全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2012, 47 (1): 74–86, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2012.00074
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收稿日期: 2011-07-29; 接受日期: 2011-10-25
基金项目: 广东省科技计划(No.2010B060200039)和广州市科技亚运专项行动计划(No.2010U1-E00601)
* 通讯作者。E-mail: linzhif@scbg.ac.cn
活性氧调控植物生长发育的研究进展
林植芳*, 刘楠
中国科学院华南植物园, 广州 510650
摘要 活性氧(ROS)是植物有氧代谢过程中的副产物, 它在植物的许多生命过程中均具有有害和有利的双重功能。ROS对
细胞的氧化损伤作用和信号转导诱导植物防卫反应已有详尽的研究。近年来, 越来越多的关于ROS调控植物生长发育的证
据开始引起了人们的广泛关注。细胞的生长是植物发育的重要部分, ROS通过直接或间接调节细胞的生长来控制植物的发
育, 成为植物发育的重要调节剂。该文综述了羟自由基(.OH)及其前体超氧阴离子自由基(O2–. )和过氧化氢(H2O2)调控植物生
长发育的研究进展, 包括ROS调控植物不同器官生长的证据和机理、ROS产生的途径及其检测方法, 同时对今后的研究进
行了展望。
关键词 胞壁松弛, NADPH氧化酶, 过氧化物酶, 质膜, 活性氧
林植芳, 刘楠 (2012). 活性氧调控植物生长发育的研究进展. 植物学报 47, 74–86.
植物器官的生长包括细胞增殖(增加数量)和细胞
膨大(增大体积)两个阶段(Gapper and Dolan, 2006)。
细胞生长是植物发育的重要阶段, 其膨大生长受初生
壁的限制。细胞壁是一种动态结构, 它由包埋于相互
交织的非纤维素多糖和蛋白质衬质中的纤维素微丝
组成。细胞扩展生长时, 胞壁的聚合物网络变软, 填
料的方向重排, 胞壁的张力和细胞膨压减轻, 细胞得
以渗透吸水、胞壁扩张和体积增大(Cosgrove, 1993;
Liyama et al., 1994)。胞壁的松弛(loosening)或软化
(softening)是细胞膨大的重要前提。目前, 已有大量
的证据表明活性氧(reactive oxygen species, ROS)
是植物生长发育的重要调控因子。活性氧作为植物激
素信号的第二信使, 可调节离子通道活性和基因表
达, 并直接参与细胞壁松弛和变硬的可塑性变化, 影
响胞壁的特性 , 进而调节细胞的生长 (Schopfer,
1996; Fry, 1998; Neill et al., 2002; Foremam et al.,
2003)。
本文将从活性氧调控植物生长发育的功能、活性
氧产生与调控植物器官生长发育的机理和活性氧检
测方法3个方面概述相关的研究进展, 并对未来的研
究进行展望。
1 ROS调控植物器官的生长发育
越来越多的研究结果表明, ROS介导种子的发芽和休
眠, 参与胚轴和胚芽鞘、叶片和幼苗、根与根毛以及
花粉管和果实的生长发育。质外体(apoplast)产生的
H2O2、O2–. 和 .OH与胞壁的重建有关 (Cona et al.,
2006)。发育时植物胞壁产生.OH是具明显局部定位细
胞 (或组织)的特有事件(Ros Barceló and Gómez
Ros, 2009)。细胞伸长时, .OH一旦在胞壁专一部位产
生, 便直接介导胞壁多糖聚合物的剪切裂解, 引起胞
壁松弛, 促进细胞的生长(Fry, 1998; Kukavica et al.,
2009)。下文将按照不同器官的生长发育分别论述
ROS的功能。
1.1 胚和种子发芽、幼苗生长及种子休眠
H2O2和O2–. 的产生是大豆(Glycine max)胚吸胀和种
子发芽的早期事件。大豆种子胚轴吸胀过程在2–30
小时之间, 其胚轴吸胀时胞外的O2–. 产生速率提高近
50%, H2O2浓度提高2倍; 发芽早期O2–. 产生速率和超
氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性均
提高2倍(Puntarulo et al., 1988, 1991)。豌豆(Pisum

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林植芳等: 活性氧调控植物生长发育的研究进展 75
sativum)种子吸胀30分钟后, 便出现O2–. 和H2O2的氧
化还原猝发, 发芽40小时后出现第2次O2–. 猝发。O2–.
