
黑龙江省黄鼬冬季毛被分层结构及保温功能 柳摇 宇,张摇 伟 (5568)……………………………………………
虎纹蛙选择体温和热耐受性在个体发育过程中的变化 樊晓丽,雷焕宗,林植华 (5574)………………………
水丝蚓对太湖沉积物有机磷组成及垂向分布的影响 白秀玲,周云凯,张摇 雷 (5581)…………………………
专论与综述
城市绿地生态评价研究进展 毛齐正,罗上华,马克明,等 (5589)…………………………………………………
全球变化背景下生态学热点问题研究———第二届“国际青年生态学者论坛冶
万摇 云,许丽丽,耿其芳,等 (5601)
…………………………………
……………………………………………………………………………
研究简报
雅鲁藏布江高寒河谷流动沙地适生植物种筛选和恢复效果 沈渭寿,李海东,林乃峰,等 (5609)………………
学术信息与动态
生态系统服务时代的来临———第五届生态系统服务伙伴年会述评 吕一河,卫摇 伟,孙然好 (5619)…………
期刊基本参数:CN 11鄄2031 / Q*1981*m*16*334*zh*P* ￥ 70郾 00*1510*36*
室室室室室室室室室室室室室室
2012鄄09
封面图说: 带雏鸟的白枕鹤一家———白枕鹤是一种体型略小于丹顶鹤的优美的鹤。 体羽蓝灰色,腹部较深,背部较浅,脸颊两
侧红色,头和颈的后部及上背为白色,雌雄相似。 其虹膜暗褐色,嘴黄绿色,脚红色。 白枕鹤常常栖息于开阔平原芦
苇沼泽和水草沼泽地带,有时亦出现于农田和海湾地区,尤其是迁徙季节。 主要以植物种子、草根、嫩叶和鱼、蛙、软
体动物、昆虫等为食。 繁殖区在我国北方和西伯利亚东南部。 我国白枕鹤多在黑龙江、吉林、内蒙古繁殖,与丹顶鹤
的繁殖区几乎重叠,为国家一级保护动物。
彩图提供: 陈建伟教授摇 北京林业大学摇 E鄄mail: cites. chenjw@ 163. com
第 32 卷第 17 期
2012 年 9 月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol. 32,No. 17
Sep. ,2012
http: / / www. ecologica. cn
基金项目:国家自然科学基金资助项目(41071148);福建省自然科学基金资助项目(2011J01143)
收稿日期:2012鄄03鄄05; 摇 摇 修订日期:2012鄄06鄄28
*通讯作者 Corresponding author. E鄄mail: tongch@ fjnu. edu. cn
DOI: 10. 5846 / stxb201203050299
佘晨兴,仝川.闽江口芦苇沼泽湿地土壤产甲烷菌群落结构的垂直分布.生态学报,2012,32(17):5299鄄5308.
She C X, Tong C. Vertical distribution of methanogen community structures in Phragmites australis marsh soil in the Min River estuary. Acta Ecologica
Sinica,2012,32(17):5299鄄5308.
闽江口芦苇沼泽湿地土壤产甲烷菌
群落结构的垂直分布
佘晨兴1,2,仝 川2,*
(1. 福建师范大学环境科学与工程学院, 福州摇 350007;
2. 湿润亚热带生态鄄地理过程省部共建教育部重点实验室, 福建师范大学亚热带湿地研究中心, 福州摇 350007)
摘要:应用 PCR鄄RFLP 技术及测序分析对闽江口芦苇湿地土壤产甲烷菌群落结构的垂直分布特征进行了研究。 在构建的 6 个
克隆文库中,每个克隆文库随机挑选 100 个克隆进行菌落 PCR验证,共得到 591 个阳性克隆。 PCR产物经限制性内切酶 Msp玉
进行 RFLP 分析后得到 37 个不同的分类操作单元(OTUs)。 对 37 个克隆子进行了序列测定,与 GenBank数据库中的序列进行
比对,最近相似性在 91%—99%之间。 RFLP 分析和系统发育分析表明,闽江口芦苇湿地土壤中产甲烷菌群落包括 3 大类群:
甲烷杆菌目(Methanobacteriales)、甲烷微菌目(Methanomirobiales) 和甲烷八叠球菌目(Methanosarcinales)。 不同土壤深度中产
甲烷菌群落的分布呈现出不同的特征。 土壤表层(0—10 cm)优势产甲烷菌类群为 Methanoregula,约占 76% ;10—20 cm 土层主
要的产甲烷菌类群为 Methanolinea 和 Methanoregula,分别约占 23% 和 29% ; 20—30cm 土层优势的产甲烷菌类群为
Methanolinea,约占 66% 。 Shannon指数(H 忆)和 Simpson 多样性指教(D)表明,10—20cm 土层产甲烷菌多样性高于土壤表层
(0—10 cm)和 20—30 cm 土层。 37 个测序 OTUs中有 26 个 OTUs属于不可培养的产甲烷菌序列,表明闽江口芦苇湿地土壤中
存在大量不可培养的产甲烷菌。
关键词:产甲烷菌;群落结构;垂直分布;PCR鄄RFLP;芦苇湿地
Vertical distribution of methanogen community structures in Phragmites australis
marsh soil in the Min River estuary
SHE Chenxing1, 2, TONG Chuan2,*
1 College of Environmental Science and Engineering, Fujian Normal University, Fuzhou 350007, China
2 Key Laboratory of Humid Subtropical Eco鄄geographical Process of Ministry of Education, Research Centre of Wetlands in Subtropical Region, Fujian Normal
University, Fuzhou 350007, China
Abstract: Methane is one of the most important greenhouse gases and plays an essential role in atmospheric chemistry. The
largest single source of methane is natural wetlands, which have been suggested to contribute significantly to the interannual
variability of global methane emissions. Methanogens are one of the main functional microbial groups mediating methane
cycles of natural wetlands. Biogenic methane is produced by methanogenic archaea or methanogens as the final step in
anaerobic degradation of organic matter. It is evident that the studies on the diversity of methanogens can assist with
revealing microbial鄄mediated methane cycles and the temporal鄄spatial heterogeneity of methane emission from natural
wetlands. Traditional methods based on laboratory culture techniques have been proven inadequate to describe the vast
microbial diversity, because those methods miss more than 99% of the organisms. Molecular methods independent of
