全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2011, 46 (4): 396–406, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2011.00396
——————————————————
收稿日期: 2010-10-26; 接受日期: 2011-01-11
基金项目: 国家自然科学基金(No.30970288)、山东省自然科学基金(No.ZR2010CM024)和植物生理学与生物化学国家重点实验室开放
课题(No.SKLPPBKF09001)
* 通讯作者。E-mail: liuxin6080@yahoo.com.cn
H2S可能作为H2O2的下游信号介导茉莉酸诱导的
蚕豆气孔关闭
侯智慧, 刘菁, 侯丽霞, 李希东, 刘新*
青岛农业大学生命科学学院, 青岛 266109
摘要 以蚕豆(Vicia faba)为材料, 利用激光共聚焦显微技术和分光光度技术, 结合药理学实验, 探讨硫化氢(hydrogen
sulphide, H2S)和过氧化氢(hydrogen peroxide, H2O2)在茉莉酸(jasmonic acid, JA)调控气孔运动信号转导中的作用。结果
表明, H2S合成抑制剂氨氧基乙酸(aminooxy acetic acid, AOA)、羟胺(hydroxylamine, NH2OH)、丙酮酸钾(potasium py-
ruvate, C3H3KO3)和氨水 (ammonia, NH3), H2O2清除剂抗坏血酸 (ascorbic acid, AsA), 合成抑制剂水杨羟肟酸
(salicylhydroxamic acid, SHAM)、二苯基碘(diphenylene iodonium, DPI)均可逆转JA诱导的气孔关闭效应。JA能够明显提
高蚕豆叶片及保卫细胞中的H2O2水平、H2S含量和L-/D-半胱氨酸脱巯基酶活性; H2S合成抑制剂可抑制JA引起的叶片H2S
含量的增加; 而H2O2清除剂则可减弱JA对H2S含量变化和L-/D-半胱氨酸脱巯基酶活性的诱导效应。以上结果表明H2S和
H2O2均参与了JA诱导的蚕豆气孔关闭, 且H2S(主要由L-/D-半胱氨酸脱巯基酶合成)可能作为H2O2的下游组分参与调控这
一信号转导过程。
关键词 过氧化氢, 硫化氢, 茉莉酸, 气孔运动, 蚕豆
侯智慧, 刘菁, 侯丽霞, 李希东, 刘新 (2011). H2S可能作为H2O2的下游信号介导茉莉酸诱导的蚕豆气孔关闭. 植物学报
46, 396–406.
茉莉酸(jasmonic acid, JA)是一种对植物生长发
育以及防御反应有重要调节作用的植物激素。作为挥
发物信号, 茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)能
够通过在植株间传递信息增强植物抵御逆境的能力
(左照江等, 2009)。有报道显示, JA可调控抗旱基因的
表达进而提高拟南芥(Arabidopsis thaliana)的抗旱能
力(Huang et al., 2008); 开花的调控过程中存在JA介
导的信号转导途径(吴劲松和种康, 2002); 外施JA可
以诱使兰花等植物叶片气孔的关闭(Gehring et al.,
1997), 并且过氧化氢(hydrogen peroxide, H2O2)、
Ca2+和一氧化氮(nitrogen monoxide, NO)等信号分
子均参与JA诱导的蚕豆(Vicia faba)叶片气孔关闭的
信号转导过程 (崔香环等 , 2001; 刘新等 , 2005;
Munemasa et al., 2007), 构成了一个复杂的调控网
络。薄惠等(2005)研究表明, JA通过活化蛋白激酶
MAPK, 引起保卫细胞中H2O2含量的上升, 进而诱导
拟南芥气孔关闭; H2O2位于胞质碱化的下游, 调控胞
质Ca2+介导JA诱导气孔关闭的过程(Suhita et al.,
2004; Gonugunta et al., 2009)。在JA诱导气孔关闭
这一过程中是否还有其它信号分子参与, 以及这些信
号分子之间的关系还有待进一步研究。
硫化氢(hydrogen sulphide, H2S)和过氧化氢均
是在植物的生长、发育和胁迫应答中起重要作用的信
号分子。植物体主要通过L-/D-半胱氨酸脱巯基酶(依
赖5′-磷酸吡哆醛)催化半胱氨酸降解成H2S、丙酮酸盐
和NH3; 亦可以通过叶片吸收大气中的H2S, 或者在
亚硫酸盐还原酶的作用下 , 将SO32–直接还原成
H2S(Papenbrock et al., 2007)。植物可经多条途径合
成H2O2, 如细胞壁过氧化物酶、NADPH氧化酶、多
胺氧化酶、光合电子传递过程及脂质过氧化反应等
(Veal et al., 2007; Angelini et al., 2008)。业已证明,
H2O2可以通过激活质膜K+通道调控气孔运动(安国勇
·研究报告·
侯智慧等: H2S可能作为H2O2的下游信号介导茉莉酸诱导的蚕豆气孔关闭 397
等, 2000); H2O2还能够引起气体信号分子NO水平升
高参与乙烯调控的气孔运动(刘国华等, 2009); 同时
亦是一氧化碳(carbon monoxide, CO)诱导的气孔关
闭过程中的组分(She and Song, 2008)。最新发现,
在干旱或渗透胁迫下 , 大豆 (Glycine max)和红薯
(Ipomoea batatas)体内会产生H2S(Zhang et al.,
2009, 2010a); 且H2S通过改变H2O2的水平参与红薯
对渗透胁迫的应答(Zhang et al., 2009); 作为一种抗
氧化信号分子, H2S可以降低小麦(Triticum aestivum)
萌发过程中Al3+的毒性(Zhang et al., 2010b), 而不同
浓度的外源H2S对豌豆(Pisum sativum)根尖及其边
缘细胞产生不同的影响(李东波等, 2010)。但鲜见H2S
参与植物体其它生理过程及其与H2O2关系的报道。
气孔运动由复杂的信号网络所调节, H2S对气孔
开闭是否有重要的调控作用? 目前虽已证明H2O2、
Ca2+和NO是JA诱导的叶片气孔关闭的信号转导链中
的主要组分, 是否还有其它信号物质参与JA调控的
气孔运动? 它们在JA诱导的气孔关闭过程中存在什
么样的关系? 为了解答这些问题, 本实验以蚕豆为
材料, 探讨了H2S和H2O2在JA诱导的气孔关闭过程
中的作用及相互关系。
1 材料与方法
1.1 材料和试剂
取蚕豆(Vicia faba L.)种子用0.1%HgCl2灭菌处理后,
浸种12小时, 25°C催芽2–3天。然后置于昼夜温差
24°C/18°C、光照强度200 μmol·m–2·s–1、光照时间每
天12小时及相对湿度为60%的条件下培养3–4周后供
实验使用。
配制1 mmol·L–1 JA母液、0.4 mmol·L–1丙酮酸钾