最初出现于幼苗根2 cm以内的伸长区, 此时O2–. 的产
生与胚根的生长呈正相关(Kranner et al., 2010)。
发芽是种子胚轴伸长后幼苗出现的过程, 这种活
跃的代谢普遍伴随着ROS的产生。大豆、玉米(Zea
mays)、向日葵(Helianthus annus)、小麦(Triticum
aestivum)、豌豆、番茄(Lycopersici esculentum)和
小红萝卜(Raphanus sativus)种子的吸胀早期皆有
H2O2产生。另外, 许多种子发芽时也累积.OH和O2–.。
Müller等(2009)提供了 .OH介导种子发芽和幼苗生长
时胞壁松弛的体内直接证据。他们使用EPR(electron
paramagnetic resonance)技术测定了水芹菜(Lepid-
ium sativum)种子发芽和幼苗生长时体内产生的.OH
和O2–. , 并以H3标记的指纹法测定了.OH对胞壁多糖
结构的影响, 结果表明发芽的水芹菜种子的胚乳盖、
胚根及正在伸长的玉米胚芽鞘的质外体均可产生.OH
和O2–. , .OH直接剪切胞壁的多糖, 引起H3指纹成分发
生变化, 致使胞壁松弛。
H2O2作为激素网络中的信息分子可刺激种子发
芽和幼苗的生长。小麦、大麦(Hordeum vulgare)、
水稻(Oryza sativa)和一些暖季生长的C4草本植物的
种子发芽及地上部的生长均受H2O2的刺激(Naredo
et al., 1998; Sarath et al., 2007)。豌豆种子经浓度为
10 mmol·L–1的H2O2浸种36小时, 发芽率可达100%,
与对照 (70%)相比差异显著 (Barba-Espin et al.,
2010)。百日菊(Zinnia elegans)种子的发芽率与H2O2
处理浓度具剂量效应, 除去种皮后其发芽反而受到
H2O2的抑制, 可见H2O2刺激百日菊种子发芽的作用
在于氧化降解种皮中的发芽抑制剂 (Ogawa and
Iwabuchi, 2001)。许多年来, 人们对H2O2促进种子发
芽的解释通常有以下几点。(1) H2O2活化氧化戊糖途
径, 刺激种子发芽(Fontaine et al., 1994); (2) H2O2
提 供 了 种 子 吸 胀 时 线 粒 体 呼 吸 所 需 的 2% 的
O2(Cakmak et al., 1993); (3) H2O2有助于坚硬的种
皮破裂, 使种子与水能相互作用; (4) H2O2氧化发芽
的抑制剂, 进而促进种子萌发(Ogawa and Iwabu-
chi, 2001; Bailly, 2004)。Schopfer等(2001)通过分析
发芽的小红萝卜的胚和种皮释放出的ROS, 提出了
一个发芽种子中形成的ROS之间生物合成关系的定
性模式。
种子休眠是其在自然条件下的重要适应性特征。
当条件不适合种子发芽和幼苗定居时, 它将一直保持
休眠状态。Oracz等(2007)发现拟南芥(Arabidopsis
thaliana)种子发芽时发生了一些蛋白质羧基化作用,
未休眠种子的胚轴的蛋白质羧基化程度显著高于休
眠的种子, 且其细胞和组织中有明显的O2–. 和H2O2存
在。将休眠的种子用甲基紫精(methyl viologen, MV)
保温3小时后, 一组专一的胚蛋白质被O2–. 氧化而终
止休眠, 结果显著加速并提高了种子的发芽率及专一
蛋白质的羧基化作用。据此, 他们提出了一种缩短种
子休眠的新机制——ROS产生和蛋白质羧基化作用
格局的靶标变化。El-Maarouf-Bouteau和Bailly(2008)
则认为ROS和激素在种子休眠解除和发芽完成过程
中起主导作用, ROS通过蛋白质氧化、基因表达和激
