全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2016, 51 (1): 130–143, www.chinbullbotany.com
doi: 10.11983/CBB14216
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收稿日期: 2014-12-25; 接受日期: 2015-03-30
基金项目: 国家自然科学基金(No.31371407)、浙江省钱江人才计划(No.2013R10074)、人力资源和社会保障部留学人员择优资助项目
(No.ZC304013131)和浙江省自然科学基金(No.LY12C14001)
* 通讯作者。E-mail: jzliu@zjnu.cn
亚硝基化在植物细胞死亡及防御反应中的作用
刘振, 刘霞, 刘建中*
浙江师范大学化学与生命科学学院, 金华 321004
摘要 亚硝基化是近年来新发现的不依赖于环磷酸鸟苷的一氧化氮信号转导途径, 是一氧化氮分子通过共价结合修饰靶蛋
白的半胱氨酸残基从而改变其功能的过程。该文重点综述了近年来亚硝基化在细胞死亡和抗病反应这两个紧密关联的生物
学过程中的最新研究成果, 总结了亚硝基化通过修饰和调控靶蛋白从而促进或抑制细胞死亡和抗病反应, 并对现有研究结
果中某些不一致之处提出自己的观点。最后根据动物学领域的最新研究进展对植物学领域未来亚硝基化的研究方向进行了
展望。
关键词 细胞死亡, 抗病性, 一氧化氮, 亚硝基谷胱甘肽还原酶, 亚硝基化
刘振, 刘霞, 刘建中 (2016). 亚硝基化在植物细胞死亡及防御反应中的作用. 植物学报 51, 130–143.
一氧化氮(nitric oxide, NO)是一个具生物活性的
气体小分子, 在动植物的生长发育、病理及生理反应
等方面起着广泛的作用 (Lamattina et al., 2003;
Wendehenne et al., 2004; Mannick, 2007; 王鹏程
等, 2009; 姚涛等, 2011)。在植物中, NO调控气孔关
闭(Neill et al., 2002)、开花时间(He et al., 2004)、细
胞死亡(Delledonne et al., 1998)以及对细菌和病毒
的抗性(Durner et al., 1998; Klessig et al., 2000;
Wendehenne et al., 2004; Zeidler et al., 2004)。
亚硝基化是近年来新发现的不依赖于环磷酸鸟
苷(cyclic guanosine monophosphate, cGMP)的NO
信号转导途径。它是一个基于细胞内氧化还原(redox)
状态的反应, 即将NO加到蛋白的半胱氨酸残基上而
起到改变蛋白功能的作用(Astier et al., 2012)。此反
应不是酶促反应, 而是一种依赖于NO浓度的可逆反
应。在有还原剂存在的条件下可发生去亚硝基化
(de-nitrosylation)反应。一个蛋白能否被亚硝基化取
决于其半胱氨酸残基两端的氨基酸组成及蛋白形成
的空间结构。亚硝基化一般只发生在蛋白的1或2个半
胱氨酸残基上, 靶蛋白被亚硝基化后, 其功能被改
变。蛋白功能的改变包括增强或抑制蛋白酶的活性、
改变蛋白质在细胞内的转运和亚细胞定位等(Stamler
et al., 1997)。自Stamler (1994)首次发现蛋白质的亚
硝基化途径后, 已有大量研究表明, 亚硝基化在不同
的生理和病理过程中发挥着广泛的作用(Hess and
Stamler, 2012)。在动物中已鉴定出上千种亚硝基化
的靶蛋白(Lee et al., 2012; Zhang et al., 2012)。从模
式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中也已鉴定出了
上百种参与不同生物学过程的亚硝基化靶蛋白(Lin-
dermayr et al., 2005; Romero-Puertas et al., 2008;
Sell et al., 2008), 其中包括一些与细胞死亡及抗病
有关的靶蛋白, 如MTA、PrxII E、NPR1和SABP3, 且
已证明其功能受亚硝基化修饰的调控(Lindermayr et
al., 2006; Belenghi et al., 2007; Romero-Puertas et
al., 2007; Tada et al., 2008; Wang et al., 2009; Li et
al., 2013)。迄今为止, 已有大量英文综述性文章总结
了亚硝基化在植物不同生物学过程中所起的作用
(Leitner et al., 2009; Lindermayr and Durner, 2009;
Wang et al., 2010; Gupta, 2011; Astier et al., 2012;
Yu et al., 2012; Groß et al., 2013; Romero-Puertas
et al., 2013; Trapet et al., 2014; Yu et al., 2014), 但
尚未见有对此领域进行系统性总结的中文综述性文
章发表。因此, 我们对亚硝基化在植物细胞死亡和抗
病反应这两个紧密相关联的生物学过程中的研究进
·专题论坛·
刘振等: 亚硝基化在植物细胞死亡及防御反应中的作用 131

展进行全面而系统的综述, 对不同文献中不一致的结
果提出自己的观点和看法, 最后对植物学该领域的发
展前景进行了展望, 希望对国内从事此领域研究的植
物科技工作者有一定的帮助。
1 细胞内蛋白亚硝基化稳态平衡的调控
细胞内亚硝基化稳态平衡(homeostasis)是由细胞内
NO的浓度、氧化还原状态以及去亚硝基化的能力共
同决定的。植物可以通过类似于动物中的一氧化氮合
成酶途径(nitric oxide synthase-associated, NOA)、
多胺途径(polyamine)、胞质中的硝酸还原酶/亚硝酸
还原酶途径 (nitrate/nitrite reductase)、质膜上的
nitrite-NO还原酶途径、线粒体中的亚硝酸盐还原途径
以及位于过氧化物酶体中的黄嘌呤氧化还原酶途径
(xanthine oxidoreductase, XOR)催化产生NO, 也可
在质外体(apoplast)中经非催化途径产生NO (Craw-
ford and Guo, 2005; Yu et al., 2014) (图1)。另外, 微
生物产生的NO对植物也有一定的影响(Crawford and
Guo, 2005; Yu et al., 2014) (图1)。值得一提的是,
NO在植物体内的合成受生物和非生物胁迫诱导(Yu
et al., 2014) (图1)。
亚硝基谷胱甘肽还原酶 (S-nitrosoglutathione
reductase, GSNOR1) (Liu et al., 2001)和硫氧还蛋
白(thioredoxins, TRX) (Benhar et al., 2008; Tada et
al., 2008)是去亚硝基化的关键酶。其功能在细菌、酵
母、哺乳动物及植物中都是保守的(Liu et al., 2001;
Feechan et al., 2005; Benhar et al., 2008; Tada et
al., 2008)。GSNOR1可将GSNO (亚硝基谷胱甘肽)
还原为GSH (谷胱甘肽)和NO。在胁迫条件下, 细胞
内NO浓度升高, NO与GSH结合形成GSNO, GSNO
可将NO反式转移至靶蛋白(Liu et al., 2001; Feechan
et al., 2005) (图1)。GSNO是亚硝基化的NO供体, 亚
硝基化的实现是由GSNO而并非直接由NO介导。细
胞内亚硝基化稳态平衡由GSNO的浓度及去亚硝基
化的能力决定。因此, 在细菌、小鼠(Mus musculus)
及拟南芥中, 失去GSNOR1功能的突变体, 其体内蛋
白亚硝基化水平显著提高(Liu et al., 2001; Feechan
et al., 2005)。
硫氧还蛋白是广泛存在于生物体内的一组大小
只有12 kDa的氧化还原蛋白, 该蛋白通过保守的活
性位点W-C-G(P)-P-C参与硫醇-二硫键的互换反应
来维持细胞内的氧化还原状态 (Michelet et al.,
2006)。遗传与抑制剂实验表明, TRX参与蛋白去亚硝
基化, 即TRX具去亚硝基化酶的活性(denitrosylase)
(Benhar et al., 2008)。在正常状态下, 人的淋巴细胞
中, TRX1-TRXR1 (thioredoxin reductase-1)活跃地
将细胞质中的caspase-3去亚硝基化, 保持稳定的、
较低的亚硝基化水平(Benhar et al., 2008)。一旦有
Fas的刺激, TRX2-TRXR2即介导线粒体中caspase-
3的去亚硝基化, 激活caspase-3的活性, 从而促进
细胞死亡(Benhar et al., 2008)。在植物中, 已证明定
位于细胞质中的TRX-h5和TRX-h3负责NPR1的去亚
硝基化(Tada et al., 2008) (图1)。TRX-h3基因在细
胞中组成型持续表达, 而TRX-h5基因则受病原菌诱
导表达, PR (pathogenesis-related)基因的完全诱导
表达需要TRX-h5和TRX-h3同时存在(Tada et al.,
2008)。
2 亚硝基化在植物细胞死亡中的作用
在动物中, 根据细胞类型、细胞氧化还原状态及其浓
度 , NO兼具促进和抑制细胞死亡的作用(Mannick,
2007; Wang et al., 2010)。一般而言, 由细胞内产生
基线水平的NO所造成的亚硝基化具抗细胞死亡的效
应。而由诱导产生的较高水平NO所造成的亚硝基化
则具促进细胞死亡的效应或作为负反馈调控机制降
低细胞死亡反应(Mannick, 2007)。
亚硝基化调控细胞死亡是一个非常复杂的动态
过程。在同一信号途径中, 根据NO的来源、所处的位
置、去亚硝基化蛋白及靶蛋白的亚细胞定位的不同,
一些蛋白被亚硝基化, 而另一些蛋白则被去亚硝基
化。此外, 亚硝基化某些蛋白促进细胞死亡, 而亚硝
基化另一些蛋白则可能抑制细胞死亡。例如, 在动物
中, N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic
acid receptor, NMDA)接收刺激信号后, 甘油醛-3-磷
酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydro-
genase, GAPDH)亚硝基化的增加刺激细胞死亡, 而
NMDA受体亚硝基化的增加则降低了该受体的活性,
从而导致细胞的死亡程度降低(Lipton, 1993; Hara et
al., 2005)。多种起促进或抑制作用的亚硝基化靶标
的存在可能会使细胞更加精细地调控对死亡信号的
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图1 植物胞内蛋白亚硝基化水平的稳态平衡调控
植物体内亚硝基化水平由NO的产生及去亚硝基化的能力决定。植物体内NO可由众多途径产生, 包括NOA1途径、NR途径、质膜
NR/NiNOR途径、线粒体途径、多胺途径、过氧化酶体XOR途径和质外体途径。另外, 微生物产生的NO对植物也有一定的影响
(Crawford and Guo, 2005; Yu et al., 2014)。生物和非生物胁迫可诱导NO在植物体内的合成。在胁迫条件下, 细胞内NO浓度升高,
NO与GSH结合形成GSNO。GSNO是亚硝基化的NO供体, 亚硝基化的实现是由GSNO而并非由NO直接介导。GSNO可将NO反式
转移至靶蛋白从而改变蛋白的功能(Liu et al., 2001; Feechan et al., 2005)。GSNOR1和硫氧还蛋白(thioredoxins, TRX)是去亚硝基
化的2个关键酶。GSNOR1通过还原和降低植物体内的GSNO水平间接降低蛋白亚硝基化。而TRX-h3和TRX-h5可直接催化蛋白的
去亚硝基化(Tada et al., 2008)。

