全 文 ：
摇 摇 摇 摇 摇 生 态 学 报
摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 (SHENGTAI XUEBAO)
摇 摇 第 32 卷 第 22 期摇 摇 2012 年 11 月摇 (半月刊)
目摇 摇 次
CO2 浓度和温度升高对噬藻体 PP 增殖的联合作用 牛晓莹,程摇 凯,荣茜茜,等 (6917)………………………
1956—2009 年内蒙古苏尼特左旗荒漠草原的降水格局 陈摇 军,王玉辉 (6925)………………………………
两个污水处理系统的能值与经济综合分析 李摇 敏,张小洪,李远伟,等 (6936)…………………………………
退化草地阿尔泰针茅种群个体空间格局及关联性 赵成章,任摇 珩 (6946)………………………………………
地表覆盖栽培对雷竹林凋落物养分及其化学计量特征的影响 刘亚迪,范少辉,蔡春菊,等 (6955)……………
福州酸雨区次生林中台湾相思与银合欢叶片的 12 种元素含量 郝兴华,洪摇 伟,吴承祯,等 (6964)…………
“雨花露冶水蜜桃主要害虫与其捕食性天敌的关系 柯摇 磊,施晓丽,邹运鼎,等 (6972)………………………
大兴安岭林区 10 小时时滞可燃物湿度的模拟 胡天宇,周广胜,贾丙瑞 (6984)…………………………………
陕北风沙区不同植被覆盖下的土壤养分特征 李文斌,李新平 (6991)……………………………………………
南方型杨树人工林土壤呼吸及其组分分析 唐罗忠,葛晓敏,吴摇 麟,等 (7000)…………………………………
黑河下游土壤水盐对生态输水的响应及其与植被生长的关系 鱼腾飞,冯摇 起,刘摇 蔚,等 (7009)……………
树木胸径大小对树干液流变化格局的偏度和时滞效应 梅婷婷,赵摇 平,倪广艳,等 (7018)……………………
外来植物紫茎泽兰入侵对土壤理化性质及丛枝菌根真菌(AMF)群落的影响
于文清,刘万学,桂富荣,等 (7027)
…………………………………
……………………………………………………………………………
基于 Landsat TM的热带精细地物信息提取的模型与方法———以海南岛为例
王树东,张立福,陈小平,等 (7036)
…………………………………
……………………………………………………………………………
雪被去除对川西高山冷杉林冬季土壤水解酶活性的影响 杨玉莲,吴福忠,杨万勤,等 (7045)…………………
不同土壤水分处理对水稻光合特性及产量的影响 王唯逍,刘小军,田永超,等 (7053)…………………………
木蹄层孔菌不同居群间生长特性、木质素降解酶与 SRAP 标记遗传多样性
曹摇 宇,徐摇 晔,王秋玉 (7061)
……………………………………
…………………………………………………………………………………
加拿大一枝黄花入侵对土壤动物群落结构的影响 陈摇 雯,李摇 涛,郑荣泉,等 (7072)…………………………
间作对玉米品质、产量及土壤微生物数量和酶活性的影响 张向前,黄国勤,卞新民,等 (7082)………………
接种 AM真菌对玉米和油菜种间竞争及土壤无机磷组分的影响 张宇亭,朱摇 敏,线岩相洼,等 (7091)………
大亚湾冬季不同粒级浮游生物的氮稳定同位素特征及其与生物量的关系
柯志新,黄良民,徐摇 军,等 (7102)
………………………………………
……………………………………………………………………………
太湖水华期间有毒和无毒微囊藻种群丰度的动态变化 李大命,叶琳琳,于摇 洋,等 (7109)……………………
锌胁迫对小球藻抗氧化酶和类金属硫蛋白的影响 杨摇 洪,黄志勇 (7117)………………………………………
基于国家生态足迹账户计算方法的福建省生态足迹研究 邱寿丰,朱摇 远 (7124)………………………………
能源活动 CO2 排放不同核算方法比较和减排策略选择 杨喜爱,崔胜辉,林剑艺,等 (7135)…………………
基于生境等价分析法的胶州湾围填海造地生态损害评估 李京梅刘铁鹰 (7146)………………………………
县级生态资产价值评估———以河北丰宁县为例 王红岩,高志海,李增元,等 (7156)……………………………
专论与综述
丛枝菌根提高宿主植物抗旱性分子机制研究进展 李摇 涛,杜摇 娟,郝志鹏,等 (7169)…………………………
城市土壤碳循环与碳固持研究综述 罗上华,毛齐正,马克明,等 (7177)…………………………………………
基于遥感的光合有效辐射吸收比率(FPAR)估算方法综述 董泰锋,蒙继华,吴炳方 (7190)…………………
光衰减及其相关环境因子对沉水植物生长影响研究进展 吴明丽,李叙勇 (7202)………………………………
浮游动物化学计量学稳态性特征研究进展 苏摇 强 (7213)………………………………………………………
研究简报
2010 年两个航次獐子岛海域浮游纤毛虫丰度和生物量 于摇 莹,张武昌,张光涛,等 (7220)…………………
基于熵值法的我国野生动物资源可持续发展研究 杨锡涛,周学红,张摇 伟 (7230)……………………………
残落物添加对农林复合系统土壤有机碳矿化和土壤微生物量的影响 王意锟,方升佐,田摇 野,等 (7239)……
人工湿地不同季节与单元之间根际微生物多样性 陈永华,吴晓芙,张珍妮,等 (7247)…………………………
期刊基本参数:CN 11鄄2031 / Q*1981*m*16*338*zh*P* ￥ 70郾 00*1510*36*
室室室室室室室室室室室室室室
2012鄄11
封面图说: 水杉农田防护林中的小麦熟了———水杉曾广泛分布于北半球,第四纪冰期以后,水杉属的其他种类全部灭绝,水杉
却在中国川、鄂、湘边境地带得以幸存,成为旷世奇珍,野生的水杉是国家一级保护植物。 由于水杉耐水,适应力强,
生长极为迅速,其树干通直挺拔,高大秀颀,树冠呈圆锥形,姿态优美,自发现后被人们在中国南方广泛种植,不仅成
为了湖边、道路两旁的绿化观赏植物,更成为了农田防护林的重要树种。 此图中整齐划一的水杉防护林像忠实的哨
兵一样,为苏北农村即将成熟的麦田站岗。
彩图提供: 陈建伟教授摇 北京林业大学摇 E鄄mail: cites. chenjw@ 163. com
第 32 卷第 22 期
2012 年 11 月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol. 32,No. 22
Nov. ,2012
http: / / www. ecologica. cn