素信号途径而打破休眠。
1.2 胚芽鞘和下胚轴
玉米的胚芽鞘及其切段的质外体产生O2–. 的速率为
0.42–0.43 nmol.min–1. g–1FW。O2–. 主要定位于外表皮
细胞的质膜上, 而H2O2则主要存在于维管束和外表
皮细胞的原生质体中。O2–. 作为.OH形成的前体, 其产
生受其质膜上结合的NADPH氧化酶 (NADPH oxi-
dase, NOX)催化, 以NADH为电子供体(Frahry and
Schopfer, 2001)。生长素IAA诱导玉米胚芽鞘生长时
可增加O2–. 的释放 , 并增强 .OH的EPR信号。用外
源.OH处理玉米胚芽鞘切段可引起胞壁扩展及细胞的
伸长生长, 其原初生长速率与IAA诱导的生长速率相
近。生长素介导的细胞伸长生长受 .OH清除剂的抑
制, .OH引起的胞壁松弛及短期的细胞伸展生长与生
长素的作用类似(Schopfer et al., 2002)。从玉米胚芽
鞘分离的细胞壁在有HRP(辣根POD)、NADH和O2存
在时可产生 .OH, 进而引起胞壁多糖降解, 此反应可
被KCN抑制, 说明胞壁的.OH作为细胞扩展生长中的
胞壁松弛剂可由胞壁的过氧化物酶 (peroxidase,
POD)催化产生(Schweikert et al., 2002)。
下胚轴的生长能力从顶端到基部逐渐下降。黄瓜
(Cucumis sativus)下胚轴顶端活跃伸长生长时, 其基
部已停止生长。下胚轴细胞的伸长生长受酶的介导和
ROS的诱导(Pereyra et al., 2010)。松树(Pinus pi-
naster)下胚轴的生长也受ROS的调控, 但与黄瓜不
同, 随着松树幼苗生长从7天到16天, 其下胚轴质外
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体的H2O2含量也随之增加。将苗龄10天的松树下胚
轴分成4个5 mm的切段, 其H2O2含量从下胚轴顶端
到基部逐渐增高, H2O2含量与下胚轴生长呈负相关,
与此同时, POD的活性增强。表明质外体的H2O2是控
制松树下胚轴氧化还原状态及其胞壁变硬的主要因
子(Pedreira et al., 2004)。Ogawa等(1997)报道菠菜
(Spinacia oleracea)下胚轴的维管束中O2–. 产生的位
点与CuZn-SOD分布的位点一致, 主要在木质化的细
胞壁上。胞壁次生增厚时, POD催化苯丙烷类氧化积
累木质素需要H2O2的参与, 而SOD可为木质化过程
提供H2O2并保护POD免受O2–. 氧化失活。
1.3 根和根毛的生长发育
在距离根尖较近处可分化出分生、伸长和分化的细
胞。幼苗初生根的生长速率一般为1–2 mm·h–1, 此种
快速生长发生在根分生组织之后约10 mm以内。例如,
玉米幼苗的初生根最大生长速率出现于根尖后4–5
mm的生长区中部(Liszkay et al., 2004)。根尖是活跃
的ROS产生部位, ROS的产生调控根的生长和分化。
在根的不同区域中, 它可促进根的生长(在分生和伸
长区)或抑制根的生长(在分化成熟区)。目前已对拟南
芥、玉米、大麦、小麦、大豆、豌豆、绿豆(Phaseolus
radiatus)、黄瓜、洋葱(Allium cepa)和向日葵等植物
根的ROS产生部位、产生速率及其与根毛和根生长的
关系进行了研究。Frahry和Schopfer (1998)曾报道大
豆、豌豆、向日葵和玉米根的O2–. 产生速率为
0.11–1.68 nmol·g–1FW·min–1, 且随着播种天数的增
加 , 根产生的H2O2水平与根重呈正相关。Moms-
hausen等(2007)对拟南芥的研究表明, 在拟南芥根