Figure 1 The homeostasis of cellular S-nitrosylation level in plants
The level of S-nitrosylation in plant cells is determined by balance between the production of NO and the capacity of
de-nitrosylation. There are multiple routes for NO production in plants such as NOA1-dependent pathway, NR pathway,
plasma-membrane NR/NiNOR pathway, mitochondrial pathway, polyamines pathway, peroxisome (XOR) pathway and apoplast
pathway. In addition, micro-organisms also contribute to the NO accumulation in plants (Crawford and Guo, 2005; Yu et al.,
2014). Both biotic and abiotic stresses can induce the production of NO. Under stress conditions, NO level is increased in plant
cells and as a results, the GSNO is formed in the presence of GSH; GSNO is a major donor of S-nitrosylation and S-nitrosylation
is mediated by GSNO rather than by NO directly; NO moiety is transferred from GSNO to proteins in trans and thus the protein
functions are altered by this modification (Liu et al., 2001; Feechan et al., 2005). GSNOR1 and thioredoxins (TRX) are two key
enzymes involved in de-nitrosylation. Whereas GSNOR1 achieves the protein de-nitrosylation indirectly through reducing cellular
level of GSNO, TRX (TRX-h3 and TRX-h5) catalyzes de-nitrosylation directly (Tada et al., 2008).


反应。
Delledonne等(1998)在《自然》杂志上发表的具
突破意义的研究表明, NO与过氧化氢(hydrogen per-
oxide, H2O2)互作诱导大豆(Glycine max)悬浮细胞发
生超敏性细胞死亡(hypersensitive cell death)。然而
时至今日, NO与H2O2互作诱导细胞超敏性细胞死亡
的分子机理仍然是个未解之谜。在细菌、小鼠及拟南
芥中失去GSNOR1功能的突变体, 其体内蛋白亚硝
基化水平显著提高(Liu et al., 2001; Feechan et al.,
2005)。小鼠gsnor1突变体在受到细菌侵染后, 其体
内组织的损伤及死亡率大大增加(Liu et al., 2004),
说明亚硝基化可能参与对细胞死亡的调控。近几年的
刘振等: 亚硝基化在植物细胞死亡及防御反应中的作用 133

