全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2013, 48 (1): 23–33, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2013.00023
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收稿日期: 2012-02-23; 接受日期: 2012-04-13
基金项目: 国家自然科学基金(No.30770224)
* 通讯作者。E-mail: yinongxu@ibcas.ac.cn
四合木抗逆相关的转录因子TmAP2-1基因的克隆及功能分析
王玉静1, 2, 李敏春1, 2, 武旺1, 2, 吴韩英1, 许亦农1*
1中国科学院植物研究所光生物学重点实验室, 北京 100093; 2中国科学院研究生院, 北京 100049
摘要 AP2/EREBP家族的转录因子在调控植物生长发育和应答环境胁迫方面具有重要作用。利用同源克隆结合
RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技术, 从四合木(Tetraena mongolica)中克隆了AP2/EREBP家族的基因, 将其命
名为TmAP2-1(GenBank登录号: JQ676996)。序列分析结果表明, 该基因的开放阅读框长度为1 452 bp, 编码483个氨基
酸; 比对结果显示TmAP2-1有2个AP2/ERF结构域, 属于AP2/EREBP转录因子家族的AP2亚家族。亚细胞定位实验结果表
明, TmAP2-1定位在细胞核中。该基因编码的蛋白在酵母中没有转录激活活性。利用Real-time PCR检测发现该基因在根、
茎、叶等器官中均表达, 且在叶中表达量最高。此外, TmAP2-1还受到NaCl、低温、PEG和ABA的强烈诱导, 推测TmAP2-1
可能参与四合木的逆境胁迫响应。在四合木愈伤组织中过表达该基因能够降低四合木愈伤组织中油脂的含量, 同时提高可
溶性糖的含量, 暗示该基因可能通过影响糖代谢过程参与逆境胁迫响应。
关键词 逆境, AP2/EREBP, 基因克隆, 可溶性糖, 四合木
王玉静, 李敏春, 武旺, 吴韩英, 许亦农 (2013). 四合木抗逆相关的转录因子TmAP2-1基因的克隆及功能分析. 植物学报
48, 23–33.
四合木 (Tetraena mongolica)是蒺藜科 (Zygo-
phyllaceae)四合木属的单型种, 是地球上具有代表
性的古老残遗濒危珍稀植物(陈焕镛和钱崇澍, 2004),
主要分布在内蒙古乌海市及周边的荒漠地区。四合木
是当地优良的固沙植物, 在当地的生态系统中占有重
要地位(徐庆等, 2003)。近年来由于人为破坏加剧, 使
其种群的面积和数量快速减小, 濒危状况日益严重
(智颖飙, 2004)。
四合木对极端干旱条件有很强的忍耐性。近年来,
诸多学者对四合木的耐旱机制进行了一系列的研究,
取得了一定的进展。刘果厚等(1993)报道了四合木的
水分代谢特性及其耐旱性, 他们的研究结果表明, 四
合木的保水能力很强, 是一种抗脱水能力较强的植
物。四合木幼苗可在嫩枝、叶、根和茎中积累较高含
量的脯氨酸, 以增强细胞的耐脱水能力, 从而有利于
幼苗的存活和抗旱性的提高(孙卫国和雍世鹏, 1995;
智颖飙等, 2005)。研究结果表明, 四合木具有适应干
旱的生理特征, 因此进一步阐明其抗旱分子机理并开
发和利用四合木的抗旱基因对农作物的抗旱分子育
种具有重要价值。
AP2/EREBP是一类与植物发育和抗逆性密切相
关的转录因子。AP2/EREBP含有1个或2个由约
60–70个氨基酸残基组成的非常保守的DNA结合域,
即AP2/ERF结构域。根据AP2/ERF结构域的数目和
功能, AP2/EREBP转录因子可以分为AP2和EREBP
两个亚家族和5个大的分支(DREB、ERF、AP2、RAV
和其它)(Sakuma et al., 2002)。其中, DREB类蛋白的
功能主要是参与ABA、干旱和低温等逆境的应答过程
(Gilmour et al., 2000; Sakuma et al., 2006); 而
ERF类蛋白的主要功能是调节乙烯和病原等生物胁
迫的应答(Ohme-Takagi and Shinshi, 1995; Park et
al., 2001; Yi et al., 2004); AP2亚家族转录因子主要
参与植物的生长发育过程, 如调控花、分生组织、胚
珠和种子发育(Elliott et al.,1996; Chuck et al., 1998;
Boutilier et al., 2002)。有报道显示, AP2亚家族转录
因子也参与逆境应答 (Lee et al., 2009)。鉴于
AP2/EREBP家族的基因在生物和环境胁迫应答及发
育方面都具有重要的作用 , 本实验室对四合木
AP2/EREBP家族基因进行了克隆和功能分析, 以期
以此为切入点, 初步在分子水平上阐明四合木的抗旱
·研究论文·
24 植物学报 48(1) 2013
机理。
本研究利用RACE技术 , 克隆得到四合木基因
TmAP2-1, 并分析了该基因的组织表达模式以及在
干旱、低温和高盐等胁迫处理下的表达模式; 同时通
过在四合木愈伤组织中过表达该基因, 以探明其功
能。
1 材料与方法
1.1 植物材料及培养条件
四合木(Tetraena mongolica Maxim)种子采自内蒙古
乌海市郊区。种子经75%乙醇消毒后, 置于萌发培养
基(1/2MS附加0.5 mg·L –1IBA)上萌发(25°C, 16小时
光照/8小时黑暗)。以30天苗龄的植株为材料进行组培
扩繁。实验材料均为组培苗。
1.2 总RNA的提取和cDNA第1链的合成
利用Trizol法提取四合木总RNA。经Dnase I处理去除
基因组DNA后用Promega公司的试剂反转录为
cDNA。具体操作步骤如下: (1) 在RNase-free的0.5
mL离心管中加入5 µL RNA, 1 µL Oligo dT, 用
ddH2O补足至13 µL; (2) 将混合液置于70°C水浴5分
钟, 迅速放于冰上冷却2分钟, 再加入4 µL 5×First
strand buffer, 1 µL dNTP, 1 µL RNase inhibitor,
42°C水浴2分钟后加入1 µL M-MLV reverse trans-
criptase, 将离心管置于42°C水浴反应50分钟, 再将
反应管置于70°C水浴15分钟后终止反应。反转录产
物保存于–20°C冰箱中备用。
1.3 TmAP2-1基因的克隆
利用DNAMAN对已报道的AP2亚家族的基因序列进
行比较, 分析其保守序列并设计简并引物, PCR扩增
四合木AP2片段。
参考Scotto-Lavino等(2006a)的方法进行3′RACE。
提取四合木组培苗的RNA, 用引物QT反转录, 以得
到的cDNA作为模板, 用GSP1和QO为引物进行PCR
扩增。再以PCR产物作为模板, 以GSP2和QI为引物
进行PCR扩增。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测、回
收纯化后连接pMD18-T克隆载体。载体转化大肠杆菌