基金项目:环保公益性行业科研专项(200909066);国家科技支撑计划项目(2012BAC09B03);国家林业局科技推广项目[2010]43 号;湖南省科
技计划项目(2012SK3167);湖南省环境科学重点学科建设项目(2006180)
收稿日期:2011鄄10鄄11; 摇 摇 修订日期:2012鄄03鄄07
*通讯作者 Corresponding author. E鄄mail: wuxiaofu530911@ vip. 163. com
DOI: 10. 5846 / stxb201110111491
陈永华,吴晓芙,张珍妮,蒋丽娟,李科林,柳俊.人工湿地不同季节与单元之间根际微生物多样性.生态学报,2012,32(22):7247鄄7254.
Chen Y H, Wu X F, Zhang Z N,Jiang L J,Li K L, Liu J. Seasonal changes in microbial diversity in different cells of a wetland system constructed for
municipal sewage treatment. Acta Ecologica Sinica,2012,32(22):7247鄄7254.
人工湿地不同季节与单元之间根际微生物多样性
陈永华,吴晓芙*,张珍妮,蒋丽娟,李科林,柳俊
(中南林业科技大学 环境科学与工程研究中心,长沙摇 410004)
摘要:采用选择性平板培养基法和 PCR鄄DGGE法比较研究了三级垂直潜流人工湿地污水处理系统中不同季节与单元之间根际
微生物数量与多样性,结果表明,随着“秋鄄冬鄄春鄄夏冶的季节的变化,2 种方法测定的微生物数量都呈现“高鄄低鄄高冶季节性变化
现象,但选择性平板培养基法显示秋季数量最多,PCR鄄DGGE法显示夏季数量最多。 从三级处理单元的 1—3级,两种方法测定
的微生物数量都呈现“低鄄高鄄低冶的规律。 除土样 11 外,其余相同季节的土样均出现聚集在同一个分支下。 得到的 4 个差异序
列(YP1—YP 4),经 BLAST比较,分别找到同源性最近的已知类群,分别为肠杆菌属、弧菌、欧文氏菌、产酸克雷伯菌。 BLASTX
比较发现 YP1 与细菌代谢分解有机物有关;YP2 蜡样芽胞杆菌生命活动相关,具有解磷的作用;YP3 与 APOE 载脂蛋白 e功能
相似,参与细菌的分解代谢;YP4 功能可能与细菌去氮有关。
关键词:人工湿地;根际微生物;选择性平板培养基法 ;PCR鄄DGGE;BLAST分析
Seasonal changes in microbial diversity in different cells of a wetland system
constructed for municipal sewage treatment
CHEN Yonghua, WU Xiaofu*, ZHANG Zhenni,JIANG Lijuan,LI Kelin, LIU Jun
Research Center of Environment Science and Engineering, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004,China
Abstract: Selective plating medium and PCR鄄DGGE techniques were applied to analyze the seasonal changes in the number
and diversity of micro鄄organisms in the rhizosphere of three sequenced cells in a vertical subsurface鄄flow wetland system
constructed for municipal sewage treatment. The relationship between the community structures of the microorganisms and
their functions in removal of the organic pollutants was also analyzed.
The results obtained from the two applied methods showed that with the seasonal changes in the sequence of autumn鄄
winter鄄spring鄄summer, the number of the micro鄄organisms displayed a general “up鄄down鄄up冶 pattern. The largest number
of microorganisms from the rhizoshpere in three treatment cells detected by the selective plating medium method was in the
autumn while that by the PCR鄄DGGE techniques was in the summer. Correlation analysis indicated that the seasonal change
in temperature was the main factor that determined the observed pattern by affecting the growth of the microorganisms. In a
given season, the number of micro鄄organisms obtained from the two applied methods displayed a different pattern in the
three sequenced treatment cells. Towards the flow direction in the sewage treatment process, the number of micro鄄organisms
increased from the first cell to the second cell and then decreased in the third cell, accordingly, with most of the organic
pollutants being removed in the first two treatment cells.
