全 文 ：武汉植物学研究 2003, 21( 6): 471～ 474
Journal of Wuhan Botan ical Research
水稻程序性细胞死亡抑制基因 Dad-1在薏苡中的定位
韩永华 1, 2 , 金危危 1 , 王小兰 1 , 宋运淳 1
( 1.武汉大学植物发育生物学教育部重点实验室 , 武汉 430072; 2.广西师范大学生命科学学院 , 桂林 541004)
摘 要: 基因 Dad -1是普遍存在于动物和植物中一个高度保守的程序性细胞死亡抑制基因。以水稻 Dad -1基因为
探针 ,采用 Southern杂交在薏苡中检出了 Dad-1基因的同源序列 ,并利用荧光原位杂交的方法对其进行了染色体
物理定位。 在薏苡第 9染色体短臂上检测到 Dad -1基因的杂交信号 ,信号与着丝粒的百分距离为 67. 44± 1. 45。
关键词: 程序性细胞死亡 ; Dad-1; 薏苡 ; 荧光原位杂交
中图分类号: Q942 文献标识码: A 文章编号: 1000-470X ( 2003) 06-0471-04
Chromosomal Localization of Programmed Cell Death Suppressor
OsDad-1 Gene inCoix lacryma- jobi L.
HAN Yong-Hua
1, 2
, JIN Wei-Wei
1
, W ANG Xiao-Lan
1
, SON G Yun-Chun
1
( 1. The Key Laborator y of MOE for Plan t Developmental Biology , Wuhan University , Wuhan 430072, China;
2. College of Li fe Sciences, Guangx i Normal Un iversity, Guilin 541004, China)
Abstract: The gene Dad-1 is a well-conserv ed pro g rammed cell dea th ( PCD) suppresso r g ene in
animals and plants. In this study, the sing le copy rice gene Dad -1 w as used as probe to investigate
it s homology and phy sical localiza tion in Coix lacryma-jobi genome. The resul ts of Southern blot-
ting suggested that there w ere sequences homo logous to rice Dad -1 gene in C . lacryma-jobi
genome. Further, the sequences w ere mapped on the shor t arm o f chromosome 9 inC . lacryma-jobi
by fluo rescence in si tu hybridization ( FISH) . The percent distance f rom the signal si te to cen-
tromere was 67. 44± 1. 45 .
Key words: Prog rammed cell death; Dad -1; Coix lacryma-jobi; Fluo rescence in situ hybridization
近年来 ,随着植物遗传图谱的迅速构建 ,许多功
能基因被定位在特定的染色体上 ,如大麦抗灼热
( Scald resistance)基因的定位 [1 ] ,玉米抗秋季粘虫
( Fall armyw orm )基因的定位等 [ 2]。然而遗传图仅仅
反映了基因在染色体上的相对位置 ,尚未落实到染
色体的具体区域。 染色体原位杂交技术是众多基因
物理定位中最直接而简便的方法之一 ,它可将基因
或分子标记直接定位到染色体的具体位置上。 应用
染色体原位杂交技术开展基因物理定位的研究工作
方兴未艾 ,其中一个重要的前提便是需要克隆的基
因或 DNA片段作探针 ,而目前许多研究大量集中
于对一些模式生物基因或 DNA片段的克隆。 利用
这些生物已获得的探针 ,对相关的物种进行异源探
测和比较定位 ,为基因的物理定位研究提供了新思
路。 比较定位研究的分子基础就是在物种间 DNA
序列尤其是编码序列的保守性上。 对禾本科植物的
比较作图和比较基因组的研究表明 ,尽管禾本科植
物物种之间在亲缘关系远近 ,基因组大小、染色体数
目上各不相同 ,但比较作图的结果却显示出它们的
基因组存在高度的保守性 ,染色体共线性片段和基
