全 文 ：北 京
J O U R N A L O F BE I JI N G
大 学 李 报
M E DI CA L U N I V E R SI T Y V
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4 1 9 8 7
.
2 47
·
二氢农吉利碱对人体肝癌细胞系及
小鼠艾氏腹水癌细胞的影响
基础医学院北京医科大学 药 学 院
孙曼琴
余诚方
装 李孙庚
崔季巧
吴晓芳
张佩英
邹俊华
}王 序 l
〔提要〕 二氢农吉利碱可降低人体肝癌细胞系 ( BE L一 7 4 0 2) 细胞的生长和有丝分裂指数 , 增加其死
亡率 , 对小鼠艾氏腹水癌细胞数目的增长也有抑制作用 。 农吉利碱的烯丙醋结构 , 不是农吉利碱抗癌活
性的主要部位 。 改变双稠咄咯环 1、 2 位双键 , 生成的二氢农吉利碱仍具有抗癌性 , 而对肝脏的毒性作
用较小 。 二氢农吉利碱 L D 。 。 为 1 0通Z m g / k g ( i . p . ) 。
农吉利碱 (M o n o e r o t a l i n e ) 是一类双稠咄
咯咤类生物碱 , 对人体皮肤癌 、 宫颈癌有显著
的临床疗效 , 对动物移植性实验肿瘤也有较高
的抑制率 , 但有迟发性肝脏损害 , 使临床应用
受到限制 `” 。
C ul v e n o r 等认为 ` 2 ’ , 农吉利碱产生抗癌及
肝毒作用在化学结构上是同一部位 , 即化合物
的烯丙醋部分 , 因此对农吉利碱烯丙醋结构进
行改造 , 合成二氢农吉利碱 。
本实验探讨二氢农吉利碱的抗癌作用及对
肝毒的影响 。
实 验 材 料
人体肝癌细胞系 ( B E L 一 7 4 0 2 ) 由北京肿瘤
所提供 。 艾氏腹水癌种小鼠由北京医科大学生
化教研室提供 。 R p M I 一 1 6 4 0 培养粉及 M 一 1 9 9
培养粉均由日本进 口 。 农吉利碱及二氢农吉利
碱由北京 医科大学 药学院 有机化 学教研室提
供 。
方法及结果
一 、 二氢 农吉 利碱 对人 体 肝 癌 细 胞系
( B E L
一 7 4 0 2 )细胞生长的影响 :
细胞培养液的制备 : R M IP 一 1 6 4 0 液 80 % ,
小牛 血清 20 % , 加 1% 的青 、 链霉 素混 合物
(最终浓度 分 别 为 1 0 单 位 / m l) , 用 3 . 5%
N a H C 0 3 调 P H 至 7 . 2 。
取贴瓶 生长的 细胞 , 用 。 . 02 % E D T A 液
消化后 , 换培养液作成细胞悬液 , 按每瓶 29 . 。
>< 1沪 个细胞 5/ m l 培养液接种 , 分装 56 瓶 。
在 37 OC 恒温箱培养 48 小时 后 , 随机将 56 瓶
细胞分为 6 组 : 空 白对照组 16 瓶 , 生理盐水
对照组 16 瓶 , 农吉利碱阳性对照组 6 瓶 , 二
氢农吉利碱分为三个剂量组 , 每组 6 瓶 。
分组后 , 立即换培养液加药 , 空白组不加
药 ; 生理盐水组加生理盐水量与所加最高浓度
二氢农吉利碱的液量相同 ; 农吉利碱组每毫升
培养液 加 3% 农吉 利 碱 0 . 01 m l (最 终 浓度
3 0 召g / m l ) ,二氢农吉利碱三个剂量组 ,按每毫
升培养液分别加人 1% 、 3% 、 5%二氢农吉利
碱 o . o l m l (最终浓度为 1 0 0 “ g / m l 、 3 00 拼g / m l
5 0 0卜g / m l ) , 加药后继续置 3 7 “ C 恒温箱培养 。
空白对照组和生理盐水对照组 , 自分组加
药后第 1 天起 , 逐 日每组各取 2瓶细胞进行细
胞计数 , 共计数 8 天 。 其它各组 , 分别在分组
加药后的第 1 、 第 3 、 第 5 天每组各取 2 瓶细
胞计数 , 各取其平均值 。 结果如表 1 。
由表 1 可见二氢农吉利碱组 30 0 拜g /m l 和
50 0 拼 g /m l 齐叮量 , 对人 体肝癌 细胞系 ( B E L -
7 4 0 2 )细饱生长有抑制作用 。
表 1 二氢农吉利碱对人体肝癌细
胞系 ( B E L一 47 0 2 )细胞生 民的影响
1 0 个细胞
的平 均值 ,
记录其中的死亡细胞数 , 取 2 瓶
细胞
瓶数
细胞 数 x 1 0 5 /
5 m l 戈土 S又
并 计算出 死亡率
(
P 值
死亡细胞数
总细胞数
空 白组
生理盐水组
农吉利碱组 ( 3 00 户 g / m l)
二氢农吉利碱组 ( 1 0即 g / m幻
( 3 0 0召g / ; n l )
( 5 0 0户g /m l )
1 8 6
.