后, 用引物GSP3和QI进行PCR检测, 挑取阳性单克
隆测序。测序由北京六合华大基因科技股份有限公司
完成。
参考Scotto-Lavino等(2006b)的方法进行5′RA-
CE。提取四合木组培苗的RNA, 用引物GSP1反转录
得到cDNA, 以cDNA加尾产物为模板, GSP1和AAP
为引物进行PCR扩增。以所得PCR产物作为模板, 以
GSP2和AUAP为引物进行PCR扩增。PCR产物经琼
脂糖凝胶电泳检测、回收纯化后连接pMD18-T克隆载
体 , 用引物GSP3和AUAP检测。挑取阳性单克隆
测序。
将3′RACE和5′RACE扩增结果用DNAMAN拼接
初步得出全序列, 依照拼接结果设计全序列上、下游
引物。以cDNA为模板, 经PCR扩增得到基因, 将其命
名为TmAP2-1。
1.4 植物表达载体的构建
将质粒pEGAD及TmAP2-1基因完整开放阅读框的
PCR回收产物同时用HindIII和BamHI双酶切, 经1%
核酸琼脂糖凝胶电泳及DNA回收试剂盒回收纯化后,
用T4 DNA Ligase在16°C下连接过夜。连接产物采用
热激法转化E. coli DH5α。采用碱裂解法提取质粒,
对重组表达质粒进行PCR、酶切和序列检测, 获得阳
性克隆,将质粒命名为pEGAD-TmAP2-1。
1.5 转录激活能力分析
构建表达载体 pGBKT7-TmAP2-1 和 pGBKT7-Os-
NAC5与构建植物表达载体所用方法类似, 酶切位点
是NcoI和BamHI。
用醋酸锂介导法(Gietz et al., 1995)将构建的载
体转入酵母菌AH109感受态细胞中。菌液分别均匀涂
于YPDA完全培养基、SD/Trp–培养基和SD/His–
/Ade–/Trp–三缺培养基上。观察生长情况, 判断融合
蛋白能否激活下游报告基因的表达。
1.6 瞬时表达和基因的亚细胞定位
采用Sparkes等(2006)的方法, 过夜振荡培养含有
pEGAD-TmAP2-1载体的农杆菌EHA105。将离心回
收的农杆菌用渗透缓冲液(5 g·L–1D-葡萄糖 , 0.5
mol·L–1MES, 0.02 mol·L–1Na3PO4·12H2O, 0.2 mol·
L–1乙酰丁香酮)稀释至OD600值为0.1。采用下表皮注
射法对烟草叶片进行转化。40–48小时后, 在激光共
聚焦显微镜下观察烟草叶片中GFP的表达情况。
王玉静等: 四合木抗逆相关的转录因子 TmAP2-1 基因的克隆及功能分析 25
1.7 四合木的组织表达模式分析及逆境胁迫处理
所用材料为生长1个月的四合木组培苗。组培苗的根、
茎、叶经液氮速冻后于–70°C下保存, 用于分析基因
的组织表达模式。组培苗分别用PEG6000(25%)、低
温(4°C)和NaCl(800 mmol·L–1)以及ABA(200 µmol·
L–1)处理, 并分别在处理后0、2、4、6、10和24小时
取样。样品经液氮速冻后于–70°C下保存备用。
1.8 Real-time RT-PCR分析
Real-time RT-PCR 反应按 SYBR Premix ExTaq
(TaKaRa, 日本)试剂盒所附说明书提供的方法进行。
在PCR管中依次加入10 µL SYBR Premix ExTaq、
0.4 µL PCR Forward primer、0.4 µL PCR Reverse
primer、 0.4 µL ROX Reference dye II、2 µL cDNA
和6.8 µL ddH2O, 终体积为20 µL。在MX3000P PCR
仪上运行, PCR反应程序如下: 95°C10分钟; 95°C5
秒, 55°C15秒, 72°C10秒, 40个循环; 95°C1分钟;
55°C30秒; 95°C30秒。
1.9 愈伤组织的转化及筛选
将生长1个月的四合木组培苗幼茎放置在愈伤诱导培
养基(MS附加0.25 mg·L–12,4-D和0.1 mg·L–16-BA)诱
导愈伤组织的发生。愈伤组织每3周继代1次。
用过夜振荡培养的EHA105菌液浸染愈伤组织
10–15分钟, 期间用镊子轻轻搅动菌液。倒掉菌液,
并用无菌滤纸将愈伤组织上的菌液吸掉。将转化后的
愈伤组织接种到共培养培养基上, 于25°C避光共培
养3天。
共培养结束后, 用含500 mg·L–1羧苄青霉素的蒸
馏水和液体共培养培养基轮流冲洗愈伤组织5次, 然
后用无菌滤纸吸去多余水分, 将其转入筛选培养基
(愈伤诱导培养基附加250 mg·L–1羧苄青霉素和5
mg·L–1草铵膦)上培养(25°C, 16小时光照 /8小时黑
暗)。每2周继代1次。
1.10 脂的提取及脂肪酸含量测定
脂的提取及脂肪酸含量测定参照文献 (Bligh and
Dyer, 1959; Xu et al., 2003)所述方法进行。先用氯仿
与甲醇(1:2, v/v)混合溶液提取总脂, 用薄层层析法分
离甘油脂种类。脂肪酸的甲酯化在含5%硫酸的甲醇
溶液中进行, 在90°C下反应1小时。对脂肪酸成分进
行气相色谱(HP1890)分析, 以十七碳酸(C17:0)为内
标。
1.11 可溶性糖含量的测定
可溶性糖含量的测定采用蒽酮比色法。取0.2–0.5 g
样品放入玻璃试管中, 加入10 mL蒸馏水, 用塑料薄
膜封口, 于沸水中提取20分钟, 冷却后过滤并定容至
100 mL, 此为待测液。吸取待测液1 mL于20 mL试管
中, 加入5 mL蒽酮试剂, 充分振荡, 立即将试管放入
沸水中, 煮沸10分钟, 取出后自然冷却至室温。在
620 nm波长下测定吸光值。
2 结果与分析
2.1 基因全长的克隆及生物信息学分析
本实验根据GenBank数据库中拟南芥等物种的AP2
亚家族基因的cDNA序列设计简并引物, 以RNA为模
板经RT-PCR反应获得大小为240 bp的目的片段。在
已知序列的基础上进行3′RACE和5′RACE, 然后将
3′RACE和5′RACE扩增结果用软件拼接得出全序列。
根据序列设计上、下游引物, 扩增得到cDNA序列, 命
名为TmAP2-1, 同时用该引物扩增基因组DNA得到
DNA序列。
将DNA序列提交到http://genes.mit.edu/GENS-
CAN.html进行内含子预测, 并结合cDNA序列的比对
分析表明, 该DNA序列有7个外显子和6个内含子(图
1A)。基因的开放阅读框长度为1 452 bp, 编码483个
氨基酸, 通过软件ProtParam(http://au.expasy.org/
tools/protparam.html)预测其编码蛋白质的分子量为
53 kDa, 等电点是8.99。利用NCBI 的Blast P 在蛋白
保守结构域数据库(conserved domain database,
CDD)对蛋白TmAP2-1进行蛋白结构域预测, 结果显
示该基因编码的蛋白有2个AP2/ERF结构域(图1B),
分别为137–206和239–300位氨基酸。与AP2亚家族
其它蛋白的氨基酸序列比对结果表明 , 它们在
AP2/ERF结构域的相似程度达到90%以上(图1C),
初步推测基因TmAP2-1为属于AP2亚家族的一个新
基因。我们进一步构建了AP2亚家族多种基因的系统
发生树(图1D), 结果表明, TmAP2-1与杨树(Populus
trichocarpa)中的PtAP2 (XP_002325046)同源关系
26 植物学报 48(1) 2013