(potasium pyruvate, C3H3KO3)、0.4 mmol·L–1氨水
(ammonia, NH3)、1 mmol·L–1硫氢化钠(sodium hydro-
sulfide, NaHS)母液、0.8 mmol·L–1羟胺(hydroxyl-
amine, NH2OH)、0.8 mmol·L–1氨氧基乙酸(aminooxy
acetic acid, AOA)、0.8 mmol·L–1 L-半胱氨酸(L-
cysteine)、0.8 mmol·L–1 D-半胱氨酸(D-cysteine)、
0.1 mmol·L–1二苯基碘(diphenylene iodonium, DPI)、
0.1 mmol·L–1水杨羟肟酸(salicylhydroxamic acid,
SHAM)和1 mmol·L–1抗坏血酸(ascorbic acid, AsA)
溶液。其中JA、AOA、DPI、SHAM、L-半胱氨酸和
D-半胱氨酸均购于Sigma公司; 其它药品为国产分析
纯。
1.2 气孔开度的测定
以3–4周龄蚕豆幼苗最上端完全展开的叶片为材料,
光诱导使气孔完全张开。撕取下表皮, 刷除掉上面黏
附的叶肉细胞。用显微测微尺测量气孔的初始孔径,
测量过程中, 随机取5个视野, 每个视野中随机取10
个气孔。然后用不同浓度和不同处理(NaHS、JA、JA
分别与C3H3KO3和NH3、NH2OH、AOA、DPI、SHAM、
AsA共处理)的表皮条缓冲液(10 mmol·L–1MES、50
mmol·L–1KCl、0.1 mmol·L–1CaCl2, 用KOH调节pH至
6.1), 在200 μmol·m–2·s–1的光照强度下处理1.5小时,
记录终态孔径。将NaHS处理测量后的表皮条, 放入
表皮条缓冲液中, 置于光下(光照强度200 μmol·m–2·
s–1)1.5小时进行洗脱, 再测量其气孔开度并记录终态
孔径。所有处理数据均以3次重复的平均值和标准误
差表示。气孔开度的测定参照刘国华等 (2009)的
方法。
1.3 保卫细胞胞内H2O2的检测
用H2O2的特异性荧光探针2,7-Dichlorodihydrofluo-
rescein diacetate(H2DCF-DA)(Sigma公司)检测保卫
细胞内的H2O2(刘国华等, 2009; 张小莉等, 2009)。以
3–4周龄蚕豆幼苗最上端完全展开的叶片为材料, 小
心撕取其下表皮, 放入表皮条缓冲液中, 光下诱导使
气孔完全张开。然后将其置于0.1 mmol·L–1JA、0.4
mmol·L–1C3H3KO3+0.4 mmol·L–1NH3、0.1 mmol·L–1
JA+0.4 mmol·L–1C3H3KO3+0.4 mmol·L–1NH3、0.8
mmol·L–1NH2OH、 0.1 mmol·L–1JA+0.8 mmol·L–1
NH2OH、0.6 mmol·L–1AOA、0.1 mmol·L–1JA+0.6
mmol·L–1AOA处理液中。处理时加入H2DCF-DA(50
μmol·L–1), 25°C、避光孵育20分钟, 孵育完毕后用表
皮条缓冲液反复冲洗多次以除去吸附的染料。处理完
毕后 , 将表皮条置于载玻片上 , 盖好盖玻片 , 蓝光
(488 nm)激发, 发射波长为505–530 nm, 用激光共
聚焦扫描显微镜(Zeiss LSM 510 META)扫描观察,
在LSM 5 Image Browse软件包下获得气孔保卫细胞
中H2O2的静态分布图像。每个处理至少设3次重复。
398 植物学报 46(4) 2011
1.4 蚕豆叶片H2O2含量的测定
取处理过的蚕豆叶片0.1 g进行H2O2含量测定, 具体
操作参考Brennan和Frenkel(1977)的方法。
1.5 蚕豆叶片H2S含量的测定
蚕豆叶片H2S含量的测定参照Sekiya等(1982)的亚
甲基蓝法。外施0.1 mmol·L–1JA分别处理0、1.5、3、
4.5、6和7.5小时后 , 取0.1 g叶片 , 加0.9 mL 20
mmol·L–1Tris-HCl(pH8.0)匀浆, 离心取上清用于检
测, 蛋白浓度为100 μg·mL–1。将装有醋酸锌的吸收
井置于装有上清的小测试管(12 mm×75 mm)内, 加
入100 μL 30 mmol·L–1FeCl3(溶于1.2 mol·L–1HCl)
和100 μL 20 mmol·L–1 N,N-二甲基-对苯二胺(溶于
7.2 mol·L–1HCl)后 , 将测试管用封口膜迅速封好 ,
于37°C反应30分钟。在670 nm波长下 , 测定吸
光度。
1.6 蚕豆叶片L-/D-半胱氨酸脱巯基酶活性的测定
蚕豆叶片L-/D-半胱氨酸脱巯基酶活性的测定参照
Riemenschneider等(2005)的方法。用0.1 mmol·L–1
JA分别与0.8 mmol·L–1AOA、0.4 mmol·L–1C3H3KO3+
0.4 mmol·L–1NH3、0.8 mmol·L–1NH2OH、0.1 mmol·
L–1DPI、0.1 mmol·L–1SHAM、1 mmol·L–1AsA共处理
4.5小时后取样。取0.1 g处理过的叶片加0.9 mL 20
mmol·L–1Tris-HCl(pH8.0)匀浆 , 离心取上清用于检
测, 蛋白浓度为100 μg·mL–1。
L-半胱氨酸脱巯基酶活性的测定是通过测定L-半
胱氨酸(含DTT)释放的H2S来完成的。1 mL的反应体
系包括: 0.8 mmol·L–1L-半胱氨酸、2.5 mmol·L–1DTT、
100 mmol·L–1Tris-HCl(pH9.0)和10 μg蛋白溶液。加
入L-半胱氨酸后置于37°C反应30分钟, 最后加入100
μL 30 mmol·L–1FeCl3(溶于1.2 mol·L–1HCl)和100 μL
20 mmol·L–1N,N-二甲基-对苯二胺(溶于7.2 mol·L–1
HCl)终止反应。在670 nm波长下, 测定吸光度。
D-半胱氨酸脱巯基酶活性的测定除了将L-半胱
氨酸换成D-半胱氨酸以及Tris-HCl的pH值为8.0外,
其余步骤与L-半胱氨酸脱巯基酶活性的测定完全相
同。对照和处理数据均以3次重复的平均值和标准误
差表示。
2 结果与讨论
2.1 H2S参与调控JA诱导的蚕豆气孔关闭
2.1.1 NaHS对蚕豆叶片气孔运动的影响
为确定NaHS的最佳作用浓度, 即在该浓度下NaHS
可明显诱导气孔关闭, 同时又不会对气孔保卫细胞造
成伤害, 观测了不同浓度NaHS对蚕豆叶片气孔运动
的影响, 并用洗脱实验检测NaHS处理后气孔保卫细
胞的活性情况。结果表明, 在一定范围内, H2S的供体
NaHS可诱导蚕豆叶片气孔关闭, 且具有浓度(图1A)
和时间效应(图1B)。洗脱实验显示, 当NaHS浓度为
0.1 mmol·L–1时, 保卫细胞保持良好的活性, 其诱导
气孔关闭的效应可以通过洗脱来恢复(图1B), 表明在
此浓度下不会对细胞造成伤害。据此, 我们认为0.1
mmol·L–1NaHS可以作为有效浓度在蚕豆叶片气孔关
闭反应中起作用, 并在后续实验中以此浓度作为合适
的处理浓度。