Based on the structure comparability of the microbial community among treatment cells, all soil samples collected in
the same season, except for sample no. 11, were clustered in the same branch, with all DGGE comparability values being
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higher than 20% , which can thus be classified into the same group. The DGGE spectrograms of the soil microorganisms
from different seasons are different. The highest comparability value, 40% , was found in the spring, while the lowest,
about 25% , was in the summer, indicating that the level of the microbial diversity was higher in the summer season under
the tested conditions.
Four different sequences ( YP1—YP 4) were obtained, and their closest known鄄origin groups were identified by
BLASTX analysis as Enterobacter sp. , Vibrio sp. , Erwinia sp. and Klebsiella oxytoca, respectively. The BLASTX
comparison tests showed that YP1 played an important role in decomposing organic matters; YP2 was fund to be related to
the life activities of the Cerea Spore Bacilli with functions in phosphate dissolution; YP3 had functions similar to the
apolipoprotein e ( APOE) that involved in catabolism and metabolism of micro鄄organisms; and YP4 had an effect on
nitrogen removal subject to microbial activities.
Key Words: constructed wetlands; micro鄄organism of plant rhizosphere; selective plating medium culture; PCR鄄DGGE;
BLAST analysis
在人工湿地植物根际附近分布有大量的微生物,根际微生物与根系组成了一个特殊的生态系统,其繁殖
速度快,数量多、代谢能力强,对土壤有机质的分解、无机质的转化、氮的固定以及提供植物营养都具有重要作
用,是维持湿地生态系统和实现生态净化功能及其物质和能量转化的重要组成部分[1鄄3]。 所以在分析人工湿
地植物根际微生物对污染物的去除机制时,了解微生物的种群时空分布,遗传多样性,对鉴定和分离处理系统
中的去污优势菌很重要[4鄄5]。
目前主要用来研究人工湿地根系微生物方法有传统选择性平板培养基法和 DGGE 技术[6],本研究通过
选择性平板培养基和 PCR鄄DGGE两种方法,比较并联三级串连人工垂直潜流湿地在不同季节(春夏秋冬)和
不同单元(1—3级)之间的根际微生物多样性,并分析了微生物在人工湿地各单元中落群落结构和功能的对
应关系,旨在为人工湿地的改进和优化提供一定的技术参考。
1摇 材料与方法
图 1摇 人工垂直流湿地系统流程示意
Fig. 1摇 Process of the vertical鄄flow wetland system
1. 1摇 材料
本试验于 2008 年开始在中南林业科技大学株洲校
区污水处理系统中进行,本地区为亚热带气候。 系统采
用一套三级串连人工垂直潜流湿地(图 1),标记为(3鄄
1,3鄄 2, 3鄄 3),植物为美人蕉 ( Canna indica)、水葱
(Scirpus validus)、再力花 ( Thalia dealbata)、风车草
(Cyperus alternifolius) [7鄄8]4 种植物等比例混栽,植物栽
植密度为 20 cm伊20 cm。 每级单元床体规格为:长伊宽伊
深=5 m伊2 m伊1 m,填料层为沸石。 系统运行 1 a后,于
2009 年秋季(10—12 月),、冬季(1—3 月)、2010 春季
(4—6月)、夏季(7—9月)采用 5 点取样法在取近根区
土壤,编号为:秋季 3鄄1,秋季 3鄄2,秋季 3鄄3,冬季 3鄄1,冬
季 3鄄2,冬季 3鄄3,春季 3鄄1,春季 3鄄2,春季 3鄄3,夏季 3鄄1,夏季 3鄄2,夏季 3鄄3,并保存于-20 益,以备实验。
1. 2摇 试验流程及运行管理
进水为生活区污水,污水经过水泵提升后,进入预处理单元,进行预处理,然后进入三级串连人工垂直潜
流湿地处理单元,经预处理后进入潜流湿地处理单元的污水主要水质指标为: COD 108. 26—125. 74 mg / L;
TN 39. 53—44. 47 mg / L;TP 2. 09—2. 43 mg / L。 实验研究期间,水力负荷保持为 2. 4 m·d,污水停留时间在试
验时期内的变化范围约为 48—60 h,系统 24 h连续运转。
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1. 3摇 实验方法
1. 3. 1摇 选择性平板培养基法