图1 TmAP2-1的生物信息学分析
(A) TmAP2-1基因组结构; (B) TmAP2-1编码的蛋白序列示意图, 黑色部分为AP2结构域; (C) TmAP2-1与AP2亚家族其它成员保守
结构域的氨基酸序列比对(下划线标注区域为2个AP2/ERF结构域); (D) 利用MEGA 4软件通过邻接法构建AP2亚家族部分成员的系
统进化树
蛋白登录号: AtAIL5(拟南芥)NP_200549; AtAP2(拟南芥)AAS97941; AtWRI1(拟南芥)NP_191000; AtPLT1(拟南芥)NP_188720;
GmAIL5-like(大豆)XP_003549414; GmBBM-like(大豆)XP_003535392; GmPLT2-like(大豆)XP_003551311; MtBBM(苜蓿)AES-
92298; OsAIL-like(水稻)AAL47205; OsBBM1(水稻)AAX95437; OsAIL(水稻)AAL47210; PtAP2(杨树)XP_002325046; VvAP2(葡
萄)XP_002263597; SbAP2(高粱)XP_002437394。

Figure 1 The bioinformatic analysis of TmAP2-1
(A) Genomic structure of TmAP2-1, the solid black boxes and the solid line indicate coding regions and the intron, respectively;
(B) Schematic representation of TmAP2-1, AP2 domains are indicated by black shaded box; (C) Alignment of the conserved
regions of the deduced amino acid sequences of TmAP2-1 and other two-AP2-domain-containing genes, the two AP2 domains
are underlined; (D) Phylogenetic tree of TmAP2-1 and other members of AP2 subfamily from other plants with neighbor-joining
method using MEGA 4 software
Accession numbers of selected proteins are: AtAIL5 (Arabidopsis thaliana) NP_200549; AtAP2 (Arabidopsis thaliana)
AAS97941; AtWRI1 (Arabidopsis thaliana) NP_191000; AtPLT1 (Arabidopsis thaliana) NP_188720; GmAIL5-like (Glycine max)
XP_003549414; GmBBM-like (Glycine max) XP_003535392; GmPLT2-like (Glycine max) XP_003551311; MtBBM (Medicago
truncatula) AES92298; OsAIL-like (Oryza sativa) AAL47205; OsBBM1 (Oryza sativa) AAX95437; OsAIL (Oryza sativa)
AAL47210; PtAP2 (Populus trichocarpa) XP_002325046; VvAP2 (Vitis vinifera) XP_002263597; SbAP2 (Sorghum bicolor)
XP_002437394.