2.1.2 H2S参与调控JA诱导的蚕豆气孔关闭
L-/D-半胱氨酸脱巯基酶途径是植物体H2S的主要来
源, AOA和NH2OH是L-/D-半胱氨酸脱巯基酶的抑制
剂, C3H3KO3+NH3是L-/D-半胱氨酸脱巯基酶反应的
产物。结果发现, AOA、NH2OH和C3H3KO3+NH3处
理均可显著抑制JA诱导的蚕豆叶片气孔关闭(图2)。
推测, 来自L-/D-半胱氨酸脱巯基酶途径的H2S参与了
JA诱导的蚕豆气孔关闭过程。

2.1.3 JA对蚕豆叶片H2S含量及L-/D-半胱氨酸脱巯
基酶活性的影响
为进一步证明JA能够引起H2S含量的变化, 观测了
JA与H2S合成抑制剂AOA、NH2OH以及C3H3KO3+
NH3对蚕豆叶片H2S含量及L-/D-半胱氨酸脱巯基酶活
性的影响。结果表明, 0.1 mmol·L–1JA可诱导蚕豆叶
片内H2S含量明显升高, 且在处理后4.5小时达到最
大值(图3A); AOA、NH2OH和C3H3KO3+NH3可显著抑
制JA引起的蚕豆叶片H2S的产生和L-/D-半胱氨酸
脱巯基酶活性的增加(图3B–D)。由此可进一步推
测, L-/D-半胱氨酸脱巯基酶均参与了JA诱导的H2S的
合成。