采用琼脂糖固体培养基法[9],待菌落长出后进行计数。 计算公式:
干土菌数(个 / g)=菌落平均数伊稀释倍数 /干土百分比
1. 3. 2摇 PCR鄄DGGE 方法
总 DNA的提取方法参照文献[10],PCR扩增反应体系 5 滋L 10伊Buffer(含 Mg2+),4 滋L dNTP (2. 5 mmol /
L),2 滋L引物 GC鄄357F,2 滋L引物 519R,2. 5 滋L模板 DN A,0. 5 滋L Taq酶(5U / 滋L),34 滋L ddH2O。 PCR程
序为:94 益预变性 5 min,94 益变性 1 min,55 益退火 30 s,72 益延伸 30 s,30—35 个循环,72 益延伸 10 min,
DGGE电泳方法参照文献[11]。
1. 3. 3摇 根际微生物多样性统计分析
(1)Shannon鄄Wienner指数的计算公式为(1):
H =- 移
s
i = 1
pi log2pi (1)
式中,H为 Shannon指数;S为每个样品的条带数目;P i =
ni
N
,ni 为第 i个种的个体数;N为种群中总的个体数。
(2)Simpson指数的计算公式为(2):
Ds = 1 - 移
s
i = 1
p2i (2)
式中,Ds 为 Simpson 指数;S 为每个样品的条带数目;P i =
ni
N
,ni 为第 i 个种的个体数;N 为种群中总的个
体数。
(3)相似性聚类分析
采用 UPGMA聚类分析软件对 DGGE指纹图谱进行相似聚类分析。
(4)DGGE电泳图谱分析
使用 Quantity one 软件对 DGGE电泳图进行分析。
1. 3. 4摇 差异片段的克隆测序 BLAST分析
在紫外灯下切下 DGGE图谱中主要的差异条带,洗净后浸泡于 60 滋L无菌 Milli2Q水中 24 h 以上,取 20
滋L进行 PCR二次扩增,扩增产物经 DGGE 确认为单一条带纯化后,纯化后送交生物公司(Sangon,上海) 测
序。 测序结果提交 GenBank并获得接受号。 使用 GenBank的 BLAST对测序结果进行同源性分析。
2摇 结果与讨论
2. 1摇 选择性平板培养基法
2. 1. 2摇 不同季节之间微生物群落多样性比较
用选择性平板培养基法测定的人工湿地处理单元基质中微生物菌落总数如图 2 所示。
从图 2 可以看出:随着“秋鄄冬鄄春鄄夏冶的季节的变化,三级人工湿地单元中都出现微生物数量总体上呈现
“高鄄低鄄高冶 季节性变化现象,即秋季为最高,进入冬季迅速降低,然后随着温度的增高逐渐增加。 最高出现
在秋季的结论与王锐萍[12]对土壤微生物数量在一年中四个季节的变化趋势大致相同,冬季湖南温度很低,微
生物活性较低,微生物数量较少,处理效率也相对较低,开春后随着气温的升高,微生物活性增加,繁殖速度也
加快,所以培育出来的微生物数量也较多,进入秋季,湖南由于秋老虎的影响温度也较高,因此,微生物持续生
长直到秋季,在秋季达到最高峰,然后秋末温度降低后微生物数量出现降低,直到冬季降到最低处。
2. 1. 2摇 不同单元之间微生物群落多样性比较
从三级单元之间微生物数量变化来看,从 1 级到 3 级,微生物数量最高为第 2 级,其次为第 1 级,最低为
第 3 级,总体上呈现由 1—3级微生物数量呈现“低鄄高鄄低冶的变化趋势,即潜流人工湿地系统中微生物数量有
9427摇 22 期 摇 摇 摇 陈永华摇 等:人工湿地不同季节与单元之间根际微生物多样性 摇
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沿水流方向呈“低鄄高鄄低冶的现象,这种现象的可能原因是污水中的大部分有机物都会被潜流人工湿地截留在
前部和中部,因此,推断微生物降解有机物主要在中部,其次为前部。 杨新萍等[13]对潜流人工湿地处理水中
有机物和氮的净化效率及沿程变化的研究中也发现对 TN去除效果最好也在其中部,有机物的降解基本在湿
地前部与中部完成。
2. 2摇 PCR鄄DGGE法
2. 2. 1摇 不同季节之间微生物群落多样性比较
提取微生物总 DNA后进行 PCR扩增,然后将经过 PCR后电泳检查,有条带的样品,进行 DGGE 电泳,用
软件处理后见图 3 所示。
图 2摇 不同季节的微生物数量
Fig. 2摇 Population of microorganisms
图 3摇 DGGE量化图
Fig. 3摇 DGGE Vectorization
从图 3 可以看出:12 个土样中共检测到 124 种不同的条带,统计 3 个处理池平均分别为:春季 24 个,夏
季为 39 个,秋季为 25 个,冬季为 15 个。 可以看出随着“秋鄄冬鄄春鄄夏冶的季节的变化,微生物数量出现而呈现
“高鄄低鄄高冶 季节性变化现象,这与选择性平板培养基法测定的微生物数量变化现象一致,但 PCR鄄DGGE 法得
出微生物数量最高出现在夏季,与选择性平板培养基法测定的微生物数量秋季最高有一定差异,这是可能是
由于某些基质可能适合某一类或几类微生物的生长,而不适宜其它类微生物生存,结果基质中微生物总数可
能很高,但微生物多样性指数不一定高。 一个群落中物种类型数越多,各类型间分布比例越均匀,则该群落的
生物多样性指数就越高,该指数与微生物总量并无明显联系。
2. 2. 2摇 不同季节之间微生物群落多样性比较
从 3 级单元之间微生物数量变化来看,从 1 到 3 级,也呈现“低鄄高鄄低冶的变化趋势,与选择性平板培养基
法测定数量变化现象一致。 但是 DGGE方法可以更细则的看出同一处理单元在相同的季节,其 DGGE 图谱
具有很多相同泳带,且泳带数量相近,说明土壤微生物的群落结构相似,它们的优势菌种、菌种种类有着较大
的相似性。 同一处理单元在不同季节,其 DGGE图谱也有共同泳带,但大多数泳带的位置不同及图谱总带数
有明显的差异,说明有些菌种一直稳定存在,有些菌种随着季节的变化,转变为优势种群或非优势种群或
消亡[ 14鄄15]。
2. 3摇 微生物香农鄄威纳(Shannon)指数和辛普森指数分析
从 Shannon指数和 Simpson指数(表 1)可以看出,夏季微生物种类最多,春季和秋季次之,冬季最少;这一
结果与 PCR鄄DGGE法测定的微生物数量变化一致。 从三级单元之间的比较来看,除春季为“多鄄多鄄少冶,其他
