全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2011, 46 (1): 74–78, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2011.00074

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收稿日期: 2010-05-25; 接受日期: 2010-09-19
* 通讯作者。E-mail: zhuory@gmail.com
麻竹花药诱导再生植株的染色体倍性分析
李海营, 乔桂荣, 刘明英, 蒋晶, 张玲, 卓仁英*
中国林业科学研究院亚热带林业研究所, 富阳 311400
摘要 为阐明麻竹(Dendrocalamus latiflorus)花药培养再生植株的染色体倍性, 利用流式细胞仪和染色体标本制备方法对
麻竹再生植株嫩叶DNA的含量和根尖染色体数目进行了研究。结果表明: 100株花药培养再生植株中有4株为六倍体, 96株
为十二倍体。该结果进一步验证了麻竹花药培养体系, 对麻竹遗传改良和功能基因组学研究具有重要意义。
关键词 花药培养, 染色体, 麻竹, 流式细胞仪
李海营, 乔桂荣, 刘明英, 蒋晶, 张玲, 卓仁英 (2011). 麻竹花药诱导再生植株的染色体倍性分析. 植物学报 46, 74–78.
竹子是重要的森林资源, 世界上有竹类植物70
余属1 200余种, 主要分布于热带和亚热带地区, 少
数种类分布于温带和寒带。中国是世界上最主要的竹
子生产国, 素有“世界竹子看中国”的美誉。我国有
竹类植物48属, 近500种, 主要分布于北纬40°以南
的亚热带、热带地区, 尤以长江以南的浙江、福建、
江西和湖南 4省最为集中 , 竹林面积约 7.2×106
hm2(江泽慧, 2002)。麻竹(Dendrocalamus latiflorus)
隶属禾本科竹亚科、牡竹属麻竹亚属, 自然分布于福
建、台湾、广东、广西、贵州、四川和云南等省, 是
我国热带地区重要的优良、速生、笋材两用的大型丛
生竹种之一。麻竹体细胞染色体数为2n=72±2(李秀兰
等, 1999, 2001)。一般认为竹子染色体基数x=12, 丛
生竹为六倍体 (2n=6x=72), 而散生竹为四倍体
(2n=4x=48)(张光楚, 1985)。因麻竹开花间隔期长且
开花具不可预测性, 杂交育种比较困难, 品种选育主
要以无性系选育为主。利用花药离体培养可以在短期
内获得性状丰富的单倍体或纯合的多倍体植株, 大大
缩短了育种周期。Tsay等(1990)对麻竹花药诱导培
养, 获得十几株单倍体植株, 但未见六倍体和十二倍
体再生植株的报道。乔桂荣等(2010)建立了麻竹花药
诱导培养体系, 获得了500多株花药诱导再生植株。
本研究以中国重要的丛生竹种——麻竹为实验
材料, 比较了人工控制授粉实生苗和花药培养再生植
株幼嫩叶片的DNA含量及根尖染色体的数目, 发现
花药培养获得的再生植株DNA含量与实生苗大致相
同或者约是其亲本植株DNA含量的2倍, 根尖染色体
数目为2n=72或2n>135。
1 材料与方法
1.1 材料
麻竹(Dendrocalamus latiflorus Munro)开花植株取自
福建永安。乔桂荣等(2010)对其花药进行诱导培养获
得再生植株, 在开花植株的枝条上获得麻竹种子, 播
种获得实生苗。实验中所用的叶片和根尖均取自本实
验室温室培育的实生苗和花药培养再生植株。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA含量的测定
利用FACSCalibur流式细胞仪系统(美国BD公司)测
定麻竹实生苗与花药培养再生植株的基因组DNA含
量。
首先采用Otto(1990)的方法制备细胞悬液样品。
样品制备的具体步骤如下: (1) 取麻竹未展开的新叶
1–2片, 洗净除中脉后置于培养皿中, 移取1 mL Otto I
溶液(0.1 mol·L–1柠檬酸, 0.5%吐温–20, 4°C下保存
备用), 用双面刀片在Otto I溶液中将竹叶划碎; (2) 用
移液枪吸取含有嫩叶细胞的Otto I溶液, 经0.54 µm
尼龙筛网过滤至1.5 mL Eppendorf管中; (3) 10 000
·技术方法·
李海营等: 麻竹花药诱导再生植株的染色体倍性分析 75
xg离心30秒; (4) 用1 mL移液枪移去上清至0.1 mL
处, 加入新鲜的Otto I溶液100 µL悬浮沉淀。在准备
用流式细胞仪检测样品时 , 向样品中加入600 µL
Otto II溶液(0.4 mol·L–1磷酸氢二钠, 室温下保存备
用 ) 和 100 µL 碘 化 丙 啶 (PI) 溶 液 , 然 后 利 用
FACSCalibur流式细胞仪系统进行样品检测(桂毅杰
等, 2007)。