侯智慧等: H2S可能作为H2O2的下游信号介导茉莉酸诱导的蚕豆气孔关闭 399



图1 NaHS对蚕豆叶片气孔运动的影响
(A) 不同浓度NaHS对蚕豆气孔开度的影响; (B) 0.1 mmol·L–1NaHS对蚕豆气孔运动影响的时间进程

Figure 1 Effect of NaHS on the stomatal movement in Vicia faba leaves
(A) Effect of NaHS of different concentrations on the stomatal aperture in V. faba; (B) Time course of the stomatal closure in-
duced by 0.1 mmol·L–1NaHS in V. faba






图2 H2S合成抑制剂对茉莉酸(JA)诱导蚕豆叶片气孔关闭的
影响
a: 无抑制剂处理; b: 0.8 mmol·L–1氨氧基乙酸(AOA); c: 0.4
mmol·L–1丙酮酸钾(C3H3KO3)+0.4 mmol·L–1氨水(NH3); d: 0.8
mmol·L–1羟胺(NH2OH)

Figure 2 Effects of H2S synthesis inhibitors on jasmonic
acid (JA)-induced stomatal closure in Vicia faba leaves
a: No treatment by inhibitors; b: 0.8 mmol·L–1 aminooxy acetic
acid (AOA); c: 0.4 mmol·L–1 potasium pyruvate (C3H3KO3)
+0.4 mmol·L–1ammonia (NH3); d: 0.8 mmol·L–1hydroxylamine
(NH2OH)
2.2 H2O2和H2S在JA诱导蚕豆气孔关闭中的相互
关系
2.2.1 H2O2参与调控JA诱导的蚕豆气孔关闭
利用H2O2清除剂AsA、NADPH氧化酶的抑制剂DPI
和细胞壁过氧化物酶的抑制剂SHAM, 分别检测0.1
mmol·L–1JA对蚕豆叶片H2O2含量和气孔运动的影
响。结果表明, 0.1 mmol·L–1JA能够增加蚕豆叶片中
H2O2的含量; 而H2O2清除剂AsA、H2O2合成抑制剂
DPI和SHAM可以显著逆转JA引起的叶片H2O2含量
的增加(图4A)。AsA、DPI和SHAM均可明显阻断0.1
mmol·L–1JA对蚕豆叶片气孔关闭的诱导作用(图4B)。
因此推测来自NADPH氧化酶和细胞壁过氧化物酶的
H2O2参与了JA诱导的蚕豆叶片气孔关闭过程。