王玉静等: 四合木抗逆相关的转录因子 TmAP2-1 基因的克隆及功能分析 27
最近。
2.2 TmAP2-1的转录激活活性分析
为了分析TmAP2-1是否具有转录激活的能力, 我们
把TmAP2-1基因完整的开放阅读框和酵母转录因子
GAL4 的 DNA 结合区 (DNA-BD) 融合 , 构建载体
pGBKT7-TmAP2-1, 转化酵母菌株AH109, 使之表
达融合蛋白。OsNAC5是水稻(Oryza sativa)中的一个
转录因子, 在酵母中具有转录激活活性(Takasaki et
al., 2010)。因此, 我们同时构建了pGBKT7-OsNAC5
重组质粒作为阳性对照转化酵母。结果表明, 转化
pGBKT7-TmAP2-1、pGBKT7-OsNAC5和pGBKT7
质粒的酵母在YPDA培养基和SD/Trp–培养基上均能
正常生长, 说明载体已成功转化入酵母菌株AH109
中。而在SD/His–/Ade–/Trp–培养基上 , 则只有转化
pGBKT7-OsNAC5的酵母可以生长(图2A), 且具有β-
半乳糖苷酶活性(图2B)。以上结果说明基因TmAP2-1
在酵母中不具有转录激活功能。
2.3 TmAP2-1蛋白的亚细胞定位
为了检测TmAP2-1蛋白的亚细胞定位, 我们构建了
TmAP2-1基因与GFP报告基因的融合表达载体
pEGAD-TmAP2-1, 并通过农杆菌介导法在烟草叶片
下表皮中表达。在激光扫描共聚焦荧光显微镜下观察
GFP的瞬时表达, 结果(图3A–F)显示, 在转化空载体
pEGAD的烟草细胞中, 绿色荧光分布在细胞各个部
位, 而在转化重组质粒pEGAD-TmAP2-1的烟草细胞
中 , 仅在细胞核中观察到绿色荧光。因此 , 说明
TmAP2-1蛋白定位于细胞核。
2.4 TmAP2-1基因在四合木幼苗中的组织表达模式
分别提取四合木幼苗根、茎和叶的总RNA, 用
Real-time PCR分析TmAP2-1基因的组织表达模式。
利用组成型表达的内标基因EF1b作为内参基因, 结
果显示, TmAP2-1在根、茎和叶中均有表达, 但强弱
不同, 其中在叶中的表达量最高, 茎中次之, 根中最
少(图4A)。
2.5 TmAP2-1基因在干旱、低温和高盐胁迫下的
表达
为了确定TmAP2-1基因的生理学作用, 我们对四合
木组培苗进行了干旱(25%的PEG6000)、低温(4°C)
和高盐(800 mmol·L–1NaCl)等非生物胁迫处理, 并检
测了在不同处理时间下TmAP2-1基因的表达水平。



图2 TmAP2-1的转录激活活性分析
质粒pGBKT7和pGBKT7-OsNAC5分别为阴性对照和阳性对照。在三缺(SD/Trp–/His–/Ade–)培养基上, 只有转化阳性对照的酵母能
够正常生长(A), 且具有β-半乳糖苷酶活性(B)。

Figure 2 Transactivation assay of TmAP2-1 in the yeast strain AH109
The vector pGBKT7 and pGBKT7-OsNAC5 was expressed in yeast as a negative and positive control. The culture solution of the
transformed yeast was dropped onto SD plates without tryptophan, histidine and adenine. The plates were incubated for 3 days
(A) and subjected to β-galactosidase assay (B).
28 植物学报 48(1) 2013


图3 烟草叶片表皮细胞中TmAP2-1的亚细胞定位
(A) 荧光观察pEGAD空载体表达; (B) 透射观察pEGAD空载体表达; (C) (A)和(B)的叠加图; (D) 荧光观察TmAP2-1-GFP表达; (E)
透射观察TmAP2-1-GFP表达; (F) (D)和(E)的叠加图