因间的同源性广泛存在 [3 ]。这为在禾本科植物间开
展异源基因探测和基因比较定位提供了依据。
收稿日期: 2003-03-29,修回日期: 2003-09-02。
基金项目:国家自然科学基金资助 ( 30070376)。
作者简介:韩永华 ( 1971- ) ,女 ,博士生 ,从事植物分子细胞遗传学研究 ( E-mail: hanyhzh ou@ sohu. com)。
通讯作者 ( E-mai l: song yc@ whu. ed u. cn)。
薏苡属植物属于禾本科玉蜀黍族 ,是玉米的近
缘亲属。该属的染色体基数是 5,属内物种有从 2n=
10的二倍体到 2n= 40的八倍体多种形式 ,其中
2n= 20的四倍体是最常见的类型 [4, 5 ]。玉蜀黍族中仅
在薏苡属中有 2n= 10的二倍体种 ,所以 ,在玉蜀黍
族中薏苡属是最原始的 [6 ] ,有推测认为薏苡可能参
与了玉米的起源 [7 ]。薏苡具有抗病虫、适应性强、品
质好等优良性状 ,是改良玉米等禾谷类作物的优良
种质资源 [8 ]。
程序性细胞死亡在细胞分化和发育的过程中起
着重要作用。基因 Dad -1是普遍存在于动物和植物
中一个高度保守的程序性细胞死亡抑制基因。 1993
年 Nakashima等研究者首次从仓鼠的突变细胞系
tsBN 7中克隆到抑制细胞凋亡的 Dad -1 ( Defender
against apopto tic cel l death)基因 ,它编码一种疏水
蛋白。此后 ,在人、爪蟾、小鼠、线虫、拟南芥和水稻中
都克隆出与仓鼠 Dad -1基因同源的 cDN A序列 ,它
们都能有效地抑制仓鼠 t sBN7细胞的凋亡 [9 12 ]。水
稻 Dad -1基因被物理定位在水稻第 2染色体短臂
末端 [13 ]。 比较物理定位的结果表明在玉米的第 4、 5
染色体长臂末端和第 9染色体短臂末端上都存在
Dad -1基因的同源序列 [13 ]。本研究采用 Southern杂
交在薏苡中检出了 Dad -1基因的同源序列 ,并利用
荧光原位杂交的方法对其进行了染色体物理定位。
1 材料和方法
1. 1 材料
供试材料武汉薏苡 (Coix lacryma-jobi )由华中
农业大学农学系李建生教授提供。染色体制片参照
Song等 1995年的程序 [14 ]略有修改。取生长旺盛的
根尖 ,在水饱和的α-溴萘溶液中于 25℃处理 2. 5 h,
用新鲜固定液 (甲醇∶冰乙酸 = 3∶ 1) 4℃过夜 ,
ddH2O充分洗净 , 1%的纤维素酶和 1%的果胶酶
( SERV A) 28℃条件下酶解约 3 h。水洗并固定后采
用火焰干燥法制片。
1. 2 原位杂交的 DNA探针及标记
探针 Dad-1 cDN A序列长 1. 5 kb,克隆在载体
pUC19上。用切口平移法对 Dad -1 cDN A探针进行
标记 , 0. 5mol /L Na2 EDTA终止液终止。Sepha rose
CL-6B ( Sigma )凝胶柱离心纯化 ,点印迹检测标记
效果。
1. 3 Southern杂交
薏苡总 DNA的提取和 Southern杂交分别参
照 Doyle[15 ]和 Sambrook[16 ]的方法。薏苡总 DNA分
别经限制性内切酶 HindⅢ和 EcoRⅠ 进行酶切后 ,
用 0. 8%琼脂糖凝胶电泳 ,然后转移至 Hybond N+
尼龙膜上。加入经 32 P-dCTP标记的 Dad-1 cDN A进
行杂交 ,杂交完成后 ,取出杂交膜 ,洗涤后放在
- 20℃冰箱中放射自显影 4～ 7 d,冲洗 X光片。
1. 4 原位杂交及荧光信号检出 ( FISH )
原位杂交及信号检出参照 Song等的程序 [14 ] ,
并加以适当修改。每张染色体制片所用的杂交混合
液 ( 50μL)含约 0. 2μg标记的 DNA片段 , 50%去
离子甲酰胺 ( Sigma ) , 10%硫酸葡聚糖 ( Sigma ) ,
4. 2μg ssDN A, 2× SSC。 杂交混合液在沸水中煮
10 min后 ,迅速置于冰上放置 10 min以上。 杂交在
37℃下进行 ,约 16～ 24 h。
荧光检出程序: ( 1)杂交后的片子依次在 42℃
下于 20%的甲酰胺、 2× SSC溶液、 0. 1× SSC溶液
中各漂洗 15 min; 0. 1% Tri tonX-100室温下处理
5 min; PBS室温下处理 2× 5 min。之后加入链亲和
素-Cy3 ( Kirkegaard perry labo ra to ries) , 37℃于保
湿皿中温育 30 min后 ,室温下 PBS溶液洗 3×
5 min;然后加入生物素化的链亲和素 (V ector labo-
rato ries ) , 37℃于保湿皿中温育 30 min后 ,室温下