2.2.2 H2O2清除剂及合成抑制剂对NaHS诱导蚕豆
叶片气孔关闭的影响
由图5可以看出, H2O2清除剂及合成抑制剂对NaHS
诱导蚕豆叶片气孔关闭并没有明显的影响。初步推断,
在调控气孔运动过程中H2S可能作为H2O2的下游组
400 植物学报 46(4) 2011


图3 H2S合成抑制剂对茉莉酸(JA)调控的蚕豆叶片H2S含量及L-/D-半胱氨酸脱巯基酶活性的影响
(A) 0.1 mmol·L–1JA对蚕豆叶片H2S含量的影响; (B) H2S合成抑制剂对JA调控的蚕豆叶片H2S含量的影响; (C) H2S合成抑制剂对JA
诱导的蚕豆叶片L-半胱氨酸脱巯基酶活性的影响; (D) H2S合成抑制剂对JA诱导的蚕豆叶片D-半胱氨酸脱巯基酶活性的影响。a: 无
抑制剂处理; b: 0.8 mmol·L–1AOA; c: 0.4 mmol·L–1C3H3KO3 + 0.4 mmol·L–1NH3; d: 0.8 mmol·L–1NH2OH

Figure 3 Effects of H2S synthesis inhibitors on jasmonic acid (JA)-regulated H2S level, L-/D-cysteine desulfhydrase activity in
Vicia faba leaves
(A) Effect of 0.1 mmol·L–1 JA on H2S level in V. faba leaves; (B) Effects of H2S synthesis inhibitors on JA-regulated H2S level in V.
faba leaves; (C) Effects of H2S synthesis inhibitors on JA-induced L-cysteine desulfhydrase activity in V. faba leaves; (D) Effects
of H2S synthesis inhibitors on JA-induced D-cysteine desulfhydrase activity in V. faba leaves. a: No treatment by inhibitors; b: 0.8
mmol·L–1AOA; c: 0.4 mmol·L–1C3H3KO3 + 0.4 mmol·L–1NH3; d: 0.8 mmol·L–1NH2OH


分起作用。

2.2.3 H2O2清除剂及合成抑制剂对JA诱导蚕豆叶片
H2S含量及L-/D-半胱氨酸脱巯基酶活性变化的影响
为了进一步探究H2O2和H2S在JA调控气孔运动过程
中的上下游关系, 观测了H2O2清除剂及合成抑制剂
对JA诱导蚕豆叶片H2S含量及L-/D-半胱氨酸脱巯基
酶活性变化的影响。结果表明, AsA、DPI和SHAM均
能显著抑制JA诱导的H2S含量的升高(图6A), 并对
L-/D-半胱氨酸脱巯基酶活性也有明显的抑制作用(图
6B, C)。由此推测, H2O2参与JA诱导蚕豆叶片产生
H2S的过程。

2.2.4 H2S合成抑制剂对JA诱导蚕豆保卫细胞中
H2O2水平变化的影响
利用H2O2特异性荧光探针H2DCF-DA结合激光共聚
侯智慧等: H2S可能作为H2O2的下游信号介导茉莉酸诱导的蚕豆气孔关闭 401


图4 H2O2清除剂及合成抑制剂对茉莉酸(JA)调控的蚕豆叶片H2O2含量(A)及气孔关闭(B)的影响
(A)中插图显示0.1 mmol·L–1JA对蚕豆叶片H2O2含量的影响。a: 无清除剂及抑制剂处理; b: 0.1 mmol·L–1二苯基碘(DPI); c: 0.1
mmol·L–1水杨羟肟酸(SHAM); d: 1 mmol·L–1抗坏血酸(AsA)

Figure 4 Effects of the H2O2 scavenger and H2O2 synthesis inhibitors on jasmonic acid (JA)-regulated H2O2 level (A) and
stomatal closure (B) in Vicia faba leaves
Insert in the figure (A) indicated the effect of 0.1 mmol·L–1 JA on H2O2 level in V. faba leaves. a: No treatment by the scavenger
and inhibitors; b: 0.1 mmol·L–1 diphenylene iodonium (DPI); c: 0.1 mmol·L–1 salicylhydroxamic acid (SHAM); d: 1 mmol·L–1
ascorbic acid (AsA)