Figure 3 Subcellular localization of TmAP2-1 in tobacco leaf epidermal cells
(A) Confocal images under the GFP channel showing the constitutive localization of GFP; (B) Confocal images of the same cells
in Figure 3A with transmitted light; (C) The merged images of Figure 3A and Figure 3B; (D) Confocal images under the GFP
channel showing nuclear localization of TmAP2-1-GFP; (E) Confocal images of the same cells in Figure 3D with transmitted light;
(F) The merged images of Figure 3D and Figure 3E


结果(图4B–D)显示, 不论干旱、低温或高盐胁迫, 均
对TmAP2-1基因的表达产生影响。在4小时内随着处
理时间的延长, TmAP2-1表达水平逐渐升高; 4小时
达到最大值, 随后基因的表达量开始下降; 24小时后
表达量恢复到对照的水平。上述结果表明, TmAP2-1
对非生物胁迫具有明显的应答。其中, TmAP2-1对干
旱的响应最为强烈。
2.6 TmAP2-1基因在ABA诱导下的表达
ABA在植物对高盐、低温和干旱的胁迫响应中起着重
要作用。外源ABA也能激活许多高盐、低温和干旱相
关基因的表达(Zhu, 2002; Shinozaki et al., 2003)。
为分析TmAP2-1的表达是否依赖于ABA信号通路 ,
我们检测了TmAP2-1在ABA处理下的转录水平变化。
结果 (图4E)显示 , ABA处理1小时就能明显诱导
TmAP2-1的表达, 约为对照的4.5倍; 处理2小时达到
最大值, 约是对照的9.5倍, 之后TmAP2-1的表达量
下降到对照水平。基因受ABA诱导的时间明显短于受
干旱、低温和高盐等非生物胁迫诱导的时间, 这说明
TmAP2-1基因受到干旱、高盐和低温的诱导可能是通
过ABA依赖的途径 。
2.7 在愈伤组织中过表达TmAP2-1基因使可溶性
糖含量增高
植物愈伤组织常被用于基因功能的研究(Teerawa-
nichpan et al., 2004)。通过组织培养技术, 利用四合
木幼苗的茎段, 我们成功诱导得到愈伤组织。该愈伤
组织具有植物绿色组织的功能, 能够进行光合作用以
及贮存糖和脂类。为了进一步研究TmAP2-1的功能,
将过表达载体pEGAD-TmAP2-1转入四合木愈伤组
织细胞中, 经多代筛选, 获得TmAP2-1表达量显著增
加的转基因细胞系(图5A)。
对拟南芥(Arabidopsis thaliana)ap2突变体的研
究表明, AP2可调节糖代谢, 从而控制三脂酰甘油
(triacylglycerol, TAG)的含量(Ohto et al., 2005; Jo-
fuku et al., 2005)。为了研究该基因的表达量是否引
起糖代谢的变化, 我们利用蒽酮比色法测定了转基因
愈伤组织中可溶性糖含量的变化。结果显示, 2种愈

王玉静等: 四合木抗逆相关的转录因子 TmAP2-1 基因的克隆及功能分析 29

伤组织中的糖含量存在显著差异。在对照愈伤组织中
可溶性糖含量为60.2 mg·g –1DW, 而在转基因愈伤组
织中, 可溶性糖含量为102.5 mg·g–1DW, 后者比前
者增加了67%(图5B)。这表明过表达TmAP2-1基因可
以促进四合木愈伤组织中可溶性糖含量升高。
2.8 在愈伤组织中过表达TmAP2-1基因使脂肪酸
含量降低
糖代谢可为油脂生物合成提供碳源和能量。在拟南芥
wri1突变体中, 油脂含量的减少伴随着糖含量的增加
(Cernac and Benning, 2004)。我们的研究表明, 四
合木愈伤组织过表达TmAP2-1基因引起可溶性糖含
量增加。因此, 我们进一步分析TmAP2-1基因的表达
对愈伤组织中总脂及TAG含量的影响。
转基因和野生型四合木愈伤组织中总脂和TAG
含量的气相色谱检测结果显示, 转基因愈伤组织中总
脂和TAG的含量明显降低 , 其中总脂含量由22.3
mg·g –1DW降至19 mg·g –1DW, 降低14%左右; TAG
含量由3.9 mg·g –1DW降至2.4 mg·g –1DW, 降低38%
左右(图6A, B)。由此推测TmAP2-1基因对脂肪酸的
合成起负调控作用。
3 讨论
AP2/EREBP是植物特有的含有AP2/ERF结合域的一
类转录因子。本研究从四合木中克隆了AP2/EREBP
转录因子家族的一个基因TmAP2-1。序列分析结果表
明, 该基因有7个外显子、6个内含子, 其开放阅读框
长度为1 452 bp, 编码483个氨基酸。序列比对结果
显示, 该基因有2个AP2/ERF结构域, 属于AP2亚家
_____________________________________________
←

图4 Real-time PCR检测TmAP2-1在四合木中的表达模式(3
次重复平均值±标准差)
(A) 在不同组织器官中; (B) 在PEG处理下; (C) 在低温处理
下; (D) 在高盐处理下; (E) 在ABA处理下

Figure 4 Real-time PCR analysis for the expression of
TmAP2-1 in Tetraena mongolica (The data represented the
means of three replicates±SD)
(A) In different tissues; (B) Under PEG treatment; (C) Under
cold treatment; (D) Under salt treatment; (E) Under ABA
treatment
30 植物学报 48(1) 2013