研究表明, 植物中不同靶蛋白的亚硝基化可能是NO
诱导细胞死亡的机制之一。
2.1 NO通过亚硝基化抑制H2O2分解及还原相关
酶从而促进细胞死亡
NO通过降低活性氧(reactive oxygen species, ROS)
解毒相关酶的活性导致ROS增加, 从而造成细胞死
亡。植物细胞质抗坏血酸过氧化物酶 (cytosolic
ascorbate peroxidase, cAPX)通过还原H2O2控制细
胞内的ROS水平。热激和H2O2处理可诱导烟草(Nico-
tiana tabacum) BY-2细胞发生程序性死亡 (pro-
grammed cell death, PCD) (de Pinto et al., 2013)。
在细胞程序性死亡发生时, cAPX被亚硝基化, 其活
性受到抑制, 从而使细胞内H2O2含量增加并最终导
致细胞死亡(de Pinto et al., 2013)。进一步的研究表
明, 亚硝基化可导致cAPX泛素化, 促进其通过蛋白
酶体的降解(图2)。而NO清除剂cPTIO可以降低cAPX
的泛素化及其降解(de Pinto et al., 2013)。与此结果
相反 , Begara-Morales等 (2014)的质谱分析表明 ,
GSNO处理可使豌豆(Pisum sativum) APX在Cys32残
基上发生亚硝基化, 此亚硝基化可促进APX活性, 在
盐、氧化及硝化胁迫条件下, APX被亚硝基化的同时,
其活性也增加了。但此研究并未建立APX的亚硝基化
与细胞死亡之间的关系。
Ortega-Galisteo等(2012)从过氧化物酶体中鉴
定出6个被亚硝基化的靶蛋白, 其中包括能还原H2O2
的过氧化氢酶(catalase), 且该酶的活性受亚硝基化
的抑制。但此研究并未就过氧化氢酶的亚硝基化修饰
对细胞死亡的效应进行进一步探讨。Lin等(2012)通过
筛选发现了叶片有程序化细胞死亡并过量积累NO的
水稻 (Oryza sativa)突变体noe1 (nitric oxide ex-
cess1)。图位克隆法揭示NOE1编码1个过氧化氢酶。
NOE1突变造成叶片中H2O2含量升高, 而H2O2的升
高反过来通过激活硝酸还原酶促进一氧化氮的产生。
去除过量的NO可以降低noe1突变体中的细胞死亡,
表明NO是控制H2O2诱导的细胞死亡的重要内源调节
因子。在noe1突变体中过表达去亚硝基化的关键基因
GSNOR1可以减轻发生在noe1叶片中的细胞死亡,
表明该细胞死亡可能由亚硝基化控制。通过生物素置
换法结合LC-MS/MS, 目前已从noe1突变体中鉴定
出多个与细胞死亡相关的蛋白, 其中包括GAP-DH、
TRX及细胞质抗坏血酸过氧化物酶(Lin et al., 2012)。
其中GAPDH的相关性最为明显。一系列研究表明,
GAPDH在逆境胁迫和超敏反应(hypersensitive re-
sponse, HR)发生的条件下被亚硝基化 (Romero-
Puertas et al., 2008; Wawer et al., 2010; Zaffagnini
et al., 2013)。而动物细胞受到细胞凋亡因子刺激后,
由于NOS的激活导致GAPDH被亚硝基化, 亚硝基化
的GAPDH与具核定位信号肽的E3泛素连接酶Siah1
结合进入细胞核。在核中 , GAPDH能够起到稳定
Siah1的作用, 促进其降解有关蛋白从而促进细胞凋
亡(Hara et al., 2005)。
拟南芥peroxiredoxin II E (PrxII E)是一种过氧化
物氧化还原酶 , 它能够还原H2O2, 调节植物体内
H2O2的水平。PrxII E的亚硝基化会抑制其还原H2O2
的能力。生化与遗传学证据表明, PrxII E还具有解毒
过亚硝酸盐(ONOO–)的能力(Romero-Puertas et al.,
2007)。ONOO–是一种由NO和超氧集团形成的强氧
化、硝化簇分子, 可以通过不可逆地硝基化(nitration)
络氨酸残基而改变蛋白的功能。PrxII E的亚硝基化也
抑制了其ONOO–的解毒活性, 造成ONOO–水平显著
上升及蛋白硝基化水平的升高 (图2)。在动物中 ,
ONOO–可诱导细胞凋亡(Bonfoco et al., 1995), 但在
植物中则不能诱导细胞死亡(Romero- Puertas et al.,
2007)。Begara-Morales等(2014)的质谱分析表明 ,
ONOO–通过在Tyr5和Tyr235 两个氨基酸残基上硝基
化豌豆APX而抑制其活性, 但未进一步研究该修饰对
细胞死亡的效应。
2.2 NO通过亚硝基化抑制H2O2合成相关酶负调
控细胞死亡
烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)氧化酶(NADPH
oxidases)对植物细胞中ROS的产生起着关键作用。
NADPH氧化酶是一个存在于细胞质膜上的酶复合体,
由6个亚基组成(AtRBOHA–AtRBOHF)。NADPH氧化
酶通过从细胞内NADPH跨膜转移电子耦合分子氧产
生超氧离子, 超氧离子通过进一步反应产生H2O2或
ROS。最新研究表明, NO可通过亚硝基化NADPH氧
化酶复合体中的AtRBOHD亚基负反馈抑制其合成
H2O2的能力, 从而达到降低细胞中H2O2的含量及抑
制细胞过度死亡的目的(Yun et al., 2011)。遗传学证
据表明, 与野生型拟南芥Col-0相比, 过量产生NO的
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图2 亚硝基化调控植物细胞死亡
(A) NO通过亚硝基化抑制H2O2分解及还原相关酶造成细胞内过量积累H2O2, 从而促进细胞死亡。cAPX是亚硝基化的靶蛋白, 被亚
硝基化后其活性受到抑制。另一方面亚硝基化可导致cAPX的泛素化, 加速其通过蛋白酶体的降解, 从而使细胞内H2O2含量增加, 最
终导致细胞死亡(de Pinto et al., 2013)。(B) NO通过亚硝基化质膜上NADPH氧化酶复合体中AtRBOHD亚基的Cys890负反馈抑制其
合成H2O2的能力, 从而降低细胞中H2O2的含量及抑制细胞过度死亡(Yun et al., 2011)。(C) NO通过亚硝基化过氧化物氧还酶PrxII E
中的Cys121抑制其还原H2O2及过亚硝酸盐(ONOO–)解毒能力。过亚硝酸盐通过不可逆地硝基化(nitration)络氨酸残基而改变蛋白的
功能, PrxII E具保护蛋白不被硝基化的功能(Romero-Puertas et al., 2007)。(D) GSNOR1蛋白作为正调控因子参与除草剂百草枯诱
导的细胞死亡。除草剂百草枯处理可导致野生型拟南芥死亡, 但不能导致体内积累过量RNS的GSNOR1功能缺失突变体par2-1死
亡。ROS具增加细胞内GSNOR1蛋白含量的效应, 而RNS则具降低GSNOR1蛋白含量的效应。GSNOR1作用于ROS的下游参与除
草剂百草枯诱导的细胞死亡(Chen et al., 2009)。

Figure 2 Regulation of cell death by S-nitrosylation in plants
(A) NO promotes cell death through increasing the accumulation of H2O2 excessively by inhibiting H2O2 detoxifying enzymes.
cAPX is a target of S-nitrosylation and its enzyme activity is severely inhibited by S-nitrosylation. In addition, S-nitrosylation of
cAPX results in its ubiquitination and degradation by proteasome and thus leads to the cell death by over-accumulation of H2O2
(de Pinto et al., 2013). (B) NO can feedback inhibit H2O2 production through S-nitrosylation of Cys890 of AtRBOHD, a subunit of
NADPH oxidase on the plasmamembrane, and as a result, excessive accumulation of H2O2 is relieved and cell death is alleviated
(Yun et al., 2011). (C) NO inhibits H2O2 reduction and ONOO– detoxification of PrxII E through S-nitrosylation at Cys121. ONOO-
can irreversibly alter protein functions through nitration. PrxII E is an enzyme that can prevent proteins from nitration (Ro-
mero-Puertas et al., 2007). (D) GSNOR1 functions as a positive regulator that participates in the cell death induced by paraquat.
Application of herbicide paraquat can kill the wild type Arabidopsis Col-0 but not par2-1, a missense mutant of GSNOR1. ROS
has an effect in increasing the level of GSNOR1, whereas RSN has the opposite effect. GSNOR1 participates paraquat-induced
cell death downstream of ROS (Chen et al., 2009).

刘振等: 亚硝基化在植物细胞死亡及防御反应中的作用 135

突变体nox1 (He et al., 2004)和GSNOR1的功能缺失
突变体 gsnor1-3在发生RPM1-AvrB或RPS4-Avr-
RPS4诱导的ETI (effector-triggered immunity)时, 其
体内积累较高水平的亚硝基化巯基(S-nitrosothiol,
SNO), 但抗病反应诱导产生的总水杨酸(salicylic acid,
SA)和自由SA水平却显著降低(Yun et al., 2011)。在发
生 RPM1-AvrB 或 RPS4-AvrRPS4诱 导 的 ETI时 ,
gsnor1-3突变体以及gsnor1-3/sid2双突变体的叶片
上出现较野生型更快且更强的HR, 这与GSNOR1反
义转基因株系中的结果一致 (Rustérucci et al.,
2007)。相反, HR在过表达GSNOR1的突变体atgs-
nor1-1植株中的发生则较野生型相对延迟与降低
(Yun et al., 2011)。这一结果与Rustérucci等(2007)
报道的结果相反, 他们发现, 无毒病原菌诱导的HR
在拟南芥GSNOR1过表达转基因株系中也较野生型
增强, 但没有在GSNOR1反义株系中的增强效果显
著(Rustérucci et al., 2007)。由于SID2/ICS1负责合
成90%的由病原菌诱导合成的SA (Wildermuth et al.,
2001), 说明在不产生SA的情况下, SNO可以促进病
原菌侵染引起的超敏反应。但在SNO过高的情况下,
NO可通过负反馈环限制超敏反应的进一步加剧。该
负反馈调节是通过亚硝基化NADPH氧化酶复合体中
的AtRBOHD亚基实现的。AtRBOHD蛋白的Cys890是
亚硝基化的靶位点 , 该位点的亚硝基化导致
AtRBOHD合成ROS的能力丧失。相应地, 突变此亚
硝基化的靶位点可减弱SNO对AtRBOHD活性的抑
制, 从而增强ROS在细胞内的积累以及细胞死亡发
生的强度(图2)。该Cys890在人和果蝇的NADPH氧化
酶中高度保守并可被亚硝基化, 说明此机制可能也参
与调控动物的免疫反应, 但这些研究均未揭示NO诱
导植物细胞死亡的分子机理。以上发现与动物中的研
究结果相似。高浓度的SNO在不同组织器官中诱导细
胞死亡(Liu et al., 2004), 但高浓度的SNO也可以通
过亚硝基化促细胞死亡因子(Matthews et al., 1996)
和caspase等以抑制细胞死亡(Mannick et al., 1999)。
2.3 亚硝基化Metacaspase 9 (AtMC9)可能具有
抑制细胞死亡的功能
拟南芥Metacaspase 9 (AtMC9)的前体是亚硝基化的
靶蛋白。AtMC9的亚硝基化抑制其自我加工(从原酶
加工成成熟的蛋白酶)及其蛋白水解酶活性。但由于
加工成熟的AtMC9失去了对亚硝基化敏感的半胱氨
酸 , 其活性不再受亚硝基化调控 (Belenghi et al.,
2007)。此前AtMC9在细胞死亡中的功能未得到证实,
且此项研究也并未建立亚硝基化与细胞死亡之间的
关系。Kim等(2013)结合过表达转基因株系的创制和
基因沉默揭示辣椒(Capsaicam annuum) CaMC9在
病原菌诱导的细胞死亡过程中起着正调控作用。但亚
硝基化是否可抑制其促细胞死亡的功能还有待进一
步研究。Belenghi等 (2007)的研究表明 , 拟南芥
AtMC9的亚硝基化可抑制其自我加工及其蛋白酶活
性。由于被亚硝基化的位点在所有Metacapasez中高
度保守, 因此可以推断MC9的亚硝基化很可能抑制
由病原菌诱导的细胞死亡。
2.4 NO在抑制细胞死亡过程中的作用
以上的报道均表明, 在植物中NO介导的亚硝基化具
促细胞死亡的作用。Chen等(2009)的研究表明, NO
在拟南芥中同时也具抗细胞死亡的作用。拟南芥
GSNOR1突变体paraquat resistant2-1 (par2-1)具抗
除草剂百草枯(Paraquat)诱导的细胞死亡特性(Chen
et al., 2009) (图2)。此项研究表明, GSNOR1蛋白作
为正调控因子参与除草剂百草枯诱导的细胞死亡。
ROS具增加细胞内GSNOR1蛋白水平的效应, RNS
(reactive nitrogen species)则具降低GSNOR1蛋白
水平的效应。GSNOR1作用于ROS的下游, 参与除草
剂百草枯诱导的细胞死亡(图2)。虽然此项研究并未揭
示GSNOR1突变引起的抗百草枯诱导的细胞死亡是
否由亚硝基化造成, 也未鉴定出在抑制细胞死亡过程
中起关键作用的亚硝基化的靶蛋白, 但该研究表明,
与动物中的情况相似, 根据在细胞中所处的位置(区
室分割(compartmentalization))及浓度不同, NO兼具
促细胞死亡和抗细胞死亡的作用(Chen et al., 2009)。
3 亚硝基化在植物抗病反应中的作用
早在2000年, Klessig等(2000)证明NO可参与PR-1
(pathogenesis-related-1)基因的诱导表达以及SIPK/
MPK6 (SA-inducible protein kinase/mitogen-activa-
ted protein kinases 6)的激活。PR-1基因表达的诱导依
赖于cGMP (Klessig et al., 2000)。脂多糖(lipopolysa-
ccharides, LPS)是革兰氏隐性细菌细胞表面的成分,
136 植物学报 51(1) 2016