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culture techniques has vastly improved the potential to describe microbial diversity. Both phylogenetic (16S rRNA gene)
and functional genes can be used as molecular markers in the study of methanogens. Methyl鄄coenzyme M reductase (MCR)
is a vital enzyme in methane production, and the mcrA gene coding for a subunit of MCR has been employed as a specific
marker for the detection and differentiation of methanogen communities. Sequence鄄based mcrA phylogeny is consistent with
the 16S rRNA鄄based phylogeny. Thus, the mcrA gene is a favorable functional gene and widely used to detect methanogens
in soils of natural wetlands. To understand the key factors affecting methane production, the variation in community
structure of methanogenic archaea in the soils from different depths was investigated using PCR鄄RFLP technique and
sequence analysis in the Phragmites australis marsh soil in the Min River estuary. One hundred clones were randomly
chosen from each clone library to examine by Colony PCR. A total of 591 positive clones were determinately contained
mcrA. The PCR鄄RFLP analysis showed that 591 positive clones were classified into 37 different operational taxonomic units
(OTUs). 37 clones were chosen to sequence and compared with sequences in the GenBank database, the most similarity is
between 91%—99% . RFLP analysis and phylogenetic analysis showed that the communities of methanogens in the P.
australis marsh soil could be subdivided into three groups which are Methanobacteriales, Methanomirobiales and
Methanosarcinales. The distribution of methanogens community in the different depths showed different feature. The
dominant group in the soil surface layer (0—10 cm) was Methanoregula, accounting for 76% of total methanogens. The
main groups present in the 10—20 cm soil layer were Methanolinea and Methanoregula which account for 23% and 29% of
total methanogens, respectively. In the 20—30 cm soil layers, the dominant group was Methanolinea which account for
66% of total methanogens. Shannon index ( H忆 ) and Simpson diversity index ( D ) showed that the diversity of
methanogens in the 10—20 cm soil layer was higher than that in other two layers. In addition, 26 OTUs in the 37
sequenced clones were belongs to the uncultured methanogens, which suggested that there exist a large number of
uncultured methanogens in the P. australis marsh soil in the Min River estuary.
Key Words: methanogens;community structure;vertical distribution; PCR鄄RFLP;Phragmites australis marsh
作为水陆相互作用形成的独特生态系统,自然湿地虽然只占地球陆地表面很小的部分,却是大气中甲烷
(CH4)的重要来源之一,估计每年释放量约为 100—231 Tg,对全球气候变化影响巨大[1 ]。 甲烷产生是甲烷
代谢或称厌氧碳循环中的关键环节之一[2 ]。 在自然湿地土壤中,产甲烷菌和其他细菌形成一种特殊的互营
关系,持续降解生物质并接受末端电子产生甲烷。 因此,产甲烷菌是介导自然湿地土壤中甲烷循环重要的功
能菌群之一。 深入探索自然湿地产甲烷菌的多样性有助于正确评估自然湿地甲烷的代谢循环和排放通量变
化,为人类最终有效调控湿地甲烷代谢,减少甲烷排放通量提供科学基础。
甲基辅酶 M还原酶(methyl coenzyme鄄M reductase,MCR)是甲烷产生过程中的关键酶,是产甲烷菌特有的
酶[3 ]。 亚基(mcrA)基因可作为检测和区分产甲烷菌的独特分子标记,是研究分析产甲烷菌最有潜力的手段
之一,目前已广泛应用于自然湿地土壤中产甲烷菌多样性的检测[4鄄9]。 先前一些研究显示自然湿地土壤中产
甲烷菌的群落结构随深度变化而变化[9鄄12]。 但是,目前国际上对于热带和亚热带河口潮汐沼泽湿地土壤产甲
烷菌群落结构垂直分布的研究鲜见报道[12]。 仝川等报道了闽江河口鳝鱼滩湿地甲烷排放通量[13鄄15],但还未
见关于闽江口潮汐沼泽湿地甲烷代谢相关功能菌群的研究报道。 本研究以功能基因 mcrA 为分子标记,通过
PCR鄄RFLP 技术和测序相结合的方法分析了闽江口芦苇湿地土壤产甲烷菌群落结构的垂直分布和系统发育,
为进一步研究河口湿地甲烷的代谢循环和排放通量变化提供基础资料。
1摇 材料与方法
1. 1摇 采样区域与土壤样品采集
鳝鱼滩湿地(119毅34忆12义—119毅40忆40义 E、26毅00忆36义—26毅03忆42义 N)位于闽江口下游入海口, 面积 3120
hm2。 气候暖热湿润,年均降水日 153 d,年均降水量 1 346mm,发生在 3—9月[16]。 潮汐属典型的半日潮。 鳝
0035 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 32 卷摇
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鱼滩西部从潮上带到潮下带分布的植被依次为芦苇(Phragmites australis)、短叶茳芏(Cyperus malaccensis Lam.