图5 野生型和TmAP2-1过表达四合木愈伤组织中TmAP2-1的
表达量(A)及可溶性糖含量(B)

Figure 5 The levels of TmAP2-1 expression (A) and con-
tent of soluble sugar (B) in wild-type (WT) and transgenic
(TmAP2-1) Tetraena mongolica callus

族(Sakuma et al., 2002)。与AP2亚家族其它基因在
AP2/ERF结构域的比对结果显示, 它们的氨基酸序
列有90%以上的相似性。构建的系统发生树显示, 该
基因与杨树中的PtAP2同源关系最近。
酵母自激活实验表明, TmAP2-1在酵母中不具有
转录激活能力。Hao等(2010)报道, 大豆NAC类转录
因子GmNAC20含有转录抑制区域NARD(NAC re-
pression domain), 因此全长序列没有转录激活活性;
将NARD结构域删除后, GmNAC20产生转录激活活
性。因此, 我们推测TmAP2-1可能也含有类似NARD
的抑制序列。TmAP2-1还可能作为一个转录抑制子抑
制目的基因的转录, 不需要有转录激活活性。此外,



图6 野生型和TmAP2-1过表达四合木愈伤组织中脂肪酸含量
(A) 总脂; (B) 三脂酰甘油

Figure 6 Content of fatty acid in the wild-type (WT) and
TmAP2-1-overexpressing Tetraena mongolica callus
(A) Total lipids; (B) Triacylglycerols (TAG)