毛生长过程中, 根的胞外ROS含量增加, pH值升高,
进而改变了根细胞壁的刚性, 促进了顶端生长。拟南
芥 rhd2突变体因缺失编码产生O2–. 的NOX的基因
(RHD2), 根发育不良, 根毛变短。另外, O2–. 与光泽精
(lucigenin)的反应产物O2–. -lucigenin的化学发光数减
少 , .OH 与 POBN(4-pyridyl-1-1-oxide-N-tertbutylni-
trone)的反应产物.OH-POBN自由基的EPR信号减弱,
仅为野生型的52%(Forman et al., 2003; Renew et
al., 2005; Carol and Dolan, 2006)。Dunand等(2007)
指出拟南芥根的生长和根毛的形成与伸长明显受到
H2O2清除剂及POD和NOX活性抑制剂的影响, O2–. 和
H2O2在根中有专门的积累区域, 其对根的生长具有
不同的作用。O2–. 主要分布于幼嫩的伸长区或正在分
化细胞的胞壁中, H2O2则存在于根伸长区末端和分化
区始端的细胞及生长的根毛中。Dunand和Penel
(2007)对拟南芥根尖的O2–. 进行了组织定位研究, 发
现距根尖80–250 µm处(分生组织和快速伸长区之间
的过渡区)的氯化硝基四氮唑蓝(O2–. -NBT)生成的蓝
色甲月朁(formazan)染色最强, 快速伸长区始于距根尖
240 µm之后, 其胞壁的O2–. -NBT染色较弱。当主根变
老时, 根尖的NBT染色程度减弱。因而认为O2–. 主要
在快速生长的细胞壁中积累, 它参与胞壁松弛过程的
起始。
Kukavica等(2009)在豌豆根分离的胞壁中检测
到.OH的EPR信号, 显示胞壁具即位产生.OH的能力。
此外 , 组织定位研究结果表明 , 豌豆主根中O2–. 和
H2O2的分布位点为木质部导管和中柱鞘细胞的胞壁,
侧根中的O2–. 主要分布于韧皮部和皮层细胞, H2O2则
分布于表皮、韧皮部和木质部细胞的胞壁中(Rodrí-
guez-Serrano et al., 2006)。
大麦根中的H2O2浓度从根尖(0–1 mm, 含根冠
和分生组织)到分化区(距根尖5–9 mm)逐渐降低, 而
成熟区的H2O2浓度稍有增加(Tamás et al., 2009)。小
麦根在氧化猝发时, 质膜和胞壁是主要的O2–. 和H2O2
源(Minibayeva et al., 2001)。Renew等(2005)利用改
进的EPR技术观察了完整的黄瓜根中.OH产生的时间
动态, 发现若从根尖中切去生长区的中部, 则 .OH的
EPR信号会减弱60%。此外, 用外源H2O2处理绿豆幼
苗根部或黄瓜去主根的外植体, 均可促进不定根的形
成和生长(Li et al., 2007, 2009)。
1.4 叶片
Rodríguez等(2002)从玉米幼苗叶片基部0–60 mm处
每隔5 mm取一切段包埋于含有DCFH(2′-7′-dichoro-
fluorescin)的琼脂中, 以检测ROS与DCFH的反应产
物DCF的亮绿色荧光。结果发现叶片伸长区(距叶舌
0–20 mm)的荧光最强 , 随后逐渐减弱 , 距基部55
mm处的切段已检测不到绿色荧光。可见不同切段的
伸长速率各异, 距叶舌5和15 mm处的伸长速率最
大。NOX的抑制剂DPI(diphenyleneiodonium)可降低
叶片切段的伸长速率, 并猝灭DCF的荧光, 进而抑制
O2
–. 的生成。显然ROS对玉米叶片伸展生长不可或缺,
NOX参与质外体ROS的产生。随后Rodríguez等
林植芳等: 活性氧调控植物生长发育的研究进展 77
(2004)又证明了盐处理导致玉米幼苗叶片生长减慢
是因为其伸长区的ROS浓度较低的缘故。减少伸长区