var. brevifolius Bocklr)和藨草(Scirpus triqueter)。 2011 年 5 月,土壤样品采集于闽江口鳝鱼滩湿地西部靠近堤
岸分布的的芦苇沼泽带,在该芦苇带的中间地段设置一个平行于堤岸的样线,并在该样线上选择 A、B 两个样
点(距离为 5 m),对于 2 个样点均取 0—10 cm、10—20 cm、20—30 cm 三个深度的土壤样品(共 6 个土样)。
样品采集后,迅速装入灭菌的封口聚乙烯袋中,并置于冰盒中尽快送至实验室,进行 DNA提取和后续分析。
1. 2摇 土壤总 DNA的提取
0. 25 g土壤采用 Power Soil DNA isolation kit(MO BIO Laboratories, USA),按厂家操作说明书的方法进行
土壤总 DNA的提取和纯化。 DNA纯度和浓度通过紫外分光光度计 (NanoDrop, USA)进行检测,收集的 DNA
样品在分析和 PCR扩增之前存于-20 益备用。
1. 3摇 mcrA基因的扩增及纯化
以提取的土壤总 DNA为模板用于扩增大约 760 bp 的 mcrA 基因片段,扩增引物采用产甲烷菌的特异性
引物 ME1 (GCMATGCARATHGGWATGTC)和 ME2 ( TCATKGCRTAGTTDGGRTAGT) [17]。 引物由上海英骏
(Invitrogen)生物技术有限公司合成。 PCR反应体系为 50 滋L:10伊PCR缓冲液 5 滋L,dNTP 4 滋L,引物各 1 滋L,
0. 5 滋L rTaq酶,DNA模板 1 滋L,加灭菌的 ddH2O至 50 滋L。
PCR反应条件:94 益预变性 5 min;94 益变性 45 S,50 益退火 45 S,72 益延伸 90 S,30 个循环;最后 72 益
延伸 7 min。 扩增的 PCR反应产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测,在紫外灯下切下含目的 DNA 片断的凝胶条
带,用琼脂糖凝胶 DNA纯化试剂盒 Agarose Gel DNA Purification Kit(Promega,USA),按厂家说明书的方法进
行 mcrA基因的回收纯化。
1. 4摇 构建 mcrA基因克隆文库
纯化后的 mcrA基因片段按厂家说明书的方法与 pMD 18鄄T vector(Takara,Japan)连接。 连接体系为:pMD
18鄄Tvector1滋L,目的基因 2 滋L,灭菌的 ddH2O 2 滋L,Solution I 5 滋L,总体积 10 滋L。 16 益过夜连接后,转化入
E. coli DH5琢感受态细胞。 转化产物涂布到含有氨苄青霉素(Ampicillin) / IPTG / X鄄Gal的 LB 固体培养基上,
37 益下培养 16—24 h,通过蓝白斑筛选方法筛选重组子,白色克隆子即为阳性转化子。 挑取阳性转化子构建
克隆文库,克隆文库用 LB(Amp+)平板 4 益保藏。
1. 5摇 mcrA基因克隆文库的 RFLP 分析和测序
为检查整个克隆文库的有效性,在所构建的各个克隆文库中随机挑取 100 个白色克隆子进行菌落 PCR
验证。 按照厂家说明书的方法对阳性克隆的 PCR 产物进行 MspI( Takara, Japan)酶切。 酶切体系 10 滋L:
PCR产物 4 滋L;10伊T Buffer 1滋L;0. 1% BSA 1 滋L;限制性内切酶 MspI 0. 5 滋L,灭菌的 ddH2O补充至 10 滋L。
37 益酶切 4 h。 酶切消化产物用 2%的琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段,凝胶成像仪采集照片。 酶切图谱完全
一样的作为一个操作分类单位(operational taxonomic unit,OTU)。 分析酶切谱型,将具有不同谱型的克隆进行
测序。 测序反应由上海英俊生物技术有限公司(Invitrogen,上海)完成。
1. 6摇 多样性分析的相关指数
根据文库酶切分析结果计算克隆文库的库容 C 并进行多样性的分析,多样性指数包括带型、克隆数、
Shannon多样性指数(H 忆)和 Simpson多样性指教(D)。 库容 C计算公式[18]如下:
C=(l-nl / N)伊100%
式中,N代表 mcrA克隆文库总克隆数,nl代表在文库仅出现 1 次的 OTU 的数量。 Shannon 多样性指数(H 忆)
和 Simpson多样性指教(D)采用 Bio鄄dap软件进行计算分析。
1. 7摇 mcrA基因的序列分析和系统发育树的构建
将克隆对应的每一个 mcrA基因序列与 GenBank数据库中已知序列进行 BLAST比较,鉴定与克隆序列亲
缘关系最近的种属。 并从数据库中获取相关的 mcrA 基因序列,采用 Clustal X Version 1. 83 软件进行多重比
对,用 MEGA4 软件包[19]中的 Neighbor鄄Joining法,设自展值为 1000 次,构建系统发育树。
1035摇 17 期 摇 摇 摇 佘晨兴摇 等:闽江口芦苇沼泽湿地土壤产甲烷菌群落结构的垂直分布 摇
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2摇 结果与分析
2. 1摇 土壤总 DNA的提取及 mcrA基因的扩增
摇 摇 6 个土壤样品经提取纯化后的 DNA 溶液为无色,其 A260 / A280 值均在 1. 75 以上(表 1),表明提取的
DNA纯度较高,满足下一步 PCR对于模板的要求。 以提取的总 DNA 为模板可以扩增出长度约 760 bp 左右
的 DNA片段,条带较亮,且无其他长度的条带,与所设计的目标片段(760 bp)结果一致(图 1)。
表 1摇 闽江口芦苇湿地土壤总 DNA的提取结果
Table 1摇 Total DNA extraction from the P. australis marsh soil in the Min River estuary
深度 / cm
Depth
A采样点 Sampling Point A
DNA浓度 / (ng / 滋L)
DNA concentration A260 / A 280 A260 / A 230
B采样点 Sampling Point B
DNA浓度 / (ng / 滋L)
DNA concentration A260 / A 280 A260 / A 230
0—10 29. 4 1. 81 1. 92 30. 4 1. 77 1. 83
10—20 19. 2 1. 76 1. 69 16. 2 1. 75 1. 77
20—30 9. 8 1. 78 1. 76 13. 9 1. 77 1. 74
图 1摇 6 个土壤样品 mcrA基因的 PCR扩增
Fig. 1摇 PCR amplification of mcrA genes from 6 soil samples
2. 2摇 mcrA基因克隆文库的构建及 PCR鄄RFLP 分析
构建的 6 个 mcrA 基因克隆文库经菌落 PCR 验证
共检测到 591 个阳性克隆,阳性率为 98. 5% 。 阳性克
隆的 PCR产物用限制性内切酶Msp I 进行酶切鉴定,共
得到 37 种不同的分类操作单位(OTUs) (编号:OTU1-
OTU37),部分酶切图谱如图 2 所示。 6 个克隆文库的
RFLP 分析结果见表 2、表 3。 在 LA1、LA2、LA3 克隆文
库中分别检测到 17、28、15 种不同的分类操作单位
(OTUs),在 LB1、LB2、LB3 克隆文库中分别检测到 16、
27、14 种不同的分类操作单位(OTUs)。 结果表明,A
和 B两个平行采样点不同土壤深度中的酶切类型数随
深度变化均呈现出一定的空间变异规律,即土壤中层
(10—20 cm)的酶切类型数均高于土壤表层 (0—10