是微生物病原菌相关分子程式(microbe/pathogen-
associated molecular patterns, MAMP或PAMP)。在
拟南芥中, LPS可快速诱导依赖于NOA1 (nitric oxide
associated 1)的NO大量产生(NO迸发)并伴随抗病相
关基因的表达。noa1突变体对细菌病害表现超敏感,
说明NO参与植物的防御反应(Zeidler et al., 2004)。
近几年的研究表明, NO通过亚硝基化修饰抗病相关
的因子参与抗病反应。
3.1 亚硝基化通过修饰SA结合蛋白影响抗病反应
SA结合蛋白3 (SABP3)是一个叶绿体蛋白, 最早从
烟草中被分离鉴定出来, 定位于叶绿体基质中, 以高
亲和力结合SA。除了可以结合SA, 它还具有碳酸酐
酶活性(carbonic anhydrase (CA) activity)及抗氧化
活性。在烟草叶片中沉默CA可以抑制Pto-AvrPto介导
的HR反应及抗性反应(Slaymaker et al., 2002)。NO
可以在Cys280残基上亚硝基化水杨酸结合蛋白3
(salicylic acid-binding protein 3, AtSABP3)。At-
SABP3的亚硝基化可以抑制其与SA的结合及其CA
活性。而CA活性是植物表达抗性所必需的。因此, 亚
硝基化抑制AtSABP3碳酸酐酶的活性, 在负向反馈
调控植物抗病反应中起着重要作用 (Wang et al.,
2009)。
3.2 GSNOR1在抗病反应中的作用
拟南芥中失去GSNOR1功能可导致细胞中SNO及蛋
白亚硝基化水平升高(Feechan et al., 2005)。病原菌
侵染研究结果表明, gsnor1-3突变体中抗病基因(R
gene)或效应子介导的对Pseudonomas syringae
DC3000 (avrRps4或avrB)的抗性(effector-triggered
immunity, ETI)、对P. syringae DC3000及Hyaloper-
onospora parasitica isolate Noco2小种的基础抗性
(basal resistance或PAMP-triggered immunity, PTI)
以及对小麦白粉病菌(wheat powdery mildew path-
ogen) (Blumeria graminis f. sp. Tritici, Bgt)的非寄主
抗性(non-host resistance)均显著下降; 而过表达At-
GSNOR1的株系对P. syringae DC3000及H. para-
sitica isolate Noco2小种的基础抗性增强(Feechan
et al., 2005)。有趣的是, 拟南芥GSNOR1反义转基因
株系对H. parasitica isolate Noco2的基础抗性增强,
但对P. syringae DC3000的基础抗性无显著效应
(Rustérucci et al., 2007)。系统获得抗性(systemic
acquired resistance, SAR)是由无毒病原菌(能被寄
主的抗病基因识别而引起HR反应的病菌)侵染诱导的
抗性反应, SAR能显著提高对各种不同病原菌再次侵
染的抗性(Ryals et al., 1996)。先用携带无毒基因
avrRPM1的P. syringae ES4326细菌菌株侵染拟南
芥诱导SAR, 48小时后在上部系统叶片接种H. para-
sitica isolate Noco2以检测SAR。结果表明GSNOR1
反义转基因株系的SAR增强, 而过表达AtGSNOR1
的转基因株系SAR则降低(Rustérucci et al., 2007)。
拟南芥抗病基因RPP4编码的蛋白可识别霜霉病菌
(H. arabidopsidis) Emwa1菌株并激活对其的抗性。
该抗病反应依赖于SA, RPP4介导的抗性在SA合成突
变体sid2中丧失。尽管atgsnor1-3/sid2双突变体与
sid2突变体一样缺乏SA的合成, 但该双突变体株系
对Emwa1菌株的抗性较sid2突变体株系显著增强。与
在野生型中的表型一致, Emwa1菌株在atgsnor1-3/
sid2双突变体中不能完成其生活周期, 说明由于SNO
水平增加导致的细胞死亡在缺乏SA及其相关防御反
应的情况下足以抵抗Emwa1小种的侵染(Yun et al.,
2011)。
gsnor1-3对P. syringae DC3000及H. parasitica
isolate Noco2的基础抗性降低 (Feechan et al.,
2005), 而GSNOR1反义转基因株系则对H. para-
sitica isolate Noco2的基础抗性增强(Rustérucci et
al., 2007)。过表达GSNOR1转基因株系的结果在两
项研究间正好相反; 二者所用的细菌不同, 但霜霉菌
则完全一致, 为何得到相反的结果？究其原因, 我们
认为除了两个研究用于侵染实验的拟南芥植株生长
时期不同可能导致截然不同的结果外 , 不能排除
GSNOR1活性降低程度(knock out vs knock down)
不同对拟南芥抗病性具不同效应的可能性。同一研究
小组(Loake小组)的结果表明: TIR-NBS-LRR类抗病
基因RPS4及CC-NBS- LRR类抗病基因RPM1介导的
对携带相应无毒基因细菌小种的抗性在gsnor1-3中
均丧失(Feechan et al., 2005); 而RPP4介导的对H.
arabidopsidis isolate Emwa1的抗性则在atgsnor1-3
中并未完全丧失, 且在atgsnor1-3/sid2双突变体中的
抗性较在sid2中显著增强。另外, gsnor1-3对霜霉菌
中R基因介导的抗性和基础抗性的反应也不同。与野
生型相比, gsnor1-3对H. parasitica isolate Noco2的
刘振等: 亚硝基化在植物细胞死亡及防御反应中的作用 137

