全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2013, 48 (1): 34–41, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2013.00034
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收稿日期: 2012-05-22; 接受日期: 2012-08-30
基金项目: 国家自然科学基金(No.30971847)和转基因生物新品种培育重大专项(No.2011ZX08002-002, No.2009ZX08009-084B)
* 通讯作者。E-mail: penghuiru@cau.edu.cn
小麦中编码未知蛋白的热胁迫响应基因TaWTF1的
克隆和功能分析
秦丹丹1, 2, 谢颂朝2, 刘刚2, 倪中福2, 姚颖垠2, 孙其信2, 3, 彭惠茹2*
1湖北省农业科学院粮食作物研究所, 武汉 430064; 2中国农业大学, 北京 100193
3西北农林科技大学, 杨陵 712100
摘要 WTF1 (What’s this factor 1)是包含“Domain of Unknown Function 860”(DUF860)的一类蛋白, 特异定位于植物细
胞叶绿体或线粒体中, 在内含子的剪切中发挥作用。在研究小麦(Triticum aestivum)热胁迫转录谱时发现一个包含该结构域
的探针受高温诱导表达。通过对其所编码的基因TaWTF1进行克隆并详细分析, 发现该基因的启动子区包含HSE、干旱、
GA及SA等胁迫和激素响应元件, 且该基因在苗期和开花期均受热胁迫诱导表达。在开花期, TaWTF1在普通叶中的表达显
著高于包括旗叶在内的其它组织器官。进一步将该基因在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中超表达, 显著提高了转基因植株
在热胁迫下的成活率, 说明TaWTF1参与了植物耐热性。该研究为解析植物耐热性分子机理开辟了新的领域, 并为作物耐热
性分子育种提供了候选基因。
关键词 热胁迫, 未知蛋白, 小麦, WTF1
秦丹丹, 谢颂朝, 刘刚, 倪中福, 姚颖垠, 孙其信, 彭惠茹 (2013). 小麦中编码未知蛋白的热胁迫响应基因TaWTF1的克隆
和功能分析. 植物学报 48, 34–41.
在真核生物中, 约有1/4的基因组序列编码功能
未知的蛋白(Song et al., 2008)。这些蛋白大部分不包
含任何已知的结构域(基序), 但是大量转录谱和蛋白
谱分析发现这些未知蛋白在生物的生命过程中发挥
着很重要的作用, 对这些基因的研究将有助于我们在
全新的层面上全面透彻地了解生物体复杂的生命活
动, 因此具有重要意义。Song等(2008)利用生物信息
学方法对拟南芥(Arabidopsis thaliana)中未知功能的
基因进行了分析, 并对其中23个受氧化胁迫调控的
基因在拟南芥中进行了超表达, 其中2个基因的超表
达提高了植株的抗氧化胁迫能力, 说明目前在植物中
存在未知的抗氧化胁迫机制和通路。
WTF1(What’s this factor 1)是包含DUF860 (Do-
main of Unknown Function 860)结构域的一类蛋白,
该结构域蛋白特异地定位于植物细胞器中(叶绿体或
者线粒体 ), 因此又被称为PORR(Plant Organelle
RNA-Recognition)结构域(Kroeger et al., 2009)。最
早关于这类蛋白功能的研究是在2006年, Konishi和
Sugiyama(2006)发现了一个温度敏感的根原基缺失
突变体rpd1, 之后通过图位克隆获得了该基因, 经分
析发现该基因编码的是植物特异蛋白, 但不包含任何
已知的结构域。
Kroeger等(2009)利用免疫共沉淀方法分析了玉
米(Zea mays)叶绿体中与剪接因子CRS1、CAF1和
CAF2互作的内含子核糖核蛋白颗粒(ribonucleopro-
tein particles, RNPs)。通过质谱分析共鉴定出2个内
含子RNPs, 其中一个包含DUF860结构域。因为目前
还没有关于这类结构域功能的报道, 因此将该基因命
名为ZmWTF1。在水稻(Oryza sativa)和拟南芥中分
别有17和15个包含DUF860结构域的蛋白, 分为14
个同源群。生物信息学分析发现, 该类蛋白多数存在
于叶绿体中。为了研究这类基因的功能, Kroeger等
(2009)通过筛选因转座子插入而导致的不能正常进