0 士 5 4 ` 0
1 8 6
.
5士 5 4 . 9
30 士 8 . 8
9 6
.
5土 2 4 . 2
3 8
.
1 士 1 3 . 1
4 4
.
6土 15 . 0
`。。%
)
。 结果见表 2 。
表 2 二氢农吉利碱对人体肝癌细胞系
( B E L
一 7 4 0 2 )细胞死亡率的影响
细胞
瓶数
细胞死亡数
X 十 S又
P 值
口口óJla工八U八甘n曰nùnùOé八UU势丈夕
ùó51勺一ó尸Oō”óOnùn.`U八材onùó八U><
二 、 二氢 农吉 利碱 对人 体 肝癌 细 胞系
( B E L
一 7 4 0 2) 细胞有丝分裂指数的影响 :
实验方法同前 , 制成细胞悬液 , 按每毫升
培养液含 1 . 5 x 10 5 个细胞的 浓度 , 在培养瓶
中用盖片法培养 , 每瓶 5 m l 细胞悬液 , 置 3 7℃
恒温箱培养 。 培养 48 小时后 , 换液 、 分组 、加
药与前一实验方法的步骤相同 。
在加药后的第 1 、 第 3 、 第 5 天每组分别
各取出三张盖片 , 用 B o ul sn 液 固定 , H E 染
色 , 将制片 在高倍镜下 观察 , 每张盖片观察
1 0 0 个细胞 , 记录其中进行有丝 分裂的细胞
数 (即分裂指数 ) 各组均取其平均值 。 结果见
图 1 。
空白组
生理盐水组
农吉利碱组 ( 30 0召 g / m l )
二氢农吉利碱组 ( 10 0刀 g / m一)
( 3 00召 g / m l )
( 5 0 0不, g / m l )
2 9
.
2 士 4 . 2 9
32
.
7士 3 . 7
55
.
7土 8 . 9
5 1
.
9士 1 0 8
52
.
0士 9 . 9
5 3
.
0上 1 0 . 2
口空白对照组
. 生理盐水组
目 阳 性对照组
. 10 0 ” g 组
皿 30 0阳组
叮 5 00 p g 组
由表 2 可见二氢农吉利碱能增加癌细胞死
亡率 。
四 、 二氢农吉利碱对小鼠艾氏腹水癌细胞
的影响 :
取 18 ~ 忍 5 克体重的瑞士种小鼠 30 只 , 雌
雄各半 , 每只小鼠均以 0 . 2 m l 艾氏 腹水癌腹
水原液接种于腹腔 , 随机分为 3 组 : 生理盐水
对照组 、 农吉利碱阳性对照组和二氢农吉利碱
组 , 分别皮下给药 , 共 7 天 。 处死前禁食 14
小时 , 不限饮水 。 给药 7天后 , 断髓处死小鼠 ,
取腹水 2 滴 混于 2 m l l 9 9 培养 液 中 , 用血球
计数板计细胞数 , 实验结果见表 3。
表 3 二氢农吉利碱对小鼠艾氏腹
水癌细胞数的影响
8064有丝裂数分指
动物数
加药后天数
图 I 二氢农吉利碱对人体肝癌细胞系 ( B E L 一 7 4 0 2)
细胞有丝分裂指数的影响
药物 (皮下注射 ) 细胞数
x l o
.
个细胞 / m *l P 值
(只 ) I X 士 S元
由图 1 可见二氢农吉利碱对人体肝癌细胞
系 ( B E L 一 7 4 02) 细胞有丝分裂 指数有 抑制作
用 。
三 、 二氢 农 吉 利碱 对人 体肝 癌 细 胞系
( B E L
一
74 02 )细胞死亡率的影响 :
实验方法和步骤同前 , 于加药后的第 1 天
第 3天和第 5 天 , 每组各取 2瓶细胞制成细胞
忿液 , 用 0 . 2% 台盘兰染色 , 每瓶在镜下观察
生理盐水组 ( i o m l / k g x 7 )
农吉利碱组 ( l o om g / k g x 7 )
二氢农吉利碱组 ( 1 0 m g/
k g X 7 )
1 0
1 0
3 7
.
4土 0 . 7 0
1 9
.
0 土 0 . 3 9
17
.
9土 0 . 5 1
< 0
.
0 5
< 0
.