季节都出现沿水流方向 Shannon指数和 Simpson呈现 “少鄄多鄄少冶的变化趋势,进一步说明本系统中微生物多
样性沿水流方向呈先增加后减少的现象。
2. 4摇 聚类分析
将 DGGE图谱中包含的信息进行量化处理,以二进制的格式输出,再进行 UPGMA 聚类分析不同处理间
0527 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 32 卷摇
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微生物群落结构的相似性,如图 4 所示。 1、2、3 分别为春 3鄄1、3鄄2、3鄄3,4、5、6 为夏 3鄄1、3鄄2、3鄄3,7、8、9 为秋 3鄄
1、3鄄2、3鄄3,10、11、12 为冬 3鄄1、3鄄2、3鄄3。
表 1摇 Shannon指数和 Simpson指数
Table1摇 Shannon index and Simpson index
样品
Sample
香浓鄄威纳指数(H忆)
Shannon鄄Weiner Index
辛普森指数(D)
Simpson index
样品
Sample
香浓鄄威纳指数(H忆)
Shannon鄄Weiner Index
辛普森指数(D)
Simpson index
春 3鄄1 Spring 3鄄1 3. 219 0. 960 春 3鄄2 Spring 3鄄2 3. 219 0. 960
春 3鄄3 Spring 3鄄3 3. 045 0. 952 夏 3鄄1 Summer 3鄄1 3. 638 0. 974
夏 3鄄2 Summer 3鄄2 3. 689 0. 975 夏 3鄄3 Summer 3鄄3 3. 664 0. 974
秋 3鄄1 Autumn 3鄄1 3. 135 0. 957 秋 3鄄2 Autumn 3鄄2 3. 258 0. 962
秋 3鄄3 Autumn 3鄄3 3. 178 0. 958 冬 3鄄1 Winter 3鄄1 2. 708 0. 933
冬 3鄄2 Winter 3鄄2 2. 773 0. 938 冬 3鄄3 Winter 3鄄3 2. 485 0. 917
图 4摇 12 个土样的聚类分析图
Fig. 4摇 Cluster analysis of 12 soil samples
1、2、3 分别为春 3鄄1、3鄄2、3鄄3,4、5、6 为夏 3鄄1、3鄄2、
3鄄3,7、8、9 为秋 3鄄1、3鄄2、3鄄3,10、11、12 为冬 3鄄1、3鄄2、3鄄
3 DGGE图谱经聚类分析后发现这 12 个样属于明显的
4 组。 除样 11 外,相同季节的土样均聚集在同一个分
支下,同一季节的土样微生物 DGGE 图谱则可归为一
组,带谱间相似性都大于 20% ,不同季节土样微生物的
DGGE分属不同组。 即第一组为春季 3鄄 1、3鄄 2、3鄄 3,第
二组为:秋 3鄄1、3鄄2、3鄄3、冬 3鄄2,第三组为:夏 3鄄 1、3鄄 2、
3鄄3,第四组为冬 3鄄 1、3鄄 3。 这些结果表明,当季节相同
时,各处理池的土样微生物群落相似性较高。 其中春季
微生物的相似性最高,达到了 40%左右,夏季相似性最
低,仅有 25% ,这说明夏季微生物多样性丰富,这与 DGGE法检测到夏季微生物多样性最高一致,也进一步说
明季节的温度变化对微生物的多样性的影响[16鄄17]。
2. 5摇 测序结果分析
在对回收得到的特异片段进行了验证后,对其中的 4 个片段进行了克隆、测序分析,其核酸测序的部分结
果为:
YP1
GGCGAGCTCTCTGCGGTACGTCTTGAGCAAGGATTAACTTTACTCCCTTCCTCCCCGCTGAAGTACTTTACAA
CCCGAAGGCCTTCTTCATACACGCGGCATGGCTGCATCAGGCTTGCCCCCATTGTGCAATATTACCCACTGCTG
CCTCCCGTAGGAGTA
YP2
CGAACGCGCTCTCTGCGGTACGTCAATGAGCTAGGTATTAACTTTACTCCCTTCCTCCCCGCTGAAGTACTTTA
CAACCCGAAGGCCTTCTTCATACACGCGGCATGGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACT
GCTGCCTCCCGTAGGAGTA
YP3
ATCGGACGCTCTCTCTGCGGGTACGTCATGAGCAAGGTATTAACTTTACTCCCTTCCTCCCCGCTGAAAGTACT
TTACAACCCGAAGGCCTTCTTCATACACGCGGCATGGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCA
CTGCTGCCTCCCGTAGGAGTA
YP4
CGGAGCTCTCTGCGGGTACGTCATGAGCAAGGTATTAACTTTACTCCCTTCCTCCCCGCTGAAGTACTTTACAA
1527摇 22 期 摇 摇 摇 陈永华摇 等:人工湿地不同季节与单元之间根际微生物多样性 摇
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CCCGAAGGCCTTCTTCATACACGCGGCATGGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGC
CTCCCGTAGGAGTA
2. 6摇 Blast分析
将所得序列输入 GenBank,用 Blast程序进行相似性比较分析。 具体结果如表 2—表 3 所示,所有序列与
数据库中 16S rDNA序列的相似性在 94%—97%之间。 说明所得序列均来源为微生物,而且在 GenBank 中找
到了最相近菌属。
表 2摇 PCR鄄DGGE法分离的 DNA的特征
Table 2摇 Characteristics of cloned DNAs isolated by PCR鄄DGGE
DNA克隆
DNAclone
引物组合
Primer pair
核苷酸同源:序列号
Nucleic acid identity:
Accession No.