cm)和深层(20—30 cm)的酶切类型数。 从图 3 可以看出,在 LA1 文库中,OTU鄄 11、OTU鄄 25、OTU鄄 32、OTU鄄 35
为主要的酶切类型;在 LA2 文库中,OTU鄄 15、OTU鄄 22、OTU鄄 34、OTU鄄 35 为主要的酶切类型;在 LA3 文库中,
OTU鄄20、OTU鄄22、OTU鄄34 为主要的酶切类型。 在 LB1 文库中,主要的酶切类型为 OTU鄄 28、OTU鄄 32、OTU鄄 35、
OTU鄄36;在 LB2 文库中,主要的酶切类型为 OTU鄄15、OTU鄄22、OTU鄄23、OTU鄄35;在 LB3 文库中,主要的酶切类
型为 OTU鄄10、OTU鄄22、OTU鄄34。 从表 3 可以看出,A、B两个样点同一土壤深度的主要酶切类型基本一致,但
同一样点不同土壤深度主要酶切类型则区别较大,这可能与不同土壤深度产甲烷菌所处的微环境有关,包括
生物因素和非生物因素对其组成的影响。
根据库容公式计算得出 6 个文库的库容值均在 88%以上,显然,即使不考虑 PCR等其他因素的影响,文
库也无法包括环境中所有微生物种类即达到 100%这一指标,因此,说明本文库的覆盖程度已经较高,文库能
够比较真实代表该湿地土壤中产甲烷菌的群落结构多样性。 Shannon 多样性指数(H 忆)和 Simpson 多样性指
教(D)计算结果(表 2)显示,土壤中层(10—20 cm)产甲烷菌的 Shannon 指数(H忆)平均约为 2. 81,土壤表层
(0—10 cm)和深层(20—30 cm)的 Shannon指数(H忆)平均分别约为 2. 25 和 1. 76,表明土壤中层(10—20 cm)
产甲烷菌的多样性高于其它两层,而表层(0—10 cm)产甲烷菌的多样性略高于深层(20—30 cm)。 Simpson
多样性指教(D)同样表明土壤中层产甲烷菌的多样性高于其它两层。
2035 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 32 卷摇
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图 2摇 阳性克隆子的 Msp I酶切图谱(部分)
Fig. 2摇 mcrA genes of positive clones digested by Msp玉(partial)
表 2摇 闽江口芦苇湿地土壤 6 个克隆文库的 RFLP分析
Table 2摇 RFLP analysis of 6 clone libraries from the P. australis marsh soil in the Min River estuary
克隆文库
Clone library
阳性克隆数
Number of
positive clones
酶切类型数
Total number
of phylotypes
单一克隆的
酶切类型数
Number of
single phylotype
香农鄄威纳指数
Shannon鄄Weiner
index(H忆)
辛普森指数
Simpson index
(D)
库容(C)
Coverage(C)
LA1(0—10cm) 99 17 7 2. 28 0. 128 92. 9%
LA2(10—20cm) 100 28 12 2. 86 0. 073 88. 0%
LA3(20—30cm) 98 15 6 1. 69 0. 314 93. 8%
LB1(0—10cm) 98 16 7 2. 23 0. 130 92. 8%
LB2(10—20cm) 99 27 11 2. 81 0. 077 88. 8%
LB3(20—30cm) 97 14 5 1. 76 0. 280 94. 8%
表 3摇 6 个克隆文库的主要酶切类型及其克隆子个数
Table 3摇 Main RFLP patterns of 6 clone libraries and their number of clones
克隆文库
Clone library
阳性克隆数
Number of positive clones
主要酶切类型及其克隆子个数(OTU)
Main RFLP patterns and their number of clones
LA1(0—10cm) 99 OTU鄄11(13)、OTU鄄25(19)、OTU鄄32(24)、OTU鄄35(10)
LA2(10—20cm) 100 OTU鄄15(11)、OTU鄄22(10)、OTU鄄34(12)、OTU鄄35(18)
LA3(20—30cm) 98 OTU鄄20(10)、OTU鄄22(52)、OTU鄄34(15)
LB1(0—10cm) 98 OTU鄄28(14)、OTU鄄32(13)、OTU鄄35(24)、OTU鄄36(16)
LB2(10—20cm) 99 OTU鄄15(10)、OTU鄄22(15)、OTU鄄23(12)、OTU鄄35(16)
LB3(20—30cm) 97 OTU鄄10(14)、OTU鄄22(48)、OTU鄄34(12)
2. 3摇 mcrA基因测序和系统发育分析
对于每一独特的分类操作单位(OTUs)选取一单克隆(克隆子编号:LW鄄1—LW鄄37)送上海英俊生物技术
有限公司(Invitrogen,上海)测序分析,将测得的序列与 GenBank 中已知序列进行相似性比对,最近相似性在
91%—99%之间,其结果如表 4 所示。 在 37 个测序结果中,35. 1%的克隆序列与数据库中提交的序列相似性
在 97%以上,64. 9%的序列与数据库中提交的序列相似性介于 90%—97%之间。 37 个测序的 OTUs 中有 26
个 OTUs属于不可培养的产甲烷菌 mcrA序列,这从一个侧面反映了闽江口芦苇湿地土壤样品中存在大量不
可培养的产甲烷菌。
根据克隆子测序结果和聚类同源性分析(图 4)比较发现,闽江口芦苇湿地土壤中产甲烷菌可以聚成 3 大类
群:甲烷杆菌目(Methanobacteriales)、甲烷微菌目(Methanomirobiales) 和甲烷八叠球菌目(Methanosarcinales) ,包
3035摇 17 期 摇 摇 摇 佘晨兴摇 等:闽江口芦苇沼泽湿地土壤产甲烷菌群落结构的垂直分布 摇
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图 3摇 6 个克隆文库酶切类型的百分比
Fig. 3摇 Percentage of RFLP patterns of 6 clone libraries
括 Methanoregula、甲烷绳菌属(Methanolinea)、甲烷螺菌
属(Methanospirillum)、甲烷盘菌属(Methanoplanus)、甲
烷囊菌属(Methanoculleus)、甲烷杆菌属(Methanobacteri鄄
um)和甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)等 7 个属。 产
甲烷菌的群落结构分布呈现出空间变异的特征,土壤表
层(0—10 cm)占优势的类群为 Methanoregula,约占
67% ;土壤中层(10—20 cm)种类增加,主要优势类群
为:Methanolinea 和 Methanoregula,分别约占 23% 和
29% ;而深层(20—30 cm)种类数有所下降,主要优势
类群为 Methanolinea,约占 63% 。
表 4摇 已测序克隆子的鉴定结果
Table 4摇 Identification results of sequenced clones
克隆子编号 所属类型 最相似序列及其 GenBank登录号 相似度 / %
Clone Group Closest NCBI match and their Genbank Accession Identity