基础抗性降低(Feechan et al., 2005), 但对RPP4介
导的H. arabidopsidis isolate Emwa1抗性则无明显
改变。以上差异说明, SNO对抗病性的影响非常复杂,
因植株体内SNO水平高低、侵染病原菌的类型、病原
菌是否携带效应子或无毒基因以及所用植株的年龄、
生长状况及生长的环境条件等不同造成对抗病结果
效应的不同。要彻底了解GSNOR1在抗性反应中的作
用, 统一以上研究差异的原因, 需要回答以下2个问
题。
(1) GSNOR1水平对拟南芥体内SA含量的影响。
SA及SAG的合成以及PR1基因对病原菌侵染的诱导
表达在gsnor-3中显著下降(Feechan et al., 2005)。
gsnor1-3中HR的加剧及抗病性增强不依赖于SA
(Yun et al, 2011)。而PR1基因在GSNOR1反义转基
因株系中则持续表达, SAR在GSNOR1反义转基因株
系中也显著增强(Rustérucci et al., 2007)。GSN-
OR1反义转基因株系中HR加剧及抗性增强 (包括
SAR)是否依赖于SA则未做调查。鉴于SAR依赖于
SA, 由此推断, SA的水平在GSNOR1反义转基因株
系中有可能是上升的。如果SA的水平在GSNOR1反
义转基因株系中是上升的, 那为什么在gsnor1-3中是
下降的？可能的解释是GSNOR1水平降低程度的不
同对拟南芥体内SA积累具不同的效应。要彻底回答
这个问题就需对GSNOR1反义转基因株系进行SA含
量测定。
(2) gsnor1-3突变体对不同病原菌抗性差异的原
因。与野生型相比, 为什么gsnor1-3对R基因介导的
细菌抗性和R基因介导的霜霉菌抗性有显著差异？为
什么gsnor1-3中对霜霉菌的基础抗性丧失但对R基因
介导的霜霉菌抗性无显著影响？如果SNO对霜霉菌
具不依赖于SA的抑制效应, 为什么gsnor1-3对霜霉
菌的基础抗性或PTI丧失？
3.3 NPR1与TGA1的亚硝基化与抗病性的关系
NPR1是SA介导的系统抗性中调控抗病相关基因表
达的关键因子(Yan and Dong, 2014)。NPR1可以感
知植物体内氧化还原状态的变化(Mou et al., 2003)。
在未遭受病原菌侵染的植物中, NPR1以通过对氧化
还原敏感的二硫键形成寡聚体的形式存在于细胞质
中(Mou et al., 2003)。一旦遭受病原菌的侵染, 植物
细胞内抗病信号分子SA水平升高, 氧化还原状态发
生变化, 导致NPR1寡聚体分子间的二硫键还原, 从
而释放出NPR1单体。释放出的NPR1单体从细胞质
转运至细胞核并调控抗病相关基因的表达(Mou et
al., 2003)。NPR1蛋白中的Cys82和Cys216残基对形成
寡聚体非常关键, 它们的突变可导致NPR1单体水平
增加、NPR1持续性定位于核中以及在没有病原菌侵
染的情况下抗病相关基因的持续性激活(Mou et al.,
2003)。董欣年研究组近期的研究结果表明, NPR1是
亚硝基化的靶蛋白, 亚硝基化靶位点定位在Cys156
上。Cys156的亚硝基化有利于NPR1形成寡聚体。通
过创制在npr1突变体背景中过表达35S::NPR1-GFP
和 35S::NPR1C156A-GFP证明 CysC156A突变可导致
NPR1单体水平的增加以及NPR1蛋白持续定位于核
中(Tada et al., 2008)。SA诱导的NPR1由寡聚体向单
体转化是由细胞质硫氧还蛋白TRX-h5和TRX-h3催
化完成的。TRX-h3的表达是组成型的, 而TRX-h5则
是受病原菌诱导表达。TRX-h5及TRX-h3催化NPR1
从寡聚体向单体的释放, 同时可阻止单体转化成多聚
体(Tada et al., 2008)。SA诱导产生的NO可同时使
NPR1亚硝基化, 从而有利于NPR1的寡聚化以防止
NPR1的耗尽。NPR1介导的抗病性在TRX-h5的突变
体中降低(Tada et al., 2008)。在哺乳动物中, NO可以
间接调控NF-κB的转录活性。在正常条件下, 通过与
IκB (inhibitory κB)结合, NF-κB被保留在细胞质中。当
NF-κB途径被激活时, IκB被IKK (IκB kinase)磷酸化
并被泛素蛋白酶体系统降解。IκB被降解后, 自由态的
NF-κB便从细胞质转运至细胞核, 从而激活下游基因
的转录。NO通过亚硝基化IKK抑制其磷酸化活性, 从
而阻止 IκB降解实现其调控 NF-κB途径的效应
(Marshall et al., 2004; Reynaert et al., 2004), 这与
NPR1被亚硝基化后形成寡聚体从而阻止其进入细胞
核相似, 说明通过氧化还原调节的转录调控机制是动
物和植物免疫反应的共同特征(Tada et al., 2008)。
TGA1转录因子也是植物系统获得防御反应过程
中的关键调控因子。NPR1以单体形式与还原态TGA1
结合, 从而促进TGA1与防御相关基因启动子区域的
激活序列(activation sequence-1, as-1)结合(Linder-
mayr et al., 2010)。TGA1也是亚硝基化的靶蛋白, 其
Cys260和Cys266既可被亚硝基化, 也可被谷胱甘肽化
(S-glutathionylation) (Lindermayr et al., 2010)。在
NPR1存在的条件下, GSNO处理可以保护TGA1免受
138 植物学报 51(1) 2016