PBS溶液洗 3× 5 min;再加入链亲和素-Cy3, 37℃
于保湿皿中温育 30 min后 ,室温下 PBS溶液洗 3×
5 min; 每张制片加 40μL ( 10μg /m L)含 20%抗瘁
灭剂 V ectashield的 DAPI ( 4 6-diamidino-2-pheny-
lindole)复染。制片在 Olympus BX60荧光显微镜下
观察。
2 结果与分析
Dad -1基因与经限制性内切酶 HindⅢ 和
EcoRⅠ进行酶切的薏苡总 DNA Southern杂交 ,均
呈现 3条主带 (图 1) , Southern结果证实在薏苡基
因组中存在水稻 Dad -1基因的同源序列 ,这为进一
步用荧光原位杂交的方法在薏苡染色体上定位
Dad -1基因打下了基础。
经链亲和素 -Cy3和 DAPI复染后 ,染色体呈现
蓝色而信号点显示为红色。荧光原位杂交的结果表
明 ,在薏苡基因组中 Dad -1基因的同源序列位于第
9染色体短臂上 ,信号与着丝粒的百分距离为
67. 44± 1. 45。我们发现仅有极少部分分裂相在 2个
同源染色体上都出现杂交信号 (图 2: A) ,大部分分
裂相只有 1条染色体上显示杂交信号双点或单点
(图 2: B, C) ,大部分的间期核中显示 2个杂交信号
(图 2: D)。
472 武 汉 植 物 学 研 究 第 21卷
A.薏苡总 DN A经 HindⅢ 酶切 ; B.薏苡总 DN A经
EcoRⅠ 酶切
A. C. lacryma-jobi genom e DNA was dig ested with HindⅢ ; B. C. lacryma-jobi genome DN A w as dig ested w ith
EcoRⅠ
图 1 Dad-1与薏苡总 DNA Southern杂交结果
Fig. 1 Southe rn-hybridized w ith Dad -1
inC . lacryma -jobi
3 讨论
薏苡体细胞中期的染色体均匀地浓缩成短棒形
状 ,染色体识别存在着很大的困难。然而 ,薏苡前中
期的染色体相对较长 ,经过荧光染料 DAPI染色后 ,
染色体上出现明显不同的深染区和浅染区。 除染色
体相对长度及臂比外 ,根据各染色体间 DAPI染色
颗粒分布模式的不同 ,我们构建了薏苡前中期染色
体的数量染色体图 (未发表资料 )。 该数量染色体图
为识别薏苡基因组中每条染色体提供了有利依据。
本研究中 ,具有 Dad-1基因杂交信号的染色体 9就
是根据这个数量染色体图被识别的。
作为一种重要的检测和定位特定 DNA序列的
分子细胞遗传学方法 ,荧光原位杂交由于它的强反
差、高灵敏度和检出率而被广泛应用于细胞遗传学
的许多领域 ,展现了良好的发展和应用前景 [17, 18 ]。
至今 , 越来越多的单拷贝基因已用荧光原位杂交方
A～ C. Dad-1基因被定位在第 9染色体短臂上 ; D.显示 Dad -1基因在间期核中的杂交信号
A- C. Signals o f Dad-1 w ere detected on sh or t arm of chromosome 9 inC . lacryma -jobi;
D. Signals of Dad-1 w ere detected in interphase nucleus of C . lacryma-jobi
图 2 水稻 Dad-1基因在薏苡中的荧光原位杂交结果
Fig. 2 F ISH results of rice Dad-1 in C. lacryma-jobi
473 第 6期 韩永华等: 水稻程序性细胞死亡抑制基因 Dad -1在薏苡中的定位
法进行了成功的定位 [19, 20 ]。但是 , 荧光原位杂交的
致命弱点是荧光信号容易瘁灭 ,通过一般的照相装
置很不容易抓获。本研究中 ,我们使用了合适的抗瘁
灭剂及高灵敏度的 CCD照相装置 ,而且对信号进行
了多重放大 ,使信号的检出率大大提高。因此我们成
功地定位了水稻 Dad-1基因在薏苡前中期的染色
体。
比较遗传作图研究表明玉米的第 4和第 5染色
体长臂与水稻的第 2染色体高度同源 [ 21] ,在玉米的
第 4、第 5和第 9染色体间存在着共线性片段 [22 ]。水
稻 Dad -1基因在水稻和玉米中的比较物理定位结
果与比较遗传图的结果一致 ,定位在水稻第 2染色
体短臂上的 Dad -1基因在玉米中的第 4、 5染色体
长臂和第 9染色体短臂上都检测到它的同源序
列 [13 ]。尽管在薏苡与水稻之间基因的比较遗传作图
的研究还未见报道 ,我们推测薏苡的染色体 9也许
是与水稻的染色体 2是同源的 ,当然这需要通过进
一步的实验来证实。
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