行光合作用的玉米突变体, 共鉴定出3个WTF1基因
的突变体, 该基因的突变导致了叶片部分或者全部白
化, 进一步研究发现其主要参与了叶绿体内基因的第
·研究报告·
秦丹丹等: 小麦中编码未知蛋白的热胁迫响应基因 TaWTF1的克隆和功能分析 35
II类内含子的剪切。
我们在对小麦(Triticum aestivum)热胁迫基因表
达谱进行分析的过程中发现, 在所鉴定的6 560个热
胁迫响应探针中, 有25%的探针没有任何同源序列或
者注释信息, 可能编码未知蛋白, 这些基因可能在植
物热胁迫信号转导途径以及耐热性产生过程中发挥
着重要作用(Qin et al., 2008)。本研究挑选了其中1个
受热胁迫剧烈诱导表达的探针, 以该探针序列为基
础, 通过生物信息学分析, 获得了一个包含该探针序
列的完整开放阅读框, 所编码的氨基酸序列包含典型
的DUF860结构域, 该基因被命名为TaWTF1。进一
步对该探针所编码的基因进行克隆和功能分析, 以期
为小麦耐热性分子机理研究开辟新的领域和思路, 并
为作物耐热性分子育种提供候选基因。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究所用材料为耐热小麦(Triticum aestivum L.)
TAM107。
1.2 方法
1.2.1 TaWTF1的克隆
首先根据芯片中编号为“Ta.12694.1.S1_at”的探针
序列设计特异性引物, 以热胁迫处理后的TAM107叶
片cDNA为模板进行PCR扩增, 获得特异条带后进行
克隆和测序以验证探针序列。
以验证后的探针序列为种子序列, 在NCBI(www.
NCBI.nlm.nih.gov)中通过Blast搜索与之高度同源的
小麦EST序列并进行拼接, 根据经过拼接获得的包含
完整开放阅读框的序列设计特异性引物, 在小麦中进
行克隆和测序验证。
1.2.2 材料处理
将正常条件(Qin et al., 2008)下生长10天的幼苗在
40°C高温条件下进行热胁迫处理, 处理时间分别为
0.25、0.5、1、2、12和24小时, 剪取叶片迅速置于
液氮中, –80°C保存备用。以未进行任何高温处理的
材料作为对照。
对正常生长至开花期的TAM107植株进行不同时
间的40°C高温处理, 分别取旗叶及整个穗子迅速置于
液氮中, –80°C保存。以同期未进行任何高温处理的
材料作为对照。
在正常生长季节内, 从开花期开始, 取TAM107
的雄蕊(stamen)、雌蕊(pistil)、茎(stem)、旗叶(flag
leaf)、普通叶(leaf)、授粉10天(10DAP)和20天(20-
DAP)的籽粒, 迅速置于液氮中, –80°C保存备用。
1.2.3 表达分析
采用Trizol试剂(Invitrogen)进行RNA提取, 反转录使
用MML逆转录酶(Promega), 利用Oligo T15引物进行
cDNA的合成 , 操作步骤均参照公司提供的实验手
册。将产物稀释5倍后作为PCR扩增的模板。表达分
析采用实时定量PCR, 所用试剂为SYBR® Premix Ex
TaqTM试剂盒(Takara), 基因特异引物为RT335024-
1163和Ta.12694-R, 内标基因为TaACTIN, 引物序
列见表1。
1.2.4 WTF1基因的同源进化关系分析
根据Kroeger等(2009)的分析结果, 利用ClustalW软
件将拟南芥和水稻中包含DUF860结构域的蛋白序列
与TaWTF1、ZmWTF1以及短柄草 (Brachypodium
distachyon)同源基因BdWTF1所编码的氨基酸序列
进行同源比对, 通过TREEVIEW查看结果, 参数均为
默认值。
1.2.5 TaWTF1超表达载体的构建及转化拟南芥
利用Gateway(Invitrogen)体系构建35S启动子驱动的
TaWTF1超表达载体, 操作步骤参照公司提供的实验
手册。大肠杆菌(Escherichia coli)菌株为DH5α, 农杆
菌菌株为GV3101。使用冻融法转化农杆菌, 并使用
蘸花法转化拟南芥(Clough and Bent, 1998), 筛选后
获得纯系转基因后代。利用半定量PCR进行目的基因
表达量检测, 将纯合的超表达株系用于耐热性鉴定。
1.2.6 转基因拟南芥的耐热性鉴定
制备MS培养基平板。对经筛选确定为纯系的T3代种
子进行消毒, 并用无菌水清洗6–7次。将种子平铺在
MS培养基上, 4°C春化3天后, 移入22°C(16小时光
照)/18°C(8小时黑暗)培养室中。培养7天后, 进行3小
时的45°C热胁迫处理, 然后置于正常培养条件下进