相似性
Similarity
/ %
蛋白质同源:序列号
Amino acid identity:
Accession No.
E值
E value
差异序列 1(YP1) (F357GC / R518) Escherichia coli:ACXO01000167. 1摇 94
3,4鄄dihydroxy鄄2鄄butanone鄄4鄄
phosphate:ZP_06222660. 1 4e鄄09
差异序列 2(YP2) (F357GC / R518) Escherichia sp. :ACID01000033. 1 96
hypothetical protein:
ZP_06213060. 1 3e鄄08
差异序列 3(YP3) (F357GC / R518) Shigella dysenteriae:NZ_AAMJ02000006. 1 97
Low quality protein:
ZP_05997968. 1 8e鄄11
差异序列 4(YP4) (F357GC / R518) Shigella boydii:NC_010658. 1 97
Conserved hypothetical protein:
AAO09423. 1 | AE016800_28 5e鄄12
表 3摇 在 GenBank中的最相近菌属
Table 3摇 Closest species in GenBank
样品
Sample
差异序列 1
YP1
差异序列 2
YP2
差异序列 3
YP3
差异序列 4
YP4
相近菌属
Similar species
肠杆菌属
Enterobacter sp.
弧菌
Vibrio sp.
欧文氏菌
Erwinia sp.
产酸克雷伯菌
Klebsiella oxytoca
登录号 Registry Number EF450119. 1 FJ764192. 1 FM161470. 1 FM992868. 1
E值 E value 2e鄄22 1e鄄22 2e鄄24 6e鄄22
差异序列 1 (YP1)的核苷酸序列与大肠杆菌(Escherichia coli) (登录号:ACXO01000167. 1)相似性达
94% 。 BLASTX比较结果发现 3,4鄄二羟基鄄2鄄丁酮鄄4鄄磷酸(3,4鄄dihydroxy鄄2鄄butanone鄄4鄄phosphate synthase)的 E
值为 4e鄄09(登录号:ZP_06222660. 1)。 3,4鄄二羟基鄄2鄄丁酮鄄4鄄磷酸是一种 DHBP 合成酶, 提供核酮糖合成核
黄素鄄5所需的磷酸。 核黄素又名维生素 B2,是细菌体内辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)与黄素腺嘌呤单核
苷酸(FMN)的组成成分,参与细菌能量代谢和氧化还原反应,可能与细菌通过代谢分解有机物有关。 核黄素
还能进行可逆的脱氢加氢反应,作为氧化鄄还原介质,能有效降解偶氮染料废水[18,19],提高处理效果。
差异序列 2(YP2)的核苷酸序列与大肠埃希氏菌(Escherichia sp. ) (登录号:ACID01000033. 1)相似性达
96% 。 BLASTX比较结果发现假设蛋白(Hypothetical protein)的 E值为 3e鄄08(登录号:ZP_06213060. 1),此种
蛋白跟蜡样芽胞杆菌生命活动相关。 据报道,埃希氏菌和芽孢杆菌都有解磷的作用[20鄄21]。 因此,可以认为
YP2 差异表达片段可能与细菌解磷有关。
差异序列 3(YP3)的核苷酸序列与痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)(登录号:NZ_AAMJ02000006. 1)相
似性达 97% 。 BLASTX 比较结果发现低优质蛋白(LOW QUALITY PROTEIN)的 E 值为 8e鄄11(登录号:ZP_
05997968. 1),此蛋白与 APOE 载脂蛋白 e相似,载脂蛋白 E是生物必不可少的甘油三酯正常代谢丰富的脂蛋
白成分,YP3 差异表达片段的功能可能是参与细菌的分解代谢。
差异序列 4(YP4)的核苷酸序列与鲍氏志贺菌(Shigella boydii)(登录号:NC_010658. 1)相似性达 97% 。
BLASTX比较结果发现保守假设蛋白(Conserved hypothetical protein) E 值为 5e鄄12 (登录号:AAO09423. 1
AE016800_28)。 与其最相近菌属克雷伯式菌属的细菌,具有发酵肌醇产酸或产酸产气,水解尿素,可以利用
2527 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 32 卷摇
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枸橼酸盐,不产生硫化氢和鸟氨酸脱羧酶阴性等特性[22],YP4 差异表达片段功能可能与细菌去氮有关。
3摇 结论
(1)应用选择性平板培养基法与 DGGE 方法进行了不同季节与不同单元根际细菌多样性研究。 在不同
季节间,随着“秋鄄冬鄄春鄄夏冶的季节的变化,2 种方法测定的微生物数量都呈现“高鄄低鄄高冶 季节性变化现象,
但前者显示秋季数量最多,后者显示夏季数量最多;总体上说明土壤微生物数量变化主要受季节温度的影响。
三级单元之间,从 1—3级微生物数量变化,2 种方法都呈现“低鄄高鄄低冶的变化趋势,说明潜流人工湿地系统中
微生物数量有沿水流方向呈先增加后减少的现象,因此,有机物的降解也基本在湿地前部与中部完成。 从
Shannon指数和 Simpson指数来看季节变化,夏季微生物种类最多,春季和秋季次之,冬季最少。 三级单元之
间都出现沿水流方向 Shannon指数和 Simpson呈现 “少鄄多鄄少冶的变化趋势,此结论与前面选择性平板培养基
法得出的结果一致。
(2)从 UPGMA聚类分析不同处理间微生物群落结构的相似性来看,12 个样属于明显的 4 组。 除样 11
外,相同季节的土样均聚集在同一个分支下,同一季节的土样微生物 DGGE图谱则可归为一组,带谱间相似性
都大于 20% ,不同季节土样微生物的 DGGE分属不同组。 其中春季微生物的相似性最高,达到了 40%左右,
夏季相似性最低,仅有 25% ,这说明夏季微生物多样性丰富,这与 DGGE 法检测到夏季微生物多样性最高一
致,也进一步说明季节的温度变化对微生物的多样性的影响
(3)得到的 4 个差异序列,分别为肠杆菌属、弧菌、欧文氏菌、产酸克雷伯菌。 对序列 BLASTX比较,发现
这 4 个样分别与 3,4鄄二羟基鄄2鄄丁酮鄄4鄄磷酸(3,4鄄dihydroxy鄄2鄄butanone鄄4鄄phosphate synthase),假设蛋白,低优质
蛋白,保守假设蛋白最为相近,YP1 差异表达片段功能可能与细菌通过代谢分解有机物有关;YP2 差异表达片
段功能与蜡样芽胞杆菌生命活动相关,具有解磷的作用;YP3 差异表达片段功能与 APOE 载脂蛋白 e相似,参
与细菌的分解代谢;YP4 差异表达片段功能可能与细菌去氮有关。
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4527 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 32 卷摇
ACTA ECOLOGICA SINICA Vol. 32,No. 22 November,2012(Semimonthly)
CONTENTS
The combined effects of elevated CO2 and elevated temperature on proliferation of cyanophage PP