TmAP2-1的转录激活功能的获得可能需要在植物细
胞内进行翻译后修饰。TmAP2-1不具有转录激活能力
的原因还有待证实。
四合木是一种抗逆性极强的植物 , 为了验证
TmAP2-1基因是否参与四合木的逆境响应过程, 我
们对四合木组培苗进行了干旱、高盐和低温胁迫处理,
并检测了不同处理时间TmAP2-1基因的表达水平。结
果表明, 这3种非生物胁迫均能诱导TmAP2-1基因的
上调表达, 其表达量均在处理4小时达到最高。其中,
干旱诱导的效果明显强于低温和高盐诱导。最新报道
显示, AP2亚家族基因除了参与植物的生长发育过程
以外, 同时也与植物适应环境胁迫有关。例如, ADAP
王玉静等: 四合木抗逆相关的转录因子 TmAP2-1 基因的克隆及功能分析 31
是拟南芥中受到ABA诱导的AP2亚家族的基因, 它的
缺失突变体对干旱胁迫的抗性降低 (Lee et al.,
2009)。水稻AP2亚家族Os08g34360、Os01g59780
和Os06g05340等基因的表达也受到多种生物以及非
生物因素的诱导(Sharoni et al., 2011)。本研究克隆
得到的TmAP2-1基因属于AP2亚家族, 能够应答环
境胁迫 , 并且对干旱的胁迫应答尤其强烈 , 说明
TmAP2-1可能参与四合木对逆境(尤其是干旱)的适
应过程。
TmAP2-1基因的表达受到ABA的强烈诱导。四合
木组培苗经ABA处理后, 1小时内基因的表达量明显
增高, 处理后2小时达到最高。ABA是一种对植物生
长和发育产生多种影响的重要激素(Finkelstein and
Lynch, 2002)。许多响应逆境的基因也受ABA的诱导
而表达上调(Ingram and Bartels, 1996)。根据基因表
达对ABA的依赖性, 逆境应答基因可分为ABA依赖型
和 ABA非依赖型两类 (Yamaguchi-Shinozaki and
Shinozaki, 2006)。AP2亚家族的ADAP是一个ABA依
赖型的响应逆境的基因(Lee et al., 2009)。我们的实
验结果表明, ABA不但可以诱导TmAP2-1基因的表达
上调, 而且比干旱等非生物胁迫诱导更快, 诱导时间
上的差异暗示着基因表达受到干旱、低温、高盐等非
生物胁迫的诱导可能是通过ABA依赖的途径。
本实验结果还表明, TmAP2-1基因在四合木愈伤
组织中过表达后, 转基因愈伤组织中的可溶性糖含量
升高, 总脂以及TAG含量降低。可溶性糖是植物在低
温、高盐或干旱条件下产生的渗透调节物质, 可以维
持渗透平衡、保护蛋白质分子、增加蛋白质分子的水
合度并维持光合特性, 还作为活性氧的清除剂消除胁
迫所造成的伤害(Liu and Zhu, 1997; Gupta and
Kaur, 2005; Székely et al., 2008)。在拟南芥中超表
达DREB2A和DREB1A可以增加干旱、低温和盐响应
基因的表达,其中过表达DREB1A还可以提高脯氨酸
以及可溶性糖的含量, 进而提高植物的抗性(Gilmour
et al., 2000; Sakuma et al., 2006)。过表达TmAP2-1
后, 愈伤组织可溶性糖含量升高, 可能是TmAP2-1参
与诱导的一种抗旱生理机制, 即TmAP2-1通过调节
糖代谢促进可溶性糖含量升高, 维持四合木渗透平
衡, 从而适应干旱的生长环境。
综上所述, TmAP2-1基因受干旱、低温、高盐和
ABA等非生物胁迫的诱导而上调表达; 在四合木愈伤
组织过表达该基因能够降低四合木愈伤组织中总脂
和TAG的含量, 提高可溶性糖的含量。我们预测该基
因可能通过调节糖代谢过程控制TAG及总脂的含量,
同时通过产生更多的可溶性糖来提高四合木对干旱
环境的耐受能力。
参考文献
陈焕镛, 钱崇澍 (2004). 中国植物志. 北京: 科学出版社. pp.
144–144.
刘果厚, 周世权, 张力, 蔺福金, 任林 (1993). 四合木水分代
谢特性的初步研究. 干旱地区资源与环境 7, 100–105.
孙卫国, 雍世鹏 (1995). 四合木(Tetraena mongolica Maxim)
常量元素、微量元素、氨基酸和热值的初步分析. 内蒙古大
学学报(自然科学版) 26, 462–465.
徐庆, 郭泉水, 刘世荣, 姜春前, 郝玉光 (2003). 濒危植物四
合木结实特性与植株年龄和生境关系的研究 . 林业科学
39(6), 26–32.
智颖飙 (2004). 四合木(Tetraena mongolica Maxim)异地保
护生物学基础研究. 博士论文. 呼和浩特: 内蒙古大学. pp.
112–123.
智颖飙 , 杨持 , 王再岚 , 姚一萍 , 高天云 , 郝星 , 刘建平
(2005). 四合木(Tetraena mongolica Maxim)氨基酸含量特
征分析. 内蒙古大学学报(自然科学版) 36, 306–312.
Bligh EG, Dyer WJ (1959). A rapid method of total lipid
extraction and purification. Can J Biochem Physiol 37,
911–917.
Boutilier K, Offringa R, Sharma VK, Kieft H, Ouellet T,
Zhang LM, Hattori J, Liu CM, van Lammeren AAM,
Miki BLA, Custers JBM, van Lookeren Campagne MM
(2002). Ectopic expression of BABY BOOM triggers a
conversion from vegetative to embryonic growth. Plant
Cell 14, 1737–1749.
Cernac A, Benning C (2004). WRINKLED1 encodes an
AP2/EREB domain protein involved in the control of
storage compound biosynthesis in Arabidopsis. Plant J
40, 575–585.
Chuck G, Meeley RB, Hake S (1998). The control of maize
spikelet meristem fate by the APETALA2-like gene inde-
terminate spikelet1. Genes Dev 12, 1145–1154.
Elliott RC, Betzner AS, Huttner E, Oakes MP, Tucker WQ,
Gerentes D, Perez P, Smyth DR (1996). AINTEGU-
MENTA, an APETALA2-like gene of Arabidopsis with
pleiotropic roles in ovule development and floral organ
growth. Plant Cell 8, 155–168.
Finkelstein RR, Lynch TJ (2000). The Arabidopsis abscisic
32 植物学报 48(1) 2013
acid response gene ABI5 encodes a basic leucine zipper
transcription factor. Plant Cell 12, 599–609.
Gietz RD, Schiestl RH, Willems AR, Woods RA (1995).
Studies on the transformation of intact yeast cells by the
LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast 11, 355–360.
Gilmour SJ, Sebolt AM, Salazar MP, Everard JD,
Thomashow MF (2000). Overexpression of the Arabi-
dopsis CBF3 transcriptional activator mimics multiple
biochemical changes associated with cold acclimation.
Plant Physiol 124, 1854–1865.
Gupta AK, Kaur N (2005). Sugar signaling and gene ex-
pression in relation to carbohydrate metabolism under
abiotic stresses in plants. J Biosci 30, 761–776.
Hao YJ, Song QX, Chen HW, Zou HF, Wei W, Kang XS,
Ma B, Zhang WK, Zhang JS, Chen SY (2010). Plant
NAC-type transcription factor proteins contain a NARD
domain for repression of transcriptional activation. Planta
232, 1033–1043.
Ingram J, Bartels D (1996). The molecular basis of
dehydration tolerance in plants. Annu Rev Plant Biol 47,
377–403.
Jofuku KD, Omidyar PK, Gee Z, Okamuro JK (2005).
Control of seed mass and seed yield by the floral homeo-
tic gene APETALA2. Proc Natl Acad Sci USA 102, 3117–
3122.
Lee SJ, Cho DI, Kang JY, Kim SY (2009). An ARIA-inter-
acting AP2 domain protein is a novel component of ABA
signaling. Mol Cells 27, 409–416.
Liu J, Zhu JK (1997). Proline accumulation and salt-stress-
induced gene expression in a salt-hypersensitive mutant
of Arabidopsis. Plant Physiol 114, 591–596.
Ohme-Takagi M, Shinshi H (1995). Ethylene-inducible DNA
binding proteins that interact with an ethylene-responsive
element. Plant Cell 7, 173–182.
Ohto MA, Fischer RL, Goldberg RB, Nakamura K, Harada
JJ (2005). Control of seed mass by APETALA2. Proc Natl
Acad Sci USA 102, 3123–3128.
Park JM, Park CJ, Lee SB, Ham BK, Shin R, Paek KH
(2001). Overexpression of the tobacco Tsi1 gene enco-
ding an EREBP/AP2-type transcription factor enhances
resistance against pathogen attack and osmotic stress in
tobacco. Plant Cell 13, 1035–1046.
Sakuma Y, Liu Q, Dubouzet JG, Abe H, Shinozaki K,
Yamaguchi-Shinozaki K (2002). DNA-binding specificity
of the ERF/AP2 domain of Arabidopsis DREBs, transcrip-
tion factors involved in dehydration- and cold-inducible
gene expression. Biochem Biophys Res Commun 290,
998–1009.
Sakuma Y, Maruyama K, Qin F, Osakabe Y, Shinozaki K,
Yamaguchi-Shinozaki K (2006). Dual function of an
Arabidopsis transcription factor DREB2A in water-
stress-responsive and heat-stress-responsive gene ex-
pression. Proc Natl Acad Sci USA 103, 18822–18827.
Scotto-Lavino E, Du GW, Frohman MA (2006a). 3’End
cDNA amplification using classic RACE. Nat Protoc 1,
2742–2745.
Scotto-Lavino E, Du GW, Frohman MA (2006b). 5’End
cDNA amplification using classic RACE. Nat Protoc 1,
2555–2562.
Sharoni AM, Nuruzzaman M, Satoh K, Shimizu T, Kon-
doh H, Sasaya T, Choi R, Omura T, Kikuchi S (2011).
Gene structures, classification and expression models of
the AP2/EREBP transcription factor family in rice. Plant
Cell Physiol 52, 344–360.
Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K, Seki M (2003).
Regulatory network of gene expression in the drought and
cold stress responses. Curr Opin Plant Biol 6, 410–417.
Sparkes IA, Runions J, Kearns A, Hawes C (2006). Rapid,
transient expression of fluorescent fusion proteins in to-
bacco plants and generation of stably transformed plants.
Nat Protoc 1, 2019–2025.
Székely G, Ábrahám E, Cséplõ Á, Rigó G, Zsigmond L,
Csiszár J, Ayaydin F, Strizhov N, Jásik J, Schmelzer
E, Koncz C, Szabados L (2008). Duplicated P5CS genes
of Arabidopsis play distinct roles in stress regulation and
developmental control of proline biosynthesis. Plant J 53,
11–28.
Takasaki H, Maruyama K, Kidokoro S, Ito Y, Fujita Y,
Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K, Nakashima K
(2010). The abiotic stress-responsive NAC-type transcrip-
tion factor OsNAC5 regulates stress-inducible genes and
stress tolerance in rice. Mol Genet Genomics 284, 173–
183.
Teerawanichpan P, Chandrasekharan MB, Jiang YM,
Narangajavana J, Hall TC (2004). Characterization of
two rice DNA methyltransferase genes and RNAi-medi-
ated reactivation of a silenced transgene in rice callus.
Planta 218, 337–349.
Xu YN, Wang ZN, Jiang GZ, Li LB, Kuang TY (2003). Ef-
fect of various temperatures on phosphatidylglycerol bio-
synthesis in thylakoid membranes. Plant Physiol 118,
57–63.
Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K (2006). Trans-
criptional regulatory networks in cellular responses and
王玉静等: 四合木抗逆相关的转录因子 TmAP2-1 基因的克隆及功能分析 33
tolerance to dehydration and cold stresses. Annu Rev
Plant Biol 57, 781–803.
Yi SY, Kim JH, Joung YH, Lee S, Kim WT, Yu SH, Choi D
(2004). The pepper transcription factor CaPF1 confers
pathogen and freezing tolerance in Arabidopsis. Plant
Physiol 136, 2862–2874.
Zhu JK (2002). Salt and drought stress signal transduction
in plants. Annu Rev Plant Biol 53, 247–273.