行恢复生长。4天后统计死亡率。
36 植物学报 48(1) 2013
表1 本文所用引物列表
Table 1 Sequence of primers used in this paper
Primer Tm (°C) Sequence (5–3)
T15 TTTTTTTTTTTTTTT
TaACTIN-L 58.0 GGAATCCATGAGACCTAC
TaACTIN-R 58.0 GACCCAGACAACTCGCAAC
Ta.12694-L 59.0 CTCCAACTTCCACGACACCA
Ta.12694-R 59.0 ACCCAGCAGAGCACATCAA
AK335024-L 58.7 AAATGGAGGCCAAGCTGCT
AK335024-R 59.2 TCTCAAAATAGCTCAGTTTACCACC
RT335024-1163 59.0 TGAGGGCTCTTGTTATGGTTCCA
335024-gate-L 58.7 AAAAAGCAGGCTTCAAATGGACGCCAAGCTGCT
335024-gate-R 59.2 AAGAAAGCTGGGTCTCTCAAAATAGCTCAATTTACCACC
下划线指示Gateway(Invitrogen)重组位点序列。Underlines indicate the att sequence of Gateway (Invitrogen).
2 结果与讨论
2.1 TaWTF1的克隆
首先根据编号为“Ta.12694.1.S1_at”的探针序列设
计特异性引物对Ta.12694-L和Ta.12694-R(表1), 以
TAM107叶片cDNA为模板进行扩增, 获得预期大小
的特异片段后进行克隆测序, 结果表明所获得的序列
与探针序列一致(结果未显示)。随后, 在NCBI中搜索
该序列的同源序列, 结果除少数SNP外, 发现一条
可以完全包含该探针序列的小麦EST序列(GB:AK-
335024)(图1), 进一步分析发现该EST序列也包含
完整的开放阅读框(图1A)。根据AK335024序列设计
特异性引物对AK335024-L和AK335024-R(表1), 并
在TAM107中克隆该基因。测序结果表明, 所获得序
列与AK335024一致, 将其确定为目标基因。对该基
因所编码的氨基酸序列在NCBI中进行保守域(Mar-
chler-Bauer et al., 2011)分析发现, 该序列包含典型
的PORR结构域(图1A, B)。该结构域最早被称为
DUF860, 玉米ZmWTF1即包含该结构域。PORR结
构域是叶绿体中第2类内含子核糖核蛋白颗粒的组
成之一 , 可与RNC1形成异质二聚体 , 在内含子的
剪切过程中发挥重要作用(Kroeger et al., 2009)。本
研究所克隆的基因编码氨基酸序列C端 , 也包含
典型的PORR结构域 (图1B), 说明该基因属于此
类家族基因。根据玉米中的相关研究, 将其命名为
TaWTF1。
2.2 植物中WTF1基因同源进化关系分析
二穗短柄草作为一种新型的禾本科模式植物, 与小麦
存在较高的微共线性, 是小麦基因组序列未公开前进
行小麦相关研究最理想的模式植物(陈军营等, 2008)。
利用AK335024序列寻找同源的短柄草序列, 发现该
序列与短柄草中预测的基因Bradi2g15890.1在核苷
酸水平上具有86%的相似性, 该短柄草基因被命名为
BdWTF1。
拟南芥和水稻中分别存在15个和17个包含DUF-
860结构域的基因(Kroeger et al., 2009), 将这些基
因的氨基酸序列与本研究中的TaWTF1以及短柄草
和玉米的同源基因BdWTF1和ZmWTF1编码氨基酸
序列进行比较分析发现, TaWTF1与BdWTF1同源性
最高, 其次为ZmWTF1基因(图2)。在水稻和拟南芥中
也分别存在1个与TaWTF1基因相似度极高的基因,
这5个基因的氨基酸序列在PORR结构域也高度保
守(结果未显示), 说明了该基因在进化中的高度保守
性。根据Kroeger等(2009)的研究结果推测, TaWTF1
位于植物细胞的叶绿体中。
2.3 TaWTF1启动子区域顺式作用元件分析
根据AK335024序列, 在http://www.cerealsdb.uk.net/
网站上进行该基因5′上游启动子序列的搜索和拼接,
对拼接到的ATG上游1 304 bp的序列进行顺式作用
元件分析(图3)。研究结果表明, 该区域除包含热激元
件(heat shock response element, HSE)外, 还包含
秦丹丹等: 小麦中编码未知蛋白的热胁迫响应基因 TaWTF1的克隆和功能分析 37