LW鄄1 Methanobacterium Uncultured archaeon clone: 1327C22鄄14(AB525698) 96
LW鄄2 Methanobacterium Uncultured archaeon clone Contig_27(JQ283398) 98
LW鄄3 Methanosarcina Uncultured methanogenic archaeon clone BOT_ME_23(JQ245849) 97
LW鄄4 Methanosarcina Uncultured methanogenic archaeon clone BOT_ME_23(JQ245849) 99
LW鄄5 Methanospirillum Methanospirillum lacunae(AB517988) 95
LW鄄6 Methanoplanus Uncultured archaeon clone MV1_10_4_C08(GU447200) 94
LW鄄7 Methanoplanus Methanoplanus petrolearius DSM 11571(CP002117) 92
LW鄄8 Methanoculleus Uncultured archaeon clone TopMcrA54(EU681942) 97
LW鄄9 Methanoculleus Uncultured archaeon clone TopMcrA54(EU681942) 99
LW鄄10 Methanolinea Uncultured methanogenic archaeon clone TOP_ME_3(JQ245809) 93
LW鄄11 Methanoregula Uncultured methanogenic archaeon clone BOT_ME_13(JQ245847) 97
LW鄄12 Methanolinea Methanolinea sp. TNR(AB496719) 91
LW鄄13 Methanolinea Uncultured archaeon clone TopMcrA3(EU681935) 94
LW鄄14 Methanolinea Uncultured methanogenic archaeon clone BOT_ME_26(JQ245851) 97
LW鄄15 Methanolinea Uncultured methanogenic archaeon clone BOT_ME_26(JQ245851) 96
LW鄄16 Methanolinea Methanolinea sp. TNR(AB496719) 93
LW鄄17 Methanolinea Methanolinea sp. TNR(AB496719) 95
LW鄄18 Methanolinea Methanolinea sp. TNR(AB496719) 94
LW鄄19 Methanolinea Methanolinea sp. TNR(AB496719) 95
LW鄄20 Methanolinea Methanolinea sp. TNR(AB496719) 95
LW鄄21 Methanolinea Methanolinea sp. TNR(AB496719) 95
LW鄄22 Methanolinea Methanolinea sp. TNR(AB496719) 98
LW鄄23 Methanoregula Uncultured archaeon clone LMmcrA6(EF210720) 94
LW鄄24 Methanoregula Uncultured archaeon clone LMmcrA8(EF210723) 93
LW鄄25 Methanoregula Uncultured euryarchaeote(FJ952140) 95
LW鄄26 Methanoregula Uncultured archaeon clone M1(JN106045) 98
LW鄄27 Methanoregula Uncultured archaeon clone MOBPc433073(AM942113) 93
LW鄄28 Methanoregula Uncultured archaeon clone MOBOcr43968(AM942093) 95
LW鄄29 Methanoregula Uncultured archaeon clone mcrA3(FJ640797) 96
LW鄄30 Methanoregula Uncultured archaeon clone mcrA3(FJ640797) 95
LW鄄31 Methanoregula Uncultured methanogenic archaeon clone TOP_ME_6(JQ245811) 99
LW鄄32 Methanoregula Uncultured archaeon clone mcrA28(FJ640796) 97
4035 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 32 卷摇
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摇 摇 续表
克隆子编号 所属类型 最相似序列及其 GenBank登录号 相似度 / %
Clone Group Closest NCBI match and their Genbank Accession Identity
LW鄄33 Methanolinea Methanolinea sp. TNR(AB496719) 92
LW鄄34 Methanoregula Uncultured methanogenic archaeon clone TOP_ME_42(JQ245824) 95
LW鄄35 Methanoregula Uncultured methanogenic archaeon clone TOP_ME_42(JQ245824) 98
LW鄄36 Methanoregula Uncultured methanogenic archaeon clone MID_ME_5(JQ245828) 96
LW鄄37 Methanolinea Uncultured methanogenic archaeon clone BOT_ME_26(JQ245851) 97
3摇 讨论
研究表明,甲烷八叠球菌目 ( Methanosarcinales)、甲烷微菌目 ( Methanomicrobiales) 和甲烷杆菌目
(Methanobacteriales)是自然湿地土壤中常见的产甲烷菌类群[5鄄12, 20鄄22]。 此外,Rice cluster I 和 Rice cluster II
的产甲烷菌在自然湿地土壤中也经常被检测到[12, 20鄄21]。 本研究在闽江口芦苇沼泽湿地土壤检测到的产甲烷
菌类群包括:甲烷八叠球菌目 ( Methanosarcinales )、甲烷微菌目 ( Methanomicrobiales ) 和甲烷杆菌目
(Methanobacteriales),这与先前研究结果一致。 此外,不同自然湿地类型由于生态环境各异,导致土壤中产甲
烷菌的优势类群也各不相同。 Cadillo鄄Quiroz 等[20]研究发现,草本泥炭沼泽中优势的产甲烷菌类群有:
Methanomicrobiales (FC),Methanosarcinaceae,RCI;Kotsyurbenko等[21]在苔藓泥炭沼泽中检测到的产甲烷菌优
势类群则为:Methanomicrobiales (FC),RCII,Methanosarcinaceae;Utsumi 等[22]在森林沼泽中检测到的产甲烷
菌优势类群有: Methanosarcinaceae, Methanomicrobiales ( FC), Methanosaetaceae。 Narihiro 等[5] 研究发现