1.2.2 根尖染色体标本的制备和观察
采用陈瑞阳等(1982)的去壁低渗法, 对3株实生苗和
10株花药培养再生植株的根尖体细胞进行染色体观
察计数, 对每株至少10个根尖分裂中期的细胞的染
色体数目及所占比例进行统计分析。取生长旺盛的根
尖, 在饱和α-溴萘溶液中25°C处理3小时, 然后用新
鲜固定液(甲醇:冰乙酸=3:1)在4°C下固定24小时, 用
清水漂洗后转移至70%乙醇中4°C保存备用。制片时,
用水洗净根尖后, 置于凹玻片中, 用20 µL终浓度为
3%的纤维素酶和20 µL1%的果胶酶28°C酶解2.5–3
小时。吸去酶液, 水洗3次, 用吸管或镊子将材料夹出
并置于载玻片上, 加半滴卡宝品红, 用解剖针捣碎
(轻捣)。盖上盖玻片, 压片(轻压)后在普通显微镜下观
察计数。
2 结果与讨论
2.1 叶细胞DNA含量的比较
利用流式细胞仪可以对处于快速流动中的细胞或生
物颗粒进行各种参数的快速定量分析。该技术首先利
用特异荧光染料进行细胞核染色, 染色后的单细胞在
鞘液的包被下单行排列, 依次通过激光照射区时, 受
特异光源激发, 样品产生散射和激发荧光; 这些荧光
信号被光电倍增管接收, 然后转换为电信号和可被计
算机识别的数字信号, 荧光的强弱代表了核物质的浓
度, 即荧光强弱与细胞核DNA含量成正比。流式细胞
仪检测过程中变异系数(coefficient of variation, CV)
反映了测定结果的分辨率或精确度, 一般认为变异系
数在5%以内的结果是可靠的(桂毅杰等, 2007; 李潞
滨等, 2008)。在本研究的测定过程中该指标均控制在
4.0%以下。
利用流式细胞仪测定麻竹实生苗和花药离体培
养再生植株的DNA含量, 结果如图1所示。以麻竹实
生苗植株DNA含量(图1A)为参照, 根据实生苗和组培
苗G0/G1峰值的比较(表1), 对10株麻竹实生苗和100
株花药培养再生植株的DNA含量进行对比发现, 4株
花药培养再生植株的DNA含量大致与实生苗相同(图
1B), 96株花药培养再生植株的DNA含量约为实生苗
的2倍(图1C)。
2.2 根尖细胞染色体观察
通过对麻竹实生苗和花药培养再生植株的体细胞有
丝分裂中期染色体数目进行观察, 发现实生苗的体细
胞染色体数目在68–72条之间, 且染色体数为72的细
胞占所观察的有丝分裂中期细胞总数的47.9%(表2)。
流式细胞仪检测中DNA含量与实生苗相同的花药培
养再生植株的体细胞染色体数目为68–72条, 且染色
体数为72的细胞占观察细胞总数的48.8%(表2)。而流
式细胞仪检测中DNA含量约为实生苗2倍的花药培养
再生植株的体细胞染色体数目为73–120或>120, 而
且染色体数>120的细胞占观察细胞总数的61.8%(表
2), 因此麻竹根尖细胞学观察结果与流式细胞仪测定
结果基本相符。麻竹属于丛生竹种, 体细胞染色体数
为2n=72±2(李秀兰等, 1999, 2001)。经观察发现麻竹
实生苗根尖有丝分裂中期细胞的染色体数为
2n=72(图2A), 因此我们根据花药培养再生植株体细
胞染色体数目和DNA含量将花药离体培养再生植株
分为2类, 即六倍体(图2B)和十二倍体(图2C)。花药培
养再生植株染色体数目加倍的机制可能是离体花药
在诱导培养基上培养时间过长及愈伤组织继代次数
过多。
胡含等(1978, 1980)在小麦(Triticum aestivum)