Cloning and Characterization of an AP2/EREBP Gene
TmAP2-1 from Tetraena mongolica
Yujing Wang1, 2, Minchun Li1, 2, Wang Wu1, 2, Hanying Wu1, Yinong Xu1*
1Key Laboratory of Photobiology, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China; 2Graduate
University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
Abstract AP2/EREBP transcription factors play important roles in plant morphology, development, and stress re-
sponses. We cloned and characterized a putative AP2/ERF domain-containing gene from Tetraena mongolica by ho-
mology-based cloning and rapid amplification of cDNA ends. This gene, designated TmAP2-1 (accession no. JQ676996),
encodes a protein of 483 amino acids with 2 copies of AP2 DNA binding domain. Subcellular localization analysis re-
vealed that TmAP2-1 protein localized in the nucleus. TmAP2-1 protein has no transactivation activity in yeast. The ex-
pression of TmAP2-1 is induced by cold, salt, polyethylene glycol and abscisic acid. TmAP2-1 is detected in roots, shoots
and leaves of T. mongolica, with the highest expression in leaves. Overexpression of TmAP2-1, accumulation of more
soluble sugars in T. mongolica callus, but in reduced lipid content. TmAP2-1 probably represents an AP2/EREBP gene
that plays a regulatory role in tolerance of T. mongolica to abiotic stresses by affecting accumulation of soluble sugars.
Key words abiotic stress, AP2/EREBP, gene cloning, soluble sugars, Tetraena mongolica
Wang YJ, Li MC, Wu W, Wu HY, Xu YN (2013). Cloning and characterization of an AP2/EREBP gene TmAP2-1 from Te-
traena mongolica. Chin Bull Bot 48, 23–33.
———————————————
* Author for correspondence. E-mail: yinongxu@ibcas.ac.cn
(责任编辑: 白羽红)