Methanoregula是日本泥炭藓湿地土壤中优势的产甲烷类群。 Jeanedy等人[10]研究表明,亚马逊湿地土壤中主
要的产甲烷菌类群为 Methanosarcinales,包括 Methanosarcina 和 Methanosaeta两个优势属。 国内,Zhang等人[6]
对青藏高原若尔盖高寒湿地研究显示甲烷八叠球菌目(Methanosarcinales)和甲烷微菌目(Methanomicrobiales)
是主要的产甲烷菌类群,而甲烷杆菌很少且没有甲烷球菌,甲烷八叠球菌目中一个未培养的产甲烷菌 ZC鄄I 分
支在 16S rRNA和 mcrA基因文库中均占优势。 Liu等人[12]对中国 4 个湿地(青藏高原若尔盖湿地、三江平原
湿地、鄱阳湖湿地、洪泽湖湿地)产甲烷菌的群落进行了研究,表明甲烷微菌目(Methanomicrobiales)是四个湿
地土壤表层的产甲烷菌主要类群之一。 本研究同样表明,甲烷微菌目(Methanomicrobiales)是闽江口芦苇湿地
0—30 cm土壤产甲烷菌的主要类群,包括 Methanolinea 和 Methanoregula 两个优势属。 由于甲烷微菌目的营
养类型为 H2 / CO2,因此,可能暗示闽江口鳝鱼滩湿地西部近堤岸高潮滩分布的芦苇沼泽带 0—30 cm 土壤的
甲烷生成途径主要为 H2 / CO2 途径。
自然湿地土壤产甲烷菌群落的分布随深度变化而发生变化已有相关报道。 Galand 等人[9]在芬兰草本泥
炭沼泽的研究表明产甲烷菌群落的分布随深度变化而发生变化,表层 ( 10 cm 处) 主要类群为
Methanomicrobiales和 Fen cluster,营养类型为 H2 / CO2,而深层(40 cm处)主要为乙酸盐营养类型的产甲烷菌
类群 Methanosarcinales和 Rice Cluster鄄I。 Jeanedy等人[10]对亚马逊湿地土壤不同深度中产甲烷菌群落研究发
现,随着土壤深度增加,Methanosaeta 和 Methanospirillum的丰富度升高,而 Methanosarcina的丰富度下降,在最
深处(70—100 cm)Methanosarcina完全消失。 Parkes等人[11]在英国 Arne 半岛盐沼湿地研究发现,表层的产
甲烷菌的优势类群为 Methanosarcinales,约占 60%—95% ,而深层则以 Methanosaeta为优势产甲烷菌类群。 国
内,Liu等人[12]研究表明,鄱阳湖湿地、洪泽湖湿地土壤表层主要的产甲烷菌类群为 Methanomicrobiales 和
Methanosaetaceae,青藏高原若尔盖湿地、三江平原毛薹草湿地土壤表层主要的产甲烷菌类群为
Methanomicrobiales和 Methanobacteriales;ZC鄄砖 则是鄱阳湖湿地、三江平原湿地土壤深层主要的产甲烷菌类群。
本研究结果同样显示闽江口高潮滩芦苇湿地不同土壤深度中产甲烷菌群落的分布呈现出空间变异的特征。
土壤表层(0—10 cm)优势产甲烷菌类群为 Methanoregula,约占 76% ;10—20 cm 土层主要的产甲烷菌类群为:
Methanolinea和 Methanoregula,分别约占 23% 和 29% ; 20—30 cm 土层主要的产甲烷菌优势类群为
5035摇 17 期 摇 摇 摇 佘晨兴摇 等:闽江口芦苇沼泽湿地土壤产甲烷菌群落结构的垂直分布 摇
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图 4摇 基于 mcrA序列构建的闽江口芦苇湿地土壤产甲烷菌系统发育树
Fig. 4摇 Phylogenetic tree of methanogens from the P. australis marsh soil in the Min River estuary base on mcrA sequence
Methanolinea,约占 66% 。 对于闽江口鳝鱼滩芦苇沼泽湿地土壤更深层(>30 cm)产甲烷菌的群落组成和营养
类型,将在后续的研究中进一步阐明。
选择合适的 PCR引物对于正确评估环境样品中 mcrA基因多样性是极其重要的。 目前,用于扩增环境样
品中产甲烷菌 mcrA基因的引物主要有:MCR 引物、ME 引物和 ML 引物等[17, 23鄄24]。 这些引物在扩增长度、靶
6035 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 32 卷摇
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向位点及简并水平上各不相同,也存在一些不足。 Banning[25]和 Juottonen等人[26]研究指出,MCR引物、ME引
物和 ML 引物在产甲烷菌类群检测的覆盖面上存在差异性。 此外, ME1 / ME2 引物无法扩增出
Methanosaetaceae 和 Methanobacteriaceae类群的产甲烷菌[26],这可能会导致检测结果存在一定的局限性。 由
于 mcrA基因序列在 GenBank中仅有很少的一部分,相对于 16s rDNA序列来说其丰富性要低很多,这也可能
会导致检测结果存在一定的局限性。 为了更全面地揭示闽江口潮汐沼泽湿地产甲烷菌的多样性,今后将结合
使用其他分子生物学手段及分离、培养等常规方法对闽江口湿地土壤产甲烷菌群落结构进行进一步研究。
4摇 结论
(1 ) 闽江口芦苇沼泽湿地 0—30 cm 土壤检测到的产甲烷菌类群包括: 甲烷八叠球菌目
(Methanosarcinales)、甲烷微菌目(Methanomicrobiales)和甲烷杆菌目(Methanobacteriales),其中优势类群为甲
烷微菌目(Methanomicrobiales)。
(2)闽江口芦苇沼泽湿地产甲烷菌群落组成随土壤深度变化而发生变化。 土壤表层(0—10 cm)优势产
甲烷菌类群为 Methanoregula,约占 76% ; 10—20 cm 土层主要的产甲烷菌类群为: Methanolinea 和
Methanoregula,分别约占 23%和 29% ;20—30cm 土层主要的产甲烷菌优势类群为 Methanolinea,约占 66% 。
10—20 cm土层产甲烷菌多样性高于土壤表层(0—10 cm)和 20—30 cm 土层。
(3)37 个测序 OTUs中有 26 个 OTUs属于不可培养的产甲烷菌序列,暗示闽江口芦苇沼泽湿地土壤中存
在大量不可培养的产甲烷菌。
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8035 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 32 卷摇
ACTA ECOLOGICA SINICA Vol. 32,No. 17 September,2012(Semimonthly)
CONTENTS
Conservation strategies for Ulmus elongata based on the analysis of biological and ecological factors
GAO Jianguo, ZHANG Yi, WU Yuhuan, et al (5287)
…………………………………
……………………………………………………………………………
Vertical distribution of methanogen community structures in Phragmites australis marsh soil in the Min River estuary
SHE Chenxing, TONG Chuan (5299)