05
用培养液稀释过的腹水。
由表 3 可见皮下注射二氢农吉利碱 , 可使
小鼠艾氏腹水癌细胞数减少 。
五 、 二氢农吉利碱对小鼠肝脏的影响 :
取体重 1 8~ 2 0 克瑞士种小鼠 30 只 , 雌雄
灰J
客平 , 随机分为 3 组 : 生理盐水组 、 农吉利碱组
和二氢农吉利碱组 。 各组分别腹腔注射给药 ,
共 15 天 , 第 16 夭断髓剖腹取肝 ,称肝重后 , 各
取部分肝组织用 B o iu sn 液固定 , 作石蜡切片 ,
H E 染色 , 在光镜下作病理检查 。 结果见表 4
和图 2~ 4 。
表 4 二氢农吉利碱对小鼠肝脏的影响
药物 (腹腔注射 ) 动物数 {平均体重 {平均肝重
(只 ) ! (克 ) ! (克 )
州叫回四川生理盐水组 ( 1 0 m l / k g x 2 5 )农吉利碱组 ( l o o m g / k g x
1 5 )
二氢农吉利碱组 ( 1。。 m g / k g
对动物移植性肿瘤实验 , 二氢农吉利碱能使小
鼠艾氏腹水癌细胞数减少 。 上述结果表明 , 二
氢农吉利碱对体内和体外实验的癌细抱均有抑
制作用 。
为了更好地了解二氢农吉利碱 的 抗 癌 作
用 , 我们选用农吉利碱作阳性对照 。 实验结果
表明农吉利碱的双稠咄咯嚏环的双键 , 加氢后
(即不存在烯丙醋结构 )仍具有抗癌作用而对肝
毒性减小 。 在实验过程中 , 还观察到二氢农吉
利碱组实验动物的精神状态 、 食欲和毛的色泽
等方面均较农吉利碱组者好 。
要阐明二氢农吉利碱的构效关系 、 抗癌作
用及作用机制 , 还有待进一步研究 。
六 、 急性毒性实验 : 参 考 文 献
用序贯法观察 30 分钟 求得小鼠 腹腔注射
二氢农吉利碱的 L D 。。 为 1 0 4 2 m g / k g 。
讨 论
二氢农吉利碱每毫升培养液 1 0 拼g 、 3 0
拼g 、 5 0 户g , 可抑制人体 肝癌细胞系 ( B E L -
7 4。幻细胞的生长和分裂指数 , 增加其死亡率 ;
1
. 王序等 . 双稠毗咯咤类生物碱 结构与抗 肿瘤作用 及毒性
的研究 . 北京医院学报 1 9 5 1; 1 3 : 3 1 0 .
2
.
C u l v e n o r C C J
, e t a l
.
T u m o r
一
I n h i b i t o r y A c r i v i t y o f
P y r r o l i z id i n e A l k a ! o id s
.
J P h a r m S c i 19 6 8 ; 57 ( 7 )
:
1 1 12
.
3
. 青岛医学院肿瘤 研究室 . 农吉利碱 对人体 肝癌细 胞系
( B E L
一
7 40 2 )的某些影响 . 肿瘤防治研究 1 97 9 . ( 6 ) : 6 .
(本实验承雷道年教授和张效良同志 大力协助 , 特表诚挚
谢意 。 )
(本文图 2、 4 见插页第 2 页 )
E F F E C T S O F D IH Y D R O M O N O C R O T A L I N E O N T H E
L I N E O F H U M A N L I V E R C A N C E R C E L L S ( B E L -
7 4 0 2 ) I N V I T R O A N D O N E H R L I C H
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C A N C E R C E L L S O F M I C E I N V I V O
S e h o o l o f B a s i e M e d i e a l S e i e n e e s S u n M a n
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T h e g r o w th
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( B E L
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` e r o u s P o s it i o n o f m o n o e r o t a l i n e
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P o s i t i o n o f Py r r o l i z i d i n e o f m o n o e r o t a l i n e s t i l l m a i n t a i n s t h e a n t i一 e a n e e r o u s e f f e e t a s
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f o u n d t o b e 1 0 4 2 m g / k g
二氢农吉利碱对人体肝癌细胞系及
小鼠艾氏腹水癌细胞的影响
孙 受 琴 等
(正文见第 2 4 7页 )
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图 3
图 4
原发性巨球蛋白血症的病理特征 (一例报告)
汤 共 苏 等 (不 t 口蟹 2弓O衍 、
图 l 淋巴结正常结构消失 , 淋巴组织呈弥漫性增生并浸润被膜 。 H E x 40
图 2 增生的细胞主要是淋巴细胞 , 右上方可见多数浆细胞及淋巴细胞样浆细胞 。 H E x 1 60
图 3 淋巴细胞弥漫性增生 , 图上方可见一个成熟的浆细胞 , 胞浆内充满蛋白性物质 , 胞核偏位 。 H E 界 10 0
一 2 2 一