氧化介导的修饰以增强其结合as-1的活性。与Tada
等(2008)报道的结果相反, Lindermayr等(2010)发现
NO可以促进NPR1从细胞质进入细胞核。根据Tada
等(2008)的报道, 亚硝基化的NPR1以寡聚体的形式
存在于细胞质中 , 在SA存在的条件下 , SA诱导的
TRX-h5及组成型表达的TRX-h3将NPR1去亚硝基
化, 使其从多聚体还原成单体。NPR1以单体的形式
进入细胞核, 促进TGA1与抗病相关基因的启动子结
合, 从而启动抗病相关基因的表达。而Lindermayr等
(2010)的研究结果表明, GSNO可诱导NPR1从细胞
质进入细胞核, 而且GSNO可增强NPR1促进TGA1
结合as-1的能力。Lindermayr等(2010)的解释是, 亚
硝基化介导的NPR1多聚体化可以看作是其单体积累
前的一个步骤, NPR1只是以单体形式转运至核中。由
于GSNO可增强NPR1促进TGA1结合as-1的能力 ,
很可能NPR1在进入核中后被重新亚硝基化, 即亚硝
基化的NPR1可使亚硝基化的TGA1具更强的结合
as-1的能力, 从而使激活抗病相关基因的能力增强。
Lindermayr等(2010)的另一个解释是, NO可诱导SA
的合成, GSNO诱导NPR1的核转移其实是通过SA实
现的。但这种解释忽略了二者研究所用的材料和方法
不同所导致的差别。Tada等(2008)是通过以下现象得
出结论SA能诱导野生型背景中转基因表达的: 35S::
NPR1-GFP从细胞质进入细胞核, 而不能诱导gsn-
or1-3突变体背景中35S::NPR1C156A-GFP从细胞质进
入细胞核。而Lindermayr等(2010)则是通过用GSNO
处理过表达NPR1-GFP的野生型拟南芥原生质体得
出结论。笔者认为, 外源GSNO处理原生质体的效应
是瞬时的, 对被处理细胞的不同亚细胞部位的影响
(亚硝基化或氧化还原状态)是相对均一的。而gsnor1-
3突变体中GSNOR1表达的缺失对细胞内亚硝基化或
氧化还原状态的影响则是持久的, 对细胞内不同亚细
胞部位的影响是非均一的, 即其影响与GSNOR1的
亚细胞定位相关。因此, 外源施用NO并不能完全模拟
植物细胞所经历的真实生理状态。而用突变体研究则
更贴近真实生理状况。鉴于以上两个研究得到截然相
反结论, NPR1在进入核以后究竟是以单体还是寡聚
体形式结合和促进TGA1启动PR基因的表达, 还有待
进一步探讨, 同时造成以上差异的原因也有待进一步
查清。TGA1是在细胞质中被亚硝基化后进入细胞核
还是在细胞核中被亚硝基化仍不清楚。另外, TGA1
中的Cys260和Cys266既可被低浓度范围的GSNO亚硝
基化 , 也可被此浓度范围的GSNO谷胱甘肽化
(Lindermayr et al., 2010)。GSNO是通过亚硝基化还
是通过谷胱甘肽化或是二者皆需才可以促进TGA1结
合as-1元件也有待进一步精细区分。此外, NPR1是否
也受谷胱甘肽化的调控也值得研究。
3.4 泛素化相关蛋白的亚硝基化与烟草花叶病毒
运动的关系
在动物中, 已知亚硝基化通过调控泛素化-蛋白酶体
途径以及磷酸化途径调控细胞凋亡及其它生物学过
程(Reynaert et al., 2004; Hara et al., 2005; Sen et
al., 2008; Nakamura et al., 2010; Feng et al.,
2013)。近期在植物中的研究表明, 泛素介导的蛋白
水解参与植物的防御反应(Trujillo and Shirasu, 2010)
以及H2O2诱导的细胞死亡(Vannini et al., 2012)。
CDC48 (Cell Division Cycle Protein 48)或称p97或
VCP (Vasolin-Containing Protein)是AAA+ ATPase
酶家族成员之一。CDC48含有2个ATPase结构域(D1
和D2), D1和D2结构域由参与结合与水解ATP的2个
Walker区组成。该酶与分子伴侣酶类似, 利用ATP水
解产生的能量改变泛素化蛋白的构象, 使之伸展从而
有利于蛋白酶体的降解功能(Elsasser and Finley,
2005; Baek et al., 2013)。CDC48是依赖于泛素蛋白
降解途径中的核心成员。在动物中, 其参与一系列细
胞过程, 包括细胞周期、转录调控、ER相关的降解途
径(endoplasmic reticulum (ER)-associated degra-
dation pathway, ERAD)、免疫反应、胞内运输、细
胞凋亡以及自噬等(Meyer et al., 2012)。近期的研究
暗示拟南芥 CDC48可与 TMV病毒的运动蛋白
(movement protein, MP)互作, 使MP从ER的包涵体
(inclusion body)中释放到细胞质中促进其降解(Niehl
et al., 2012)。过表达AtCDC48会破坏病毒的运动, 说
明CDC48通过将MP从ER转运途径中转移出及干扰
其与微管的动态控制病毒运动。CDC48的ATP酶活性
是降解MP所必需的, CDC48在隐地蛋白-1 (crypto-
gein-1)诱导的烟草细胞中发现被亚硝基化(Astier et
al., 2012)。其亚硝基化位点被定位在参与ATP结合并
诱导局部构型变化的D2结构域的Walker A区中的
Cys526。CDC48 Cys526的亚硝基化抑制该酶的ATP酶
活性, 暗示了NO可通过亚硝基化CDC48抑制其ATP
刘振等: 亚硝基化在植物细胞死亡及防御反应中的作用 139

酶活性从而抑制病毒运动的可能性。
4 结束语
近期对亚硝基化研究获得的认识将NO调控植物细胞
死亡及抗病反应的机制探讨提高到了一个新的层次。
鉴于气体分子NO自由基难以研究的特性及亚硝基化
鉴定灵敏度的限制, 在植物中仅有少数蛋白被鉴定为
亚硝基化的靶蛋白且其功能受亚硝基化调控。要揭示
NO调控植物抗性的完整画面并建立NO在抗病反应
中的完整调控系统, 需了解不同的RNS在抗病反应
发生时精细的动态时空分布、变化状况以及鉴定出更
多的受亚硝基化调控并参与抗病反应的蛋白。以往大
多数研究鉴定的靶蛋白并不是在内源NO生理学浓度
条件下鉴定出的, 而是通过过量施用外源NO供体的
情况下得到的。过量施用外源NO供体, 忽略了NO信
号的时空性、流动性和可逆性等特性, 不能真实地反
映活体植株中这些蛋白是否可被生理浓度NO所修饰,
有时可能得到没有生理学意义的结论。因此鉴定出植
株正常活体生理状态下亚硝基化的靶蛋白和靶位点
更具意义。低灵敏度的亚硝基化鉴定方法是制约以上
两个方面进展的关键性限制因素。生物素置换法结合
液相色谱-串联质谱以及同位素代码亲和标签技术等
新型亚硝基化鉴定技术的建立和应用将更能精准地
鉴定出参与此过程的因子并准确地反映NO在植物免
疫或抗性中的作用(汪达丽等, 2014)。NO不但能亚硝
基化蛋白, 也可以谷胱甘肽化同一蛋白的半胱氨酸残
基, 因此, 阐明亚硝基化和谷胱甘肽化对同一蛋白修
饰的动力学特征、动态平衡以及如何协同调控某一生
物学过程也是近来研究的方向之一。NO的非特异性
决定了其可与其它不同激素互作参与调控植物的不
同生物学过程, 现已知NO可以与水杨酸、乙烯、生长
素及细胞分裂素互作调控植物的抗性与生长发育。随
着研究的深入, NO与其它激素的互作机制也将被揭
示, 因此建立NO与不同激素互作的调控网络也是未
来研究的热点。在动物中, 已知亚硝基化通过调控泛
素化-蛋白酶体途径以及磷酸化途径调控细胞凋亡及
其它生物学过程。近期在植物中发现, CDC48为亚硝
基化的靶蛋白且其活性受亚硝基化调控, 但还未见激
酶或磷酸酶受亚硝基化调控的报道。鉴定出参与抗病
反应且受亚硝基化调控的磷酸化/去磷酸化过程也将
是未来研究的方向之一。NO的研究成果在新药的开
发和应用上已非常成功, 但在植物中仍未有应用, 将
NO的研究成果用于创制抗病的农作物品种将是该领
域研究的终极目标。
参考文献
汪达丽, 张双双, 刘建中 (2014). 蛋白质亚硝基化检测和鉴
定方法的研究进展. 植物生理学报 50, 1079–1088.
王鹏程, 杜艳艳, 宋纯鹏 (2009). 植物细胞一氧化氮信号转
导研究进展. 植物学报 44, 517−525.
姚涛, 白素兰, 李苗苗, 张耀川, 何奕昆 (2011). DELLA蛋白
参与拟南芥幼苗对一氧化氮逆境的抵抗 . 植物学报 46,
481−488.
Astier J, Besson-Bard A, Lamotte O, Bertoldo J, Bo-
urque S, Terenzi H, Wendehenne D (2012). Nitric oxide
inhibits the ATPase activity of the chaperone-like AAA+
ATPase CDC48, a target for S-nitrosylation in cryptogein
signaling in tobacco cells. Biochem J 447, 249–260.
Baek GH, Cheng H, Choe V, Bao X, Shao J, Luo S, Rao H
(2013). Cdc48: a swiss army knife of cell biology. J Amino
Acids 2013, 183421.
Begara-Morales JC, Sánchez-Calvo B, Chaki M, Valde-
rrama R, Mata-Pérez C, López-Jaramillo J, Padilla MN,
Carreras A, Corpas FJ, Barroso JB (2014). Dual regu-
lation of cytosolic ascorbate peroxidase (APX) by tyrosine
nitration and S-nitrosylation. J Exp Bot 65, 527–538.
Belenghi B, Romero-Puertas MC, Vercammen D, Brack-
enier A, Inzé D, Delledonne M, Van Breusegem F
(2007). Metacaspase activity of Arabidopsis thaliana is
regulated by S-nitrosylation of a critical cysteine residue. J
Biol Chem 282, 1352–1358.
Benhar M, Forrester MT, Hess DT, Stamler JS (2008).
Regulated protein denitrosylation by cytosolic and mito-
chondrial thioredoxins. Science 320, 1050–1054.
Bonfoco E, Krainc D, Ankarcrona M, Nicotera P, Lipton
SA (1995). Apoptosis and necrosis: two distinct events
induced, respectively, by mild and intense insults with
N-methyl-D-aspartate or nitric oxide/superoxide in cortical
cell cultures. Proc Natl Acad Sci USA 92, 7162–7166.
Chen R, Sun S, Wang C, Li Y, Liang Y, An F, Li C, Dong
H, Yang X, Zhang J, Zuo J (2009). The Arabidopsis
PARAQUAT RESISTANT2 gene encodes an S-nitro-
soglutathione reductase that is a key regulator of cell
death. Cell Res 19, 1377–1387.
Crawford NM, Guo FQ (2005). New insights into nitric oxide
140 植物学报 51(1) 2016