…………………
………………………………………………………………………………………………
Energy balance closure and its effects on evapotranspiration measurements with the eddy covariance technique in a cropland
LIU Du, LI Jun, YU Qiang, TONG Xiaojuan, et al (5309)
…………
………………………………………………………………………
Effects of soil water potential on the growth and physiological characteristics of Populus tomentosa pulpwood plantation under
subsurface drip irrigation XI Benye, WANG Ye, DI Nan, et al (5318)…………………………………………………………
Physiological indices of leaves of jujube (Zizyphus jujuba) damaged by Apolygus lucorum
GAO Yong, MEN Xingyuan, YU Yi, et al (5330)
……………………………………………
…………………………………………………………………………………
Economic analysis of wetland resource protection: a case study of Beijing Wild Duck Lake
WANG Changhai, CUI Lijuan, MA Muyuan, et al (5337)
……………………………………………
…………………………………………………………………………
Comparative studies on the farmers忆 willingness to accept eco鄄compensation in wetlands nature reserve
WANG Changhai,CUI Lijuan,MAO Xufeng, et al (5345)
………………………………
…………………………………………………………………………
Remote sensing estimation models of Suaeda salsa biomass in the coastal wetland
FU Xin,LIU Gaohuan, HUANG Chong,LIU Qingsheng (5355)
……………………………………………………
……………………………………………………………………
Effects of N addition on soil organic carbon components in an alpine meadow on the eastern Qinghai鄄Tibetan Plateau
ZHENG Jiaojiao, FANG Huajun, CHENG Shulan, et al (5363)
………………
……………………………………………………………………
Estimating carbon emissions from forest fires during 2001 to 2010 in Daxing忆anling Mountain
HU Haiqing, WEI Shujing, SUN Long (5373)
…………………………………………
………………………………………………………………………………………
Predicting the effects of soil water potential on the growth of cut lily DONG Yongyi, LI Gang, AN Dongsheng, et al (5387)………
Rain enrichment鄄accelerated carbon emissions from soil in a Nitraria sphaerocarpa community in hyperarid region
LIU Dianjun, WU Bo, LI Yonghua, et al (5396)
……………………
…………………………………………………………………………………
Response of soil organic carbon sequestration to the “Grain for Green Project冶 in the hilly Loess Plateau region
XU Mingxiang, WANG Zheng, ZHANG Jin, et al (5405)
……………………
…………………………………………………………………………
Temporal and spatial variability in soil respiration in five temperate forests in Xiaoxing忆an Mountains, China
SHI Baoku,JIN Guangze,WANG Zhaoyang (5416)
…………………………
…………………………………………………………………………………
Distributions pattern of phosphorus, potassium and influencing factors in the upstream of Shule river basin
LIU Wenjie, CHEN Shengyun, HU Fengzu, et al (5429)
…………………………
…………………………………………………………………………
COI1 is involved in jasmonate鄄induced indolic glucosinolate biosynthesis in Arabidopsis thaliana
SHI Lu, LI Mengsha, WANG Lihua, et al (5438)
………………………………………
…………………………………………………………………………………
Modeling canopy rainfall interception of a replanted Robinia pseudoacacia forest in the Loess Plateau
WANG Yanping,WANG Li,WEI Sanping (5445)
…………………………………
…………………………………………………………………………………
The differences of plant community diversity among the different altitudes in the Water鄄Level鄄Fluctuating Zone of the Three
Gorges Reservoir LIU Weiwei, WANG Jie, WANG Yong, et al (5454)…………………………………………………………
Low鄄frequency drought variability based on SPEI in association with climate indices in Beijing SU Hongxin, LI Guangqi (5467)……
Response of upland jujube tree trunk diameter to different ecological factors
ZHAO Ying, WANG Youke, HAN Lixin,et al (5476)