NIU Xiaoying,CHENG Kai,RONG Qianqian,et al (6917)
……………………………………
…………………………………………………………………………
Precipitation pattern of desert steppe in Inner Mongolia, Sunite Left Banner: 1956—2009 CHEN Jun, WANG Yuhui (6925)………
Emergy and economic evaluations of two sewage treatment systems LI Min, ZHANG Xiaohong, LI Yuanwei, et al (6936)…………
Individual spatial pattern and spatial association of Stipa krylovii population in Alpine Degraded Grassland
ZHAO Chengzhang, REN Heng (6946)
……………………………
……………………………………………………………………………………………
Litter characteristics of nutrient and stoichiometry for Phyllostachys praecox over soil鄄surface mulching
LIU Yadi, FAN Shaohui, CAI Chunju, et al (6955)
………………………………
………………………………………………………………………………
Characteristics of leaf element concentrations of twelve nutrients in Acacia confusa and Leucaena glauca in secondary forests of
acid rain region in Fuzhou HAO Xinghua, HONG Wei, WU Chengzhen,et al (6964)……………………………………………
Relationships between main insect pests and their predatory natural enemies in “Yuhualu冶 juicy peach orchard
KE Lei, SHI Xiaoli, ZOU Yunding, et al (6972)
………………………
…………………………………………………………………………………
Simulating 10鄄hour time鄄lag fuel moisture in Daxinganling HU Tianyu, ZHOU Guangsheng,JIA Bingrui (6984)………………………
Soil nutrient characteristics under different vegetations in the windy and sandy region of northern Shaanxi
LI Wenbin, LI Xinping (6991)
……………………………
………………………………………………………………………………………………………
Partitioning of autotrophic and heterotrophic soil respiration in southern type poplar plantations
TANG Luozhong, GE Xiaomin, WU Lin, et al (7000)
………………………………………
……………………………………………………………………………
Soil water and salinity in response to water deliveries and the relationship with plant growth at the lower reaches of Heihe River,
Northwestern China YU Tengfei, FENG Qi, LIU Wei,et al (7009)………………………………………………………………
Effect of stem diameter at breast height on skewness of sap flow pattern and time lag
MEI Tingting, ZHAO Ping, NI Guangyan, et al (7018)
…………………………………………………
……………………………………………………………………………
Invasion of exotic Ageratina adenophora Sprengel. alters soil physical and chemical characteristics and arbuscular mycorrhizal
fungus community YU Wenqing, LIU Wanxue, GUI Furong, et al (7027)………………………………………………………
Models and methods for information extraction of complex ground objects based on LandSat TM images of Hainan Island, China
WANG Shudong, ZHANG Lifu, CHEN Xiaoping, et al (7036)
……
……………………………………………………………………
Effects of snow pack removal on soil hydrolase enzyme activities in an alpine Abies faxoniana forest of western Sichuan
YANG Yulian, WU Fuzhong, YANG Wanqin, et al (7045)
………………
………………………………………………………………………
Effects of different soil water treatments on photosynthetic characteristics and grain yield in rice
WANG Weixiao, LIU Xiaojun, TIAN Yongchao, et al (7053)
………………………………………
……………………………………………………………………
Growth characteristics, lignin degradation enzyme and genetic diversity of Fomes fomentarius by SRAP marker among populations
CAO Yu, XU Ye, WANG Qiuyu (7061)
…
……………………………………………………………………………………………
Effects of the invasion by Solidago canadensis L. on the community structure of soil animals
CHEN Wen, LI Tao, ZHENG Rongquan, et al (7072)
…………………………………………
……………………………………………………………………………
Effects of intercropping on quality and yield of maize grain, microorganism quantity, and enzyme activities in soils