图1 AK335024及其编码氨基酸序列
(A) AK335024及其编码氨基酸序列; (B) AK335024编码氨基酸序列保守域。图A中下划线指示保守域位置。*表示终止密码子
Figure 1 AK335024 nucleotide and its encoding protein sequence
(A) Nucleotide and amino acid sequence of AK335024; (B) Conserved domain of amino acid sequence encoded by AK335024.
Underlines in Figure A indicate the conserved PORR domain. * denotes stop codon
多种激素响应元件, 如ABA、GA、SA和MeJA等。
2.4 TaWTF1的表达分析
2.4.1 TaWTF1在热胁迫下的表达分析
在通过芯片研究小麦苗期热胁迫下基因表达谱(Qin
et al., 2008)的过程中, 我们检测到探针“Ta.12694.
1.S1_at”无论是在耐热基因型TAM107, 还是在热敏
感基因型中国春(Chinese Spring, CS)中, 在40°C的
直接热胁迫下处理1小时表达水平并没有提高, 但是
经过3小时34°C热锻炼后再进行1小时40°C的热胁迫
处理(1sh)或进行24小时热胁迫处理(24sh和24h)都
可以明显提高该基因的表达量(图4A)。通过实时定量
检测该基因在热胁迫下的动态表达量 , 我们发现 ,
在热胁迫早期(0.5–2小时), 该基因的表达没有明显
变化, 但是12小时持续到24小时的热胁迫显著提高
了该基因的表达量(图4B)。在小麦开花期, 我们同样
检测到, 无论是旗叶还是穗子中, 该基因对热胁迫的
响应都比较缓慢(图4C), 并且在旗叶中的上调表达显
著高于穗子。
2.4.2 TaWTF1在小麦开花期不同组织器官中的表
达模式
在NCBI中搜索unigene“Ta.12694”的EST表达模式
(表2)发现, Unigene在小麦花、花序、叶片、种子和
茎秆中均有表达。进一步通过实时定量检测该基因在
小麦不同组织器官中的表达, 结果表明, 在雄蕊、雌
38 植物学报 48(1) 2013
图2 植物中WTF1基因的同源进化关系
Figure 2 Phylogenetic analysis of WTF1 in plants
表2 Ta.12694的EST表达模式
Table 2 EST profile of unigene Ta.12694
Pool name Transcripts
per million
(TPM)
Spot intensity
based on
TPM
Gene
EST/Total
EST in pool
Callus 0 0/10609
Cell culture 0 0/10164
Crown 0 0/13685
Flower 30 2/64599
Inflorescence 16 2/121335
Leaf 69 4/57699
Root 0 0/167008
Seed 6 1/162266
Sheath 0 0/1102
Stem 53 5/93668
蕊、旗叶、普通叶、茎秆、授粉后10天和20天的籽粒
中也有该基因的表达, 而且在普通叶中的表达量显著
高于包括旗叶在内的其它组织器官(图5)。
2.5 TaWTF1与植物耐热性的关系
为了研究TaWTF1与植物耐热性的关系, 我们将该基
因在拟南芥中进行了超表达。通过半定量PCR检测目
的基因在所获得的纯合转基因后代中的表达水平。从
图6A可以看出, 在野生型中检测不到TaWTF1的表
达, 但是转基因株系中该基因的表达显著上调。
将正常条件下生长7天的野生型拟南芥和转基因
图3 TaWTF1基因启动子区域顺式作用元件示意图
Figure 3 Cis-elements in the promoter of TaWTF1
秦丹丹等: 小麦中编码未知蛋白的热胁迫响应基因 TaWTF1的克隆和功能分析 39
图4 TaWTF1在热胁迫下的表达
(A) Ta.12694.1.S1_at在热胁迫下的表达; (B) TaWTF1在10天
苗龄的叶片中热胁迫下的动态表达; (C) TaWTF1在开花期热胁
迫下的动态表达(ear: 穗子; flag: 旗叶)。CS: 中国春; CK: 对
照; h: 直接40°C热胁迫; sh: 经过3小时34°C热锻炼后再进行
40°C的热胁迫处理
Figure 4 Expression of TaWTF1 under heat stress