表1 麻竹实生苗和花药培养再生植株DNA含量的比较
Table 1 Comparison of DNA content between seedlings and anther regeneration plants of Dendrocalamus latiflorus
Seedling (6x) Anther regeneration plant (6x) Anther regeneration plant (12x)
Number of tested samples 10 4 96
DNA content (Mb) 28.93–32.67 29.26–30.69 52.62–71.02
76 植物学报 46(1) 2011


图1 麻竹实生苗和花药培养再生植株的流式细胞仪检测结果
(A) 实生苗(6x); (B) 花药培养再生植株(6x); (C) 花药培养再生植株(12x)

Figure 1 Comparison of DNA content between seedlings and anther regeneration plants of Dendrocalamus latiflorus using flow
cytometry
(A) Seedling samples (6x); (B) Anther regeneration plants (6x); (C) Anther regeneration plants (12x)



图2 麻竹实生苗和花药培养再生植株根尖有丝分裂中期细胞的染色体数目观察
(A) 实生苗(6x)植株根尖染色体压片, 染色体数为72; (B) 花药培养再生植株(6x)根尖染色体压片, 染色体数为72; (C) 花药培养再
生植株(12x)根尖染色体压片, 染色体数>135。Bar=10 µm

Figure 2 Images of mitotic metaphase chromosomes of the seedling samples and anther regeneration plants of Dendrocala-
mus latiflorus
(A) The chromosomes in seedling sample (6x), total number=72; (B) The chromosomes in anther regeneration plants (6x), total
number=72; (C) The chromosomes in anther regeneration plants (12x), total number>135. Bar=10 µm
李海营等: 麻竹花药诱导再生植株的染色体倍性分析 77
表2 麻竹实生苗和花药培养再生植株染色体数目的比较
Table 2 Comparison of the chromosome number in the
seedling samples and anther regeneration plants of Den-
drocalamus latiflorus
Number
of tested
samples
Number of
chromo-
somes
Number of
mitotic-
metaphase cells
68 5
69 3
70 11
71 6
Seedling (6x) 3
72 23
68 7
69 2
70 6
71 6
Anther regenera-
tion plant (6x)
2
72 20
73–100 16
100–120 18
Anther regenera-
tion plant (12x)
8
>120 55


花药离体培养中除得到三倍体植株外, 也得到了六倍
体、八倍体和不同染色体数目的非整倍体植株。
Collins等 (1972)对大麦 (Hordeum vulgare)和烟草
(Nicotiana tabacum)花药离体培养再生植株的染色
体倍性进行了研究, 也得到单倍体、多倍体及非整倍
体植株。迄今为止, 在玉米(Zea mays)花药离体培养
过程中, 多倍体和结构变异的植株均尚未得到。这可
能与不同物种的遗传背景、倍性和进化程度有关。许
多学者认为在离体培养条件下, 容易引起植株体细胞
的核内有丝分裂、核融合、核内复制以及多极有丝分
裂, 这些有丝分裂的异常过程是产生混倍体、染色体
加倍以及染色体数发生变异的重要原因(胡含和陈英,
1977)。本实验中所观察到的染色体数大于135的细胞
其产生的具体机制还有待进一步研究。在杨树、小麦、
大麦、烟草和水稻(Oryza sativa)的花药离体培养研究
中均发现了非整倍体现象, 但由于麻竹染色体数目较
多, 在压片过程中有一定的困难, 因此麻竹花药离体
培养再生植株染色体的非整倍现象不容易鉴定。
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78 植物学报 46(1) 2011
Analysis of Ploidy in Dedrocalamus latiflorus Plants Obtained
by Anther Culture
Haiying Li, Guirong Qiao, Mingying Liu, Jing Jiang, Ling Zhang, Renying Zhuo*
Research Institute of Subtropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Fuyang 311400, China
Abstract Regeneration plants were initiated from bamboo (Dedrocalamus latiflorus) anthers, and chromosome number
and nuclear DNA content were detected by chromosome analysis and flow cytometry. Among 100 regeneration plants, 4
were hexaploid, and the chromosome number of the other plants was twice that of the parents. These results demonstrate
the anther culture of bamboo and have importance for functional genomics research and genetic improvement.
Key words anther culture, chromosome, Dedrocalamus latiflorus, flow cytometry
Li HY, Qiao GR, Liu MY, Jiang J, Zhang L, Zhuo RY (2011). Analysis of ploidy in Dedrocalamus latiflorus plants
obtained by anther culture. Chin Bull Bot 46, 74–78.
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* Author for correspondence. E-mail: zhuory@gmail.com
(责任编辑: 刘慧君)