的O2–. 含量可降低叶片的生长速率, 叶片用NaCI处理
时加入H2O2或抗坏血酸(ascorbic acid, AsA), 其伸
长速率明显高于单加NaCI的对照处理。
1.5 花粉管
有花植物的花粉粒发芽后花粉管会快速生长, 有些植
物其花粉管生长速率可达到每秒数微米。如此高能量
的需求必然需要通过快速吸氧来实现(Tadege and
Kuhlemeier, 1997; Stone et al., 2004)。ROS是有氧
代谢的必然产物。Potocký等(2007)在生长的烟草
(Nicotiana tabacum)花粉管顶端检测到大量的ROS,
NOX的抑制剂DPI可抑制花粉管的生长和O2–. 的产
生。烟草花粉中一个特有的NOX家族成员是花粉管生
长时顶端ROS形成的来源。因此, 局部的ROS形成是
植物顶端生长的普遍特性。Cárdenas等(2006)发现台
湾百合 (Lilium formosanum)的花粉管生长速率与
NADP的荧光信号同时出现了振荡现象, 最强的信号
出现在距花粉管顶端20–40 µm处。这些荧光信号的
振荡被认为是NADPH与蛋白质的结合型与游离型之
间变化及其还原型与氧化型转化的结果。信号的谷
(NADP+相对提高)与花粉管生长的峰有强相关性, 表
明NOX形成ROS发生在生长速率变化之前。DPI抑制
NOX和线粒体NADPH脱氢酶及其它黄素蛋白酶的活
性 , 增强NADPH的荧光 , 减弱花粉管的生长。
NADPH的数量及亚顶端区的高含量ROS的产生与其
在线粒体内的分布存在一定的相关性。
1.6 果实
菜豆(Vigna sesquipedalis)荚果的生长呈现单一的S
形格局。果胶是果实细胞壁的主要成分, 其含量在果
实发育过程中变化很大。果荚伸长时, 胞壁中的中性
富含糖的分枝状果胶将转变成不分枝的高分子量果
胶, 充盈于胞壁的网络中。果实成熟时富含半乳糖的
果胶聚合物降解, 衰老的果荚细胞壁主要由纤维素和
以离子键相连的果胶组成(Stolle-Smits et al., 1999)。
Fry等 (2001)用 .OH处理罗望子果 (Pyrus com-
munis)和柑橘(Citrus reticulata)的果胶, 并以NaB3H4
作标记, 鉴定不同处理条件下多糖中3H标记的基团
数量, 结果发现木糖葡聚糖(xyloglucan)和聚半乳糖
醛酸(galacturonan)中NaB3H4反应基团的数目分别
增加了5–10倍和4倍。果胶中大部分3H标记产物均至
少有8个不同的低分子阴离子产物。.OH进攻聚半乳糖
醛酸的第4/5位或第1位点 , 导致了多糖的剪切。
经 .OH处理的木糖葡聚糖降解产物主要是中性的单
糖。采用同样的方法对梨果的研究也证明了其胞壁多
糖在果实软化过程中逐步提高了NaB3H4的可还原基
团的数量 , .OH启动了glucosulose残留物的形成。
Cheng等(2008)用 .OH处理绿色成熟香蕉(Musa bal-
bisiana)的果肉, 随后制备胞壁的乙醇提取不溶物,
经碱性水解, 凝胶渗透层析分析其产物的分子重。结
果表明, .OH处理可显著影响胞壁多糖的去聚合作用,
使释出的总糖和糖醛酸含量增加, 可溶性多糖的分子
重降低; .OH启动了多糖的分解, 加速了果实的软化。
Asthir等(2002)在大麦籽粒灌浆时的合点细胞及
维管束中均检测到明显的胺氧化酶(DAO和PAO)活
性, 故认为是胺氧化酶供给了H2O2, 胞壁木质化及随
后的共质体与外质体分离控制着麦粒灌浆过程。
1.7 木质化
木质化次生壁在维管束的发育后期产生, 木质素是次
生胞壁中的分枝状高聚物, 其功能主要是提高机械强
度, 抵御病原菌入侵并使细胞不易透水。高等植物的