……………………………………………………………
……………………………………………………………………………
The spatial distribution and seasonal dynamics of fine roots in a young Caragana korshinskii plantation
ZHANG Fan, CHEN Jianwen, WANG Mengben (5484)
………………………………
……………………………………………………………………………
Interspecific segregation of species in tree and shrub layers of the Pinus bungeana Zucc. ex Endl. community in the Wulu
Mountains, Shanxi Province, China WANG Lili, BI Runcheng, YAN Ming, et al (5494)………………………………………
Effects of long鄄term fertilization on soil microbial biomass carbon and nitrogen and enzyme activities during maize growing season
MA Xiaoxia, WANG Lianlian, LI Qinghui, et al (5502)
…
…………………………………………………………………………
A model to predict dry matter accumulation dynamics in wheat based on the normalized method
LIU Juan, XIONG Shuping, YANG Yang, et al (5512)
………………………………………
……………………………………………………………………………
Optimization strategies and an aesthetic evaluation of typical plant communities in the Shanghai Green Belt
ZHANG Kaixuan, LING Huanran, DA Liangjun (5521)
…………………………
……………………………………………………………………………
Carbon footprint evaluation research on the tourism transportation system at tourist attractions: a case study in Hengshan
DOU Yindi, LIU Yunpeng, LI Bohua, et al (5532)
……………
………………………………………………………………………………
An urban ecosystem assessment method and its application SHI Huichun, LIU Wei, HE Jian, et al (5542)…………………………
Seasonal variations in distribution and biological characteristics of snailfish Liparis tanakae in the central and southern Yellow Sea
ZHOU Zhipeng, JIN Xianshi, SHAN Xiujuan,et al (5550)
…
…………………………………………………………………………
Effects of cyanobacterial accumulation and snail grazing on the growth of vallisneria natans
HE Hu, HE Yuhong,JI Yachan,et al (5562)
……………………………………………
………………………………………………………………………………………
The structure and thermal insulation capability of Mustela sibirica manchurica winter pelage in Heilongjiang Province
LIU Yu,ZHANG Wei (5568)
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Ontogenetic shifts in selected body temperature and thermal tolerance of the tiger frog, Hoplobatrachus chinensis
FAN Xiaoli, LEI Huanzong, LIN Zhihua (5574)
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The influence of tubificid worms bioturbation on organic phosphorus components and their vertical distribution in sediment of
Lake Taihu BAI Xiuling, ZHOU Yunkai, ZHANG Lei (5581)……………………………………………………………………
Review and Monograph
Research advances in ecological assessment of urban greenspace MAO Qizheng, LUO Shanghua, MA Keming, et al (5589)………
Ecological hot topics in global change on the 2nd International Young Ecologist Forum
WAN Yun, XU Lili, GENG Qifang,et al (5601)
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Scientific Note
Screening trial for the suitable plant species growing on sand dunes in the alpine valley and its recovery status in the Yarlung
Zangbo River basin of Tibet, China SHEN Weishou, LI Haidong, LIN Naifeng, et al (5609)…………………………………
《生态学报》2013 年征订启事
《生态学报》是中国生态学学会主办的生态学专业性高级学术期刊,创刊于 1981 年。 主要报道生态学研
究原始创新性科研成果,特别欢迎能反映现代生态学发展方向的优秀综述性文章;研究简报;生态学新理论、
新方法、新技术介绍;新书评介和学术、科研动态及开放实验室介绍等。
《生态学报》为半月刊,大 16 开本,300 页,国内定价 90 元 /册,全年定价 2160 元。
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生摇 态摇 学摇 报
(SHENGTAI摇 XUEBAO)
(半月刊摇 1981 年 3 月创刊)
第 32 卷摇 第 17 期摇 (2012 年 9 月)
ACTA ECOLOGICA SINICA
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