metabolism and regulatory functions. Trends Plant Sci 10,
195–200.
de Pinto MC, Locato V, Sgobba A, Romero-Puertas Mdel
C, Gadaleta C, Delledonne M, De Gara L (2013). S-
nitrosylation of ascorbate peroxidase is part of pro-
grammed cell death signaling in tobacco Bright Yellow-2
cells. Plant Physiol 163, 1766–1775.
Delledonne M, Xia Y, Dixon RA, Lamb C (1998). Nitric
oxide functions as a signal in plant disease resistance.
Nature 394, 585–588.
Durner J, Wendehenne D, Klessig DF (1998). Defense
gene induction in tobacco by nitric oxide, cyclic GMP, and
cyclic ADP-ribose. Proc Natl Acad Sci USA 95, 10328–
10333.
Elsasser S, Finley D (2005). Delivery of ubiquitinated sub-
strates to protein-unfolding machines. Nat Cell Biol 7,
742–749.
Feechan A, Kwon E, Yun BW, Wang Y, Pallas JA, Loake
GJ (2005). A central role for S-nitrosothiols in plant dis-
ease resistance. Proc Natl Acad Sci USA 102, 8054–
8059.
Feng X, Sun T, Bei Y, Ding S, Zheng W, Lu Y, Shen P
(2013). S-nitrosylation of ERK inhibits ERK phosphoryla-
tion and induces apoptosis. Sci Rep 3, 1814.
Groß F, Durner J, Gaupels F (2013). Nitric oxide, antioxi-
dants and prooxidants in plant defence responses. Front
Plant Sci 4, 419.
Gupta KJ (2011). Protein S-nitrosylation in plants: photo-
respiratory metabolism and NO signaling. Sci Signal 4,
jc1.
Hara MR, Agrawal N, Kim SF, Cascio MB, Fujimuro M,
Ozeki Y, Takahashi M, Cheah JH, Tankou SK, Hester
LD, Ferris CD, Hayward SD, Snyder SH, Sawa A
(2005). S-nitrosylated GAPDH initiates apoptotic cell de-
ath by nuclear translocation following Siah1 binding. Nat
Cell Biol 7, 665–674.
He Y, Tang RH, Hao Y, Stevens RD, Cook CW, Ahn SM,
Jing L, Yang Z, Chen L, Guo F, Fiorani F, Jackson RB,
Crawford NM, Pei ZM (2004). Nitric oxide represses the
Arabidopsis floral transition. Science 305, 1968–1971.
Hess DT, Stamler JS (2012). Regulation by S-nitrosylation
of protein post-translational modification. J Biol Chem
287, 4411–4418.
Kim SM, Bae C, Oh SK, Choi D (2013). A pepper (Capsi-
cum annuum L) metacaspase 9 (Camc9) plays a role in
pathogen-induced cell death in plants. Mol Plant Pathol
14, 557–566.
Klessig DF, Durner J, Noad R, Navarre DA, Wendehenne
D, Kumar D, Zhou JM, Shah J, Zhang S, Kachroo P,
Trifa Y, Pontier D, Lam E, Silva H (2000). Nitric oxide
and salicylic acid signaling in plant defense. Proc Natl
Acad Sci USA 97, 8849–8855.
Lamattina L, Garcia-Mata C, Graziano M, Pagnussat G
(2003). Nitric oxide: the versatility of an extensive signal
molecule. Annu Rev Plant Biol 54, 109–136.
Lee TY, Chen YJ, Lu CT, Ching WC, Teng YC, Huang HD,
Chen YJ (2012). dbSNO: a database of cysteine S-nitro-
sylation. Bioinformatics 28, 2293–2295.
Leitner M, Vandelle E, Gaupels F, Bellin D, Delledonne
M (2009). NO signals in the haze: nitric oxide signaling in
plant defence. Curr Opin Plant Biol 12, 451–458.
Li H, Wan A, Xu G, Ye D (2013). Small changes huge im-
pact: the role of thioredoxin 1 in the regulation of apopto-
sis by S-nitrosylation. Acta Biochim Biophys Sin 45, 153–
161.
Lin A, Wang Y, Tang J, Xue P, Li C, Liu L, Hu B, Yang F,
Loake GJ, Chu C (2012). Nitric oxide and protein S-
nitrosylation are integral to hydrogen peroxide-induced
leaf cell death in rice. Plant Physiol 158, 451–464.
Lindermayr C, Durner J (2009). S-nitrosylation in plants:
pattern and function. J Proteomics 73, 1–9.
Lindermayr C, Saalbach G, Bahnweg G, Durner J (2006).
Differential inhibition of Arabidopsis methionine adeno-
syltransferases by protein S-nitrosylation. J Biol Chem
281, 4285–4291.
Lindermayr C, Saalbach G, Durner J (2005). Proteomic
identification of S-nitrosylated proteins in Arabidopsis.
Plant Physiol 137, 921–930.
Lindermayr C, Sell S, Müller B, Leister D, Durner J
(2010). Redox regulation of the NPR1-TGA1 system of
Arabidopsis thaliana by nitric oxide. Plant Cell 22, 2894–
2907.
Lipton SA (1993). Prospects for clinically tolerated NMDA
antagonists: open-channel blockers and alternative
redox states of nitric oxide. Trends Neurosci 16, 527–
532.
Liu L, Hausladen A, Zeng M, Que L, Heitman J, Stamler
JS (2001). A metabolic enzyme for S-nitrosothiol con-
served from bacteria to humans. Nature 410, 490–494.
Liu L, Yan Y, Zeng M, Zhang J, Hanes MA, Ahearn G,
McMahon TJ, Dickfeld T, Marshall HE, Que LG,
Stamler JS (2004). Essential roles of S-nitrosothiols in
vascular homeostasis and endotoxic shock. Cell 116,
617–628.
刘振等: 亚硝基化在植物细胞死亡及防御反应中的作用 141