图5 H2O2清除剂及合成抑制剂对NaHS诱导蚕豆叶片气孔关
闭的影响
a: 无清除剂及抑制剂处理 ; b: 0.1 mmol·L–1DPI; c: 0.1
mmol·L–1SHAM; d: 1 mmol·L–1AsA

Figure 5 Effects of the H2O2 scavenger and H2O2 synthesis
inhibitors on NaHS-induced stomatal closure in Vicia faba
leaves
a: No treatment by the scavenger and inhibitors; b: 0.1
mmol·L–1DPI; c: 0.1 mmol·L–1SHAM; d: 1 mmol·L–1AsA

焦显微技术, 检测H2S合成抑制剂AOA、NH2OH和
C3H3KO3+NH3对JA诱导的蚕豆气孔保卫细胞中H2O2
水平变化的影响。结果表明, 0.1 mmol·L–1JA能够显
著增加气孔保卫细胞中的H2O2水平, 并诱导气孔关闭
(图7A, B); AOA、NH2OH和C3H3KO3+NH3均可阻断
JA引起的气孔开度减小, 但对JA诱导产生H2O2并未
有明显影响(图7B–H)。结合图5的结果, 进一步推断
H2S位于H2O2的下游并参与JA诱导蚕豆叶片气孔关
闭的信号转导过程。

2.2.5 H2S合成抑制剂对JA诱导蚕豆叶片H2O2含量
变化的影响
为了进一步明确H2O2和H2S的上下游关系, 用H2S合
成抑制剂AOA、NH2OH和C3H3KO3+NH3分别与JA共
处理, 观测叶片中H2O2含量的变化。结果表明, AOA、
NH2OH和C3H3KO3+NH3对JA诱导产生H2O2并没有
明显影响(图8)。综合看来, 在JA调控气孔运动过程
中, NADPH氧化酶和细胞壁过氧化物酶产生的H2O2
可能通过L-/D-半胱氨酸脱巯基酶产生的H2S诱导蚕
402 植物学报 46(4) 2011


图6 H2O2清除剂及合成抑制剂对茉莉酸(JA)诱导的蚕豆叶片
H2S含量及L-/D-半胱氨酸脱巯基酶活性变化的影响
(A) H2O2清除剂及合成抑制剂对JA调控的蚕豆叶片H2S含量的
影响; (B) H2O2清除剂及合成抑制剂对JA诱导的蚕豆叶片L-半
胱氨酸脱巯基酶活性的影响; (C) H2O2清除剂及合成抑制剂对
JA诱导的蚕豆叶片D-半胱氨酸脱巯基酶活性的影响。a: 无清除
剂及抑制剂处理; b: 0.1 mmol·L–1DPI; c: 0.1 mmol·L–1SHAM;
d: 1 mmol·L–1AsA

Figure 6 Effects of the H2O2 scavenger and H2O2 synthesis
inhibitors on H2S level, L-/D-cysteine desulfhydrase activity
regulated by jasmonic acid (JA) in Vicia faba leaves
(A) Effects of the H2O2 scavenger and H2O2 synthesis inhibi-
tors on JA-regulated H2S level in V. faba leaves; (B) Effects
of the H2O2 scavenger and H2O2 synthesis inhibitors on
JA-induced L-cysteine desulfhydrase activity in V. faba
leaves; (C) Effects of the H2O2 scavenger and H2O2 synthesis
inhibitors on JA-induced D-cysteine desulfhydrase activity in
V. faba leaves. a: No treatment by the scavenger and inhibi-
tors; b: 0.1 mmol·L–1DPI; c: 0.1 mmol·L–1SHAM; d: 1 mmol·L–1AsA
豆叶片气孔关闭。
2.3 讨论
气孔是高等植物与外界环境进行水分和气体交换的
门户, 植物通过改变气孔孔径来调控蒸腾作用和光合
作用。在受到外界刺激时植物往往会通过气孔的开闭
作出应答反应(Underwood et al., 2007)。有报道表明,
JA等多种植物激素及无机离子均可诱导气孔关闭
(Acharya and Assmann, 2008; 高巍和尚忠林 ,
2010); 胞质碱化、Ca2+和H2O2均在JA诱导气孔关闭
过程中起重要作用(Gehring et al., 1997; 崔香环等,
2001)。在JA诱导气孔关闭过程中是否还存在新的信
号分子以及其具体的调节机制还需要进一步研究。
H2S是一种近年来发现的信号分子, 其在植物中
的作用及作用机制的研究还刚起步。Riemen-
schneider等(2005)在拟南芥中发现H2S作为信号分
子在控制巯基水平中起作用。Zhang等(2008)证明
H2S在促进小麦萌发和抑制铜离子胁迫引起的氧化损
伤中起重要作用, 但是H2S在气孔保卫细胞中的作用
还未见报道。本实验证明H2S的供体NaHS可以诱导
气孔关闭, 且具有浓度和时间效应(图1A, B)。研究表
明在甘蓝型油菜(Brassica napus)抵御病原体入侵过
程中, 来自L-半胱氨酸脱巯基酶的H2S起到重要作用
(Bloem et al., 2004)。本研究结果显示, JA可显著提
高蚕豆叶片的H2S水平(图3A)及L-/D-半胱氨酸脱巯
基酶的活性(图3C, D); L-/D-半胱氨酸脱巯基酶的抑
制剂AOA、NH2OH和L-/D-半胱氨酸脱巯基酶反应的
产物C3H3KO3+NH3均可显著抑制JA诱导的气孔关闭
(图2; 图7)及H2S含量的增加(图3B)。这说明H2S是JA
诱导蚕豆气孔关闭过程中的重要信号分子之一, 且
H2S主要来自L-/D-半胱氨酸脱巯基酶途径。
H2O2是植物生长发育过程中的重要信号分子,
其在MeJA、脱落酸(abscisic acid, ABA)及重碳酸盐
等诱导的拟南芥气孔关闭过程中起到重要作用(Kolla
et al., 2007; Munemasa et al., 2007)。Suhita等
(2004)研究发现H2O2位于胞质碱化的下游参与JA和
ABA诱导的拟南芥气孔关闭过程。Zhang等(2001)研
究表明H2O2通过改变胞质pH值来调控蚕豆气孔运
动。由此可见, H2O2既可单独影响气孔运动, 也可参
与激素调节气孔运动的过程, 但调控效应是不同的。
我们推测其原因可能与所研究植物材料的种类和生
侯智慧等: H2S可能作为H2O2的下游信号介导茉莉酸诱导的蚕豆气孔关闭 403