管胞分子中含有高浓度的木质素。挪威云杉(Picea
abies)的木质素含量占干物质重的25%; 阔叶树中木
质素含量约占其干物质重的20%(Fagerstedt et al.,
2010)。活性氧, 尤其是H2O2在植物次生细胞壁的发
育中具有重要作用, 它参与细胞壁的木质化、形成次
生胞壁及介导胞壁的蛋白质交联 , 使胞壁增厚
(Gapper and Dolan, 2006)。H2O2存在时, POD可氧
化胞壁的单木质醇为自由基 , 随后聚合成木质素
(Karpinska et al., 2001)。Gómez Ros等(2006)观察
发现, 百日菊叶肉细胞体外培养转入分化时可持续产
生O2–. 和H2O2, H2O2产生于导管及未木质化且未分化
的类薄壁细胞中, 其产生位点及时间与初生胞壁木质
化次生增厚相一致。棉花(Gossypium hirsutum)纤维
分化发育过程中, H2O2均匀分布于纤维细胞的表面,
花后16–20天其含量最高。在未成熟的纤维中外加
H2O2可刺激次生壁的形成, 表明H2O2是棉花纤维次
生壁分化的信号分子(Potikha et al., 1999)。
SOD、POD和NOX均参与次生壁形成时H2O2的
78 植物学报 47(1) 2012
产生。已知在菠菜的维管束中存在CuZn-SOD及其产
生的O2–. 和H2O2, 故维管束可为木质素合成提供所需
的H2O2(Ogawa et al., 1997)。近年来的研究发现, 在
胞壁 (或质外体 )中存在一个新的高等电点 (PI=9)
SOD, 它对H2O2的产生具重要作用。此SOD在百日
菊、烟草、大麦、豌豆和松树等植物中已得到确认。
Karisson等(2005)研究了百日菊叶肉细胞次生壁发育
与H2O2和高等电点SOD(hipl-SOD)表达的关系, 发
现其培养72小时胞壁增厚的荧光信号与H2O2氧化
DCFH-DA的产物DCF的荧光信号均显著升高, 且其
信号持续增高至管胞完全发育。SOD抑制剂DDC(di-
ethyldithiocarbamic acid)、NOX抑制剂DPI和H2O2
清除剂AsA均能减弱木质化和管胞的发育。
2 活性氧的产生与植物器官生长发育的
调控
生命是自由基产生与抗氧化作用间的平衡, 自由基并
非全部起坏作用 , 抗氧化剂也并非全部是有益的
(Halliwall, 2006)。活性氧是植物细胞多种过程的信号
级联中心, 活跃生长组织的质外体中专一产生的活性
氧具有益的作用, 它可使细胞壁松弛并可代替生长素
诱导细胞生长(Schopfer and Liszkay, 2006)。.OH是
促进胞壁松弛的主要活性氧, 具非专一性, 是非酶促
的胞壁松弛剂。O2–. 和H2O2是.OH的前体, .OH可调节
细胞的生长途径, 即通过剪切胞壁的木质葡聚糖高聚
物(xyloglucan polymers), 降低胞壁对膨大的原生质
压力的阻抗, 使胞壁伸长(Fry, 1998; Renew et al.,
2005)。质膜结合的NOX和细胞壁结合的POD是上述
活性氧产生的2个主要酶。此2种酶均参与O2–. 和H2O2
的形成, H2O2经POD运行的羟化模式或Fe2+(Cu2+)参
与的非酶反应(Fenton reaction/Haber-Weiss reac-
tion)形成.OH。图1为3种活性氧产生的机制及其调控
生长发育的示意图(Sagi and Fluhr, 2001; Liszkay et
al., 2003; Schopfer and Liszkay, 2006)。
NOX是一种包埋于质膜的氧化酶, 以NADPH为
电子供体, 它从质膜胞质侧的NADPH接受电子并传
递给O2, 经单电子还原在质膜的质外体侧形成O2–.