Mannick JB (2007). Regulation of apoptosis by protein
S-nitrosylation. Amino Acids 32, 523-526.
Mannick JB, Hausladen A, Liu L, Hess DT, Zeng M, Miao
QX, Kane LS, Gow AJ, Stamler JS (1999). Fas-induced
caspase denitrosylation. Science 284, 651–654.
Marshall HE, Hess DT, Stamler JS (2004). S-nitrosylation:
physiological regulation of NF-kappaB. Proc Natl Acad Sci
USA 101, 8841–8842.
Matthews JR, Botting CH, Panico M, Morris HR, Hay RT
(1996). Inhibition of NF-kb DNA binding by nitric oxide.
Nucleic Acids Res 24, 2236–2242.
Meyer H, Bug M, Bremer S (2012). Emerging functions of
the VCP/p97 AAA-ATPase in the ubiquitin system. Nat
Cell Biol 14, 117–123.
Michelet L, Zaffagnini M, Massot V, Keryer E, Vanacker
H, Miginiac-Maslow M, Issakidis-Bourguet E, Lemaire
SD (2006). Thioredoxins glutaredoxins and glutathionyla-
tion: new crosstalks to explore. Photosynth Res 89, 225–
245.
Mou Z, Fan W, Dong X (2003). Inducers of plant systemic
acquired resistance regulate NPR1 function through
redox changes. Cell 113, 935–944.
Nakamura T, Wang L, Wong CC, Scott FL, Eckelman BP,
Han X, Tzitzilonis C, Meng F, Gu Z, Holland EA,
Clemente AT, Okamoto S, Salvesen GS, Riek R, Yates
III JR, Lipton SA (2010). Transnitrosylation of XIAP
regulates caspase-dependent neuronal cell death. Mol
Cell 39, 184–195.
Neill SJ, Desikan R, Clarke A, Hancock JT (2002). Nitric
oxide is a novel component of abscisic acid signaling in
stomatal guard cells. Plant Physiol 128, 13–16.
Niehl A, Amari K, Gereige D, Brandner K, Mély Y, Hein-
lein M (2012). Control of tobacco mosaic virus movement
protein fate by CELL-DIVISION-CYCLE protein48. Plant
Physiol 160, 2093–2108.
Ortega-Galisteo AP, Rodríguez-Serrano M, Pazmiño DM,
Gupta DK, Sandalio LM, Romero-Puertas MC (2012).
S-nitrosylated proteins in pea (Pisum sativum L.) leaf per-
oxisomes: changes under abiotic stress. J Exp Bot 63,
2089–2103.
Reynaert NL, Ckless K, Korn SH, Vos N, Guala AS,
Wouters EF, van der Vliet A, Janssen-Heininger YM
(2004). Nitric oxide represses inhibitory kappaB kinase
through S-nitrosylation. Proc Natl Acad Sci USA 101,
8945–8950.
Romero-Puertas MC, Campostrini N, Mattè A, Righetti
PG, Perazzolli M, Zolla L, Roepstorff P, Delledonne M
(2008). Proteomic analysis of S-nitrosylated proteins in
Arabidopsis thaliana undergoing hypersensitive response.
Proteomics 8, 1459–1469.
Romero-Puertas MC, Laxa M, Matte A, Zaninotto F,
Finkemeier I, Jones AM, Perazzolli M, Vandelle E,
Dietz KJ, Delledonne M (2007). S-nitrosylation of per-
oxiredoxin II promotes peroxynitrite-mediated tyrosine ni-
tration. Plant Cell 19, 4120–4130.
Romero-Puertas MC, Rodríguez-Serrano M, Sandalio LM
(2013). Protein S-nitrosylation in plants under abiotic
stress: an overview. Front Plant Sci 4, 373.
Rustérucci C, Espunya MC, Díaz M, Chabannes M,
Martínez MC (2007). S-nitrosoglutathione reductase affo-
rds protection against pathogens in Arabidopsis, both lo-
cally and systemically. Plant Physiol 143, 1282–1292.
Ryals JA, Neuenschwander UH, Willits MG, Molina A,
Steiner HY, Hunt MD (1996). Systemic acquired resis-
tance. Plant Cell 8, 1809–1819.
Sell S, Lindermayr C, Durner J (2008). Identification of
S-nitrosylated proteins in plants. Methods Enzymol 440,
283–293.
Sen N, Hara MR, Kornberg MD, Cascio MB, Bae BI, Sha-
hani N, Thomas B, Dawson TM, Dawson VL, Snyder
SH, Sawa A (2008). Nitric oxide-induced nuclear GAPDH
activates p300/CBP and mediates apoptosis. Nat Cell Biol
10, 866–873.
Slaymaker DH, Navarre DA, Clark D, del Pozo O, Martin
GB, Klessig DF (2002). The tobacco salicylic acid-bind-
ing protein 3 (SABP3) is the chloroplast carbonic anhy-
drase, which exhibits antioxidant activity and plays a role
in the hypersensitive defense response. Proc Natl Acad
Sci USA 99, 11640–11645.
Stamler JS (1994). Redox signaling: nitrosylation and re-
lated target interactions of nitric oxide. Cell 78, 931–936.
Stamler JS, Toone EJ, Lipton SA, Sucher NJ (1997).
(S)NO signals: translocation, regulation, and a consensus
motif. Neuron 18, 691–696.
Tada Y, Spoel SH, Pajerowska-Mukhtar K, Mou Z, Song
J, Wang C, Zuo J, Dong X (2008). Plant immunity requi-
res conformational charges of NPR1 via S-nitrosylation
and thioredoxins. Science 321, 952–956.
Trapet P, Kulik A, Lamotte O, Jeandroz S, Bourque S,
Nicolas-Francès V, Rosnoblet C, Besson-Bard A,
Wendehenne D (2014). NO signaling in plant immunity: a
tale of messengers. Phytochemistry 112, 72–79.
Trujillo M, Shirasu K (2010). Ubiquitination in plant immu-
nity. Curr Opin Plant Biol 13, 402–408.
142 植物学报 51(1) 2016

Vannini C, Marsoni M, Cantara C, De Pinto MC, Locato V,
De Gara L, Bracale M (2012). The soluble proteome of
tobacco Bright Yellow-2 cells undergoing H2O2-induced
programmed cell death. J Exp Bot 63, 3137–3155.
Wang Y, Chen C, Loake GJ, Chu C (2010). Nitric oxide:
promoter or suppressor of programmed cell death. Protein
Cell 1, 133–142.
Wang YQ, Feechan A, Yun BW, Shafiei R, Hofmann A,
Taylor P, Xue P, Yang FQ, Xie ZS, Pallas JA, Chu CC,
Loake GJ (2009). S-nitrosylation of AtSABP3 antagoni-
zes the expression of plant immunity. J Biol Chem 284,
2131–2137.
Wawer I, Bucholc M, Astier J, Anielska-Mazur A, Dahan
J, Kulik A, Wysłouch-Cieszynska A, Zareba-Kozioł M,
Krzywinska E, Dadlez M, Dobrowolska G, Wendehe-
nne D (2010). Regulation of Nicotiana tabacum osmotic
stress-activated protein kinase and its celluar partner
GAPDH by nitric oxide in response to salinity. Biochem
J 429, 73–83.
Wendehenne D, Durner J, Klessig DF (2004). Nitric oxide:
a new player in plant signaling and defence responses.
Curr Opin Plant Biol 7, 449–455.
Wildermuth MC, Dewdney J, Wu G, Ausubel FM (2001).
Isochorismate synthase is required to synthesize salicylic
acid for plant defence. Nature 414, 562–565.
Yan S, Dong X (2014). Perception of the plant immune
signal salicylic acid. Curr Opin Plant Biol 20, 64–68.
Yu M, Lamattina L, Spoel SH, Loake GJ (2014). Nitric
oxide function in plant biology: a redox cue in deconvolu-
tion. New Phytol 202, 1142–1156.
Yu M, Yun BW, Spoel SH, Loake GJ (2012). A sleigh ride
through the SNO: regulation of plant immune function by
protein S-nitrosylation. Curr Opin Plant Biol 15, 424–430.
Yun BW, Feechan A, Yin M, Saidi NB, Le Bihan T, Yu M,
Moore JW, Kang JG, Kwon E, Spoel SH, Pallas JA,
Loake GJ (2011). S-nitrosylation of NADPH oxidase
regulates cell death in plant immunity. Nature 478, 264–
268.
Zaffagnini M, Fermani S, Costa A, Lemaire SD, Trost P
(2013). Plant cytoplasmic GAPDH: redox post-transla-
tional modifications and moonlighting properties. Front
Plant Sci 4, 450.
Zeidler D, Zähringer U, Gerber I, Dubery I, Hartung T,
Bors W, Hutzler P, Durner J (2004). Innate immunity in
Arabidopsis thaliana: lipopolysaccharides activate nitric
oxide synthase (NOS) and induce defense genes. Proc
Natl Acad Sci USA 101, 15811–15816.
Zhang X, Huang B, Zhang L, Zhang Y, Zhao Y, Guo X,
Qiao X, Chen C (2012). SNObase, a database for
S-nitrosation modification. Protein Cell 3, 929–933.

刘振等: 亚硝基化在植物细胞死亡及防御反应中的作用 143

The Roles of Protein S-nitrosylation in Plant Cell Death
and Disease Resistance
Zhen Liu, Xia Liu, Jianzhong Liu*
College of Chemistry and Life Sciences, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, China
Abstract S-nitrosylation, a newly identified cGMP-independent nitric oxide (NO) signaling pathway, is a post-
translational modification in which NO moiety is covalently attached to the cysteine thiol group of a target protein, thereby
leading to functional changes of modified proteins. Here, we review the recent progress in understanding the roles of
S-nitrosylation in plant cell death and disease resistance, two closely interconnected biological processes. We summarize
how NO promotes or inhibits cell death and disease resistance though S-nitrosylation of key proteins that participate in
certain biological processes. We also give our comments on the inconsistent results regarding the role of S-nitrosylation in
cell death and disease resistance from different groups. From the most recent progress made in animal systems, we
provide perspectives for plant biologists in this field.
Key words cell death, disease resistance, nitric oxide, S-nitrosogluta thionereductase (GSNOR1), S-nitrosylation
Liu Z, Liu X, Liu JZ (2016). The roles of protein S-nitrosylation in plant cell death and disease resistance. Chin Bull Bot
51, 130–143.
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* Author for correspondence. E-mail: jzliu@zjnu.cn
(责任编辑: 朱亚娜)