图7 H2S合成抑制剂AOA、NH2OH、C3H3KO3+NH3对茉莉酸(JA)诱导的蚕豆气孔保卫细胞中H2O2水平变化的影响
(A) MES缓冲液; (B) 0.1 mmol·L–1JA; (C) 0.8 mmol·L–1AOA; (D) 0.1 mmol·L–1JA+0.8 mmol·L–1AOA; (E) 0.4 mmol·L–1C3H3KO3+0.4
mmol·L–1NH3; (F) 0.1 mmol·L–1JA+0.4 mmol·L–1C3H3KO3+0.4 mmol·L–1NH3; (G) 0.8 mmol·L–1NH2OH; (H) 0.1 mmol·L–1JA+0.8
mmol·L–1NH2OH。A1–H1: 单个保卫细胞; A2–H2: 多个保卫细胞。Bar=10 µm

Figure 7 Effects of H2S synthesis inhibitors (AOA, NH2OH and C3H3KO3+NH3) on jasmonic acid (JA)-regulated H2O2 level in
guard cells of Vicia faba leaves
(A) MES buffer; (B) 0.1 mmol·L–1JA; (C) 0.8 mmol·L–1AOA; (D) 0.1 mmol·L–1JA+0.8 mmol·L–1AOA; (E) 0.4 mmol·L–1C3H3KO3+0.4
mmol·L–1NH3; (F) 0.1 mmol·L–1JA+0.4 mmol·L–1C3H3KO3+0.4 mmol·L–1NH3; (G) 0.8 mmol·L–1NH2OH; (H) 0.1 mmol·L–1JA+0.8
mmol·L–1NH2OH. A1–H1: Single guard cell; A2–H2: Multiple guard cells. Bar=10 μm


理状态有关; 也可能是由于植物体内的信号网络之间
存在复杂的交叉。本实验证明, JA可以诱导气孔关闭
(图2; 图7A, B), 并能提高叶片和保卫细胞中H2O2的
含量(图4A; 图7A, B)。这与崔香环等(2001)和薄惠等
(2005)的实验结果相一致。且这一过程可被H2O2的清
除剂和合成抑制剂AsA、DPI和SHAM所抑制(图4A,
B)。研究表明, 在植物中H2S和H2O2存在相互作用,
如在大豆和红薯中H2S可通过改变H2O2的含量抵御
404 植物学报 46(4) 2011


图8 H2S合成抑制剂对茉莉酸(JA)调控的蚕豆叶片H2O2含量
的影响
a: 无抑制剂处理 ; b: 0.8 mmol·L–1AOA; c: 0.4 mmol·L–1
C3H3KO3+0.4 mmol·L–1NH3; d: 0.8 mmol·L–1NH2OH