(2O2+ NADPH 2O2
–. + NADP+H+), O2
–. 经胞壁结合的
SOD催化或自然歧化形成H2O2(2O2–. + 2H+H2O2 +
O2), H2O2再经Fenton反应(有还原态的Fe2+或Cu+存
在时)或Haber-Weiss反应(以O2–. 和AsA为还原剂)形
成 .OH。供给活的玉米胚芽鞘切段H2O2、 AsA或Fe
和Cu离子, 可使胞壁立即扩张, 驱动水分吸收而伸
长(Schopfer and Liszkay, 2006)。H2O2的细胞化学定
位研究表明, 其在表皮细胞壁和维管束细胞的产生位
点主要是质膜的外表面、胞壁交界处及薄的径向胞壁,
此研究支持了NOX参与H2O2形成过程的观点(Ros
Barceló and Gómez Ros, 2009)。哺乳动物的NOX
是一个多亚基的复合体, 包括gp91phox(β-亚基)、P22 phox
(α-亚基)、 P47phox、 P40phox、P67phox和Racl或RAc2
(GTPases)。α和β亚基定位于膜上, 它们形成黄素细
胞色素b558。 β亚基有Nox1、Nox2、Nox3、Nox4和
Nox5等同系物, 其含有所需的电子传递链及催化O2
还原为O2–. 的组分。其余4个为胞质型亚基。植物的
NOX结构包括β-亚基的同系物Nox2(称之为Rboh,
其N末端以 2个结构基元与Ca2+结合 )、一个小
GTPase(Rac蛋白)家族的胞质调节剂、胞质FAD-和
NADPH-结合域及6个含2个Fe血红素的跨膜螺旋
(Glyanko and Ichenko, 2010)。目前已从烟草(2个)、
番茄(2个)、拟南芥(10个)和水稻(1个)中分离克隆了类
似于哺乳动物NOX亚基(gp91phox)的植物基因同系物
(Berrards et al., 2004; Glyanko and Ischenko,
2010), 并确证了在马铃薯(Solonum tuberosum)块
茎中有NOX的gp91phox基因同系物Strboh A (Kumar
et al., 2007) 。 NOX 的 Km 值 (NADPH) 为 30–50
µmol·L–1, Km值(O2)为5–30 µmol·L–1, 对抑制剂DPI
敏感(5–10 µmol·L–1), 对NaN3、KCN和过氧化氢酶
(catalase, CAT)的敏感性则较低。NOX含有结合Ca2+
的EF臂, Ca2+是调节NOX活性的关键元素, Ca2+结合
并诱导NOXs的构象变化, 导致N-和C-末端分子间相
互作用, 使酶活化并提高活性。拟南芥的rhd突变体不
能吸收Ca2+, 故ROS的产生显著下降。外加Ca2+到含
番茄细胞膜的反应介质中可使NOX产生O2–. 的量增
加2–3倍, 这些研究结果均说明, NOX生成ROS后通
过Ca2+通道的活化来控制植物的发育(Foreman et
al., 2003; Sagi and Fluhr, 2001, 2006)。Jones等
(2007)及Gapper和Dolan (2006)曾报道小分子的
GTPase能够从空间上控制调节ROS的产生和积累。
定位于胞壁的POD是一个多基因大家族, 它以
离子键或共价键与胞壁聚合物结合。水稻有138个
POD编码基因, 拟南芥有73个POD编码基因。POD
林植芳等: 活性氧调控植物生长发育的研究进展 79

图1 质膜/胞壁的活性氧产生途径及其对植物生长发育调控的示意图

Figure 1 The schematic diagram of ROS generation pathway in plasma membrane/cell wall and their functions on the regula-
tion of plant growth and development


是双功能酶, 可在H2O2存在时氧化各种底物, 也能产
生ROS(Passardi et al., 2004)。PODs具有经典的过
氧化环活性、氧化NADH的氧化活性和羟化环活性3
种催化功能。过氧化环的运行使胞壁成分交联聚合生
成多糖-木质素的复杂网络, 细胞壁变硬, 细胞停止
生长。后2种活性则与.OH的产生有关(Liszkay et al.,
2003)。现将PODs的3种活性表示如下:
(1) NADH氧化模式: NADH + O2 → NAD + O2–.
NADH + H+ + O2
–. → NAD + H2O2
(2) 羟化环模式: O2–. + POD(Fe3+) → CIII(化合
物III)
CIII + H2O2 → .OH + POD(Fe3+) + OH– + O2
(3) 过氧化环模式: 2RH + H2O2 → 2R + 2H2O
细胞伸长生长时, POD通过NADH氧化-羟化环
模式产生.OH。现已证明用NADH和H2O2处理玉米胚
芽鞘和向日葵的下胚轴30–60分钟后, 其胞壁