(A) Expression of Ta.12694.1.S1_at under heat stress; (B)
Dynamic expression of TaWTF1 under heat stress at the
10-day seedling stage; (C) Dynamic expression of TaWTF1
under heat stress at flowering stage (ear: Spike; flag: Flag
leaf). CS: Chinese spring; CK: Control; h: 40°C heat treat-
ment; sh: 40°C heat treatment with 3 hours’ 34°C pre-heat
treatment
图5 TaWTF1在小麦开花期不同组织器官中的表达
Figure 5 Spatial expression of TaWTF1 in different organs
of wheat at flowering stage
株系进行2小时45°C的热胁迫处理后恢复生长3天,
观察并统计其生长状况。结果表明, 野生型的成活率
仅约为20%, 而所检测的3个转基因株系与野生型相
比均有显著提高, 分别为55%(38-6-1)、45%(15-5-1)
和62%(44-5-2)(图6B, C)。说明该基因的超表达增强
了拟南芥的耐热性。
2.6 讨论
本研究在前期工作的基础上, 基于小麦热胁迫响应探
针“Ta.12694.1.S1_at”序列, 通过同源比对在NCBI
上搜索到一条完全包含该探针序列的小麦EST(GB:
AK335024)。该EST序列包含完整的开放阅读框, 编
码的氨基酸序列包含典型的PORR结构域(也称为
DUF860结构域), 根据玉米中的相关研究将其命名
为TaWTF1。拟南芥和水稻中分别有15和17个该基因
家族成员, 这些基因在序列上高度保守, 因此可能具
有相似的功能。
在前期的研究中我们发现 , 小麦经过3小时的
34°C热锻炼后再进行40°C热胁迫处理1小时(1sh),
其全基因组水平上的转录谱与经过24小时的40°C热
胁迫处理 (24sh和24h)小麦极为相似 (Qin et al.,
2008)(图4A)。本研究所选择的探针即为这种表达模
式(图4A), 它与大部分热胁迫响应转录因子的表达模
式相反(Qin et al., 2008)。更深入的研究结果也表明,
该基因对热胁迫的应答反应较慢(图4B,C)。另外, 该
基因的启动子区域存在HSE, 推测其可能是热激转
录因子的调控基因, 是热胁迫信号转导途径中较为下
游的组分。
玉米WTF1基因突变导致叶片白化(Kroeger et
40 植物学报 48(1) 2013
图6 拟南芥TaWTF1超表达转基因后代的耐热性鉴定
(A) 转基因后代中TaWTF1表达量检测; (B) 野生型和TaWTF1超表达植株在对照和热胁迫处理后的状况; (C) 野生型和TaWTF1超
表达植株在热胁迫后的成活率统计(**P<0.01)。CK: 对照; HS: 热胁迫; WT: 野生型
Figure 6 Thermotolerance analysis of TaWTF1 over-expressed transgenic lines
(A) Expression level of TaWTF1 in purified transgenic lines; (B) Performance of WT and TaWTF1 over-expressed lines under
control and heat stress condition; (C) Survival rate of WT and TaWTF1 over-expressed lines under heat stress (**P<0.01). CK:
Control; HS: Heat stress; WT: Wild type
al., 2009), 而拟南芥中包含该结构域的基因突变导
致根系不能正常发育(Konishi and Sugiyama, 2006),
目前还没有关于该类基因与植物耐热性的报道。本研
究将小麦中的同源基因TaWTF1在拟南芥中超表达,
提高了植株的耐热性。ZmWTF1位于叶绿体中, 可以
与CAF1和CAF2形成复合体, 参与叶绿体中第II类内
含子的剪切。最近的研究表明, 拟南芥中该家族的另
一个成员TaWTF9参与了线粒体基因ypl2和ccmF(c)
第II类内含子的剪切(des Francs-Small et al., 2012)。
本研究结果显示 , 无论是在苗期还是开花期 , Ta-
WTF1基因的表达都受到热胁迫诱导, 而且在研究小
麦热胁迫下基因表达谱的过程中(秦丹丹, 2008), 我
们也检测到2个受热胁迫诱导的小麦CAF1基因。张庆
波(2009)对这2个基因进行了分析, 发现TaCAF1a与
Ta.12694.1.S1_at在热胁迫下的表达模式相似, 并且
克隆到TaCAF1a基因起始密码子上游1 723 bp的启
动子序列, 分析发现该区域也存在HSE以及多种激
素响应元件, 如ABA、SA和IAA等, 这也与TaWTF1
基因类似。说明在热胁迫下, TaWTF1可能通过与
TaCAF1a互作共同参与植物的热胁迫响应过程。同时
也暗示, 该未知基因最终可能还是通过已知途径来参
与调控植物的耐热性。
秦丹丹等: 小麦中编码未知蛋白的热胁迫响应基因 TaWTF1的克隆和功能分析 41
参考文献
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1Institute of Food Crops, Hubei Academy of Agricultural Science, Wuhan 430064, China; 2China Agricultural University,
Beijing 100193, China; 3Northwest Agriculture and Forest University, Yangling 712100, China
Abstract What’s this factor 1 genes (WTF1s) encode a group of proteins with Domain of Unknown Function 860 which
are localized specifically in the plant chloroplast and mitochondria and play an important role in intron splicing. Previously,
a heat-responsive probe with this conserved domain was identified in the Affymetrix Wheat Genome Array. With the probe
sequence, the open reading frame was cloned from wheat and was named TaWTF1. Bioinformatics analysis showed that
the promoter of TaWTF1 contained some stress- and hormone-responsive elements including a heat-shock element.
TaWTF1 gene expression was induced by heat treatments at the seedling and flowering stages. Moreover, the expression
of this gene was higher in the common leaves. Importantly, overexpression of TaWTF1 improved the survival rate of
Arabidopsis under heat stress. This study provides valuable information to understand more about the molecular mecha-
nism of thermotolerance in plants.
Key words heat stress, unknown function, wheat, WTF1
Qin DD, Xie SC, Liu G, Ni ZF, Yao YY, Sun QX, Peng HR (2013). Isolation and functional characterization of heat-
stress-responsive gene TaWTF1 from wheat. Chin Bull Bot 48, 34–41.
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* Author for correspondence. E-mail: penghuiru@cau.edu.cn
(责任编辑: 孙冬花)