Figure 8 Effects of H2S synthesis inhibitors on jasmonic
acid (JA)-regulated H2O2 level in Vicia faba leaves
a: No treatment by inhibitors; b: 0.8 mmol·L–1AOA; c: 0.4
mmol·L–1C3H3KO3+0.4 mmol·L–1NH3; d: 0.8 mmol·L–1NH2OH


不同胁迫(Zhang et al., 2009, 2010a)。那么在调控气
孔运动过程中H2S与H2O2又存在怎样的关系呢? 本
实验结果显示, AsA、DPI和SHAM能够显著降低H2S
的水平(图6A)及L-/D-半胱氨酸脱巯基酶的活性(图
6B, C), 而H2S合成抑制剂AOA、NH2OH和C3H3KO3
+NH3对JA诱导的蚕豆叶片及保卫细胞中H2O2的水
平没有影响(图8; 图7D, F, H), 且AsA、DPI和SHAM
对NaHS诱导气孔关闭没有作用(图5)。由此推测, 在
JA调控气孔运动的过程中H2S可能位于H2O2的下
游。综合分析表明 , 来自NADPH氧化酶和细胞壁
过氧化物酶的H2O2可以通过调控L-/D-半胱氨酸
脱巯基酶活性产生H2S, 进而诱导蚕豆叶片气孔
关闭。
目前H2S在植物生命活动中的作用机制研究还刚
起步, 今后还需要提供更多的分子遗传学和细胞生物
学方面的证据。如可以通过构建L-/D-半胱氨酸脱巯基
酶的突变体, 进一步证实来自半胱氨酸脱巯基酶途径
的H2S在调控气孔运动中的作用, 并探讨植物体内
H2S形成的调控因素。最近, 以动物为材料的研究结
果显示, 在生物体的不同部位H2S的合成途径不同
(Gadalla and Snyder, 2010); H2S可以通过PKA和
PLC/PKC途径调控细胞 Ca2+水平 (Yong et al.,
2010)。那么, 在保卫细胞和叶肉细胞中是否也存在
来自不同途径的H2S? 胞质Ca2+是否也介导了H2S对
气孔运动的调控? 植物体内是否存在JA-H2S-PKA或
PLC/PKC-Ca2+的作用途径。参与JA调控气孔运动过
程的H2S、H2O2、胞质pH、Ca2+和NO等各种信号分
子是否可以通过激活下游的蛋白激酶, 最终作用于细
胞骨架而调控气孔运动? 这些问题都值得进一步
研究。
致谢 中国农业大学植物生理学与生物化学国家重
点实验室王学臣教授对本研究工作给予了大力支持
和帮助, 在此表示感谢！
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406 植物学报 46(4) 2011
H2S May Function Downstream of H2O2 in Jasmonic Acid-induced
Stomatal Closure in Vicia faba
Zhihui Hou, Jing Liu, Lixia Hou, Xidong Li, Xin Liu*
College of Life Sciences, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China
Abstract Pharmacological treatments combined with laser scanning confocal microscopy (LSCM) and spectrophoto-
graphy were used to study the role of H2S and H2O2 in the signaling transduction during stomatal movement responding to
jasmonic acid (JA) in Vicia faba. Inhibitors of H2S synthesis (aminooxy acetic acid, hydroxylamine, and potasium pyruvate
+ ammonia), the scavenger of H2O2 (ascorbic acid), and the inhibitors of H2O2 synthesis (salicylhydroxamic acid, di-
phenylene iodonium) all reduced JA-induced stomatal closure. Moreover, JA enhanced H2O2 and H2S levels and
L-/D-cysteine desulfhydrase activity in leaves and guard cells. The inhibitors of L-/D-cysteine desulfhydrase diminished
JA-induced H2S production in leaves. In addition, H2O2 scavenger decreased H2S level and L-/D-cysteine desulfhydrase
activity induced by JA. Therefore, H2S and H2O2 are involved in the signal transduction pathway of JA-induced stomatal
closure. L-/D-cysteine desulfhydrase-derived H2S may represent a novel downstream component of the H2O2 signaling
cascade during JA-induced stomatal movement in V. faba.
Key words hydrogen peroxide, hydrogen sulphide, jasmonic acid, stomatal movement, Vicia faba
Hou ZH, Liu J, Hou LX, Li XD, Liu X (2011). H2S may function downstream of H2O2 in jasmonic acid-induced stomatal
closure in Vicia faba. Chin Bull Bot 46, 396–406.
———————————————
* Author for correspondence. E-mail: liuxin6080@yahoo.com.cn
(责任编辑: 刘慧君)