ZHANG Xiangqian,HUANG Guoqin, BIAN Xinmin, et al (7082)
…………………
…………………………………………………………………
Influence of mycorrhizal inoculation on competition between plant species and inorganic phosphate forms
ZHANG Yuting, ZHU Min, XIAN Yanxiangwa, et al (7091)
……………………………
………………………………………………………………………
The stable nitrogen isotope of size鄄fractioned plankton and its relationship with biomass during winter in Daya Bay
KE Zhixin, HUNG Liangmin, XU Jun, et al (7102)
…………………
………………………………………………………………………………
Dynamics of toxic and non鄄toxic Microcystis spp. during bloom in the large shallow hypereutrophic Lake Taihu
LI Daming, YE Linlin,YU Yang, et al (7109)
………………………
……………………………………………………………………………………
Activities of antioxidant enzymes and Zn鄄MT鄄like proteins induced in Chlorella vulgaris exposed to Zn2+
YANG Hong, HUANG Zhiyong (7117)
………………………………
………………………………………………………………………………………………
Ecological footprint in fujian based on calculation methodology for the national footprint accounts
QIU Shoufeng, ZHU Yuan (7124)
……………………………………
…………………………………………………………………………………………………
The comparison of CO2 emission accounting methods for energy use and mitigation strategy: a case study of China
YANG Xiai, CUI Shenghui, LIN Jianyi,et al (7135)
…………………
………………………………………………………………………………
Ecological damage assessment of jiaozhou bay reclamation based on habitat equivalency analysis LI Jingmei, LIU Tieying (7146)…
The value assessment of county鄄level ecological assets: a case in Fengning County, Hebei Province
WANG Hongyan,GAO Zhihai,LI Zengyuan,et al (7156)
…………………………………
……………………………………………………………………………
Review and Monograph
Molecular basis for enhancement of plant drought tolerance by arbuscular mycorrhizal symbiosis: a mini鄄review
LI Tao, DU Juan, HAO Zhipeng, et al (7169)
………………………
……………………………………………………………………………………
A review of carbon cycling and sequestration in urban soils LUO Shanghua, MAO Qizheng, MA Keming, et al (7177)……………
overview on methods of deriving fraction of absorbed photosynthetically active radiation (FPAR) using remote sensing
DONG Taifeng, MENG Jihua, WU Bingfang (7190)
………………
………………………………………………………………………………
Research progress on influencing of light attenuation and the associated environmental factors on the growth of submersed aquatic
vegetation WU Mingli, LI Xuyong (7202)…………………………………………………………………………………………
The framework of stoichiometry homeostasis in zooplankton elemental composition SU Qiang (7213)…………………………………
Scientific Note
Abundance and biomass of planktonic ciliates in the sea area around Zhangzi Island, Northern Yellow Sea in July and August
2010 YU Ying, ZHANG Wuchang, ZHANG Guangtao, et al (7220)……………………………………………………………
Research of wildlife resources sustainable development based on entropy method in China
YANG Xitao,ZHOU Xuehong,ZHANG Wei (7230)
……………………………………………
…………………………………………………………………………………
Influence of residue composition and addition frequencies on carbon mineralization and microbial biomass in the soils of agroforestry
systems WANG Yikun,FANG Shengzuo,TIAN Ye,et al (7239)……………………………………………………………………
Seasonal changes in microbial diversity in different cells of a wetland system constructed for municipal sewage treatment
CHEN Yonghua, WU Xiaofu, ZHANG Zhenni,et al (7247)
……………
………………………………………………………………………
《生态学报》2013 年征订启事
《生态学报》是中国生态学学会主办的生态学专业性高级学术期刊,创刊于 1981 年。 主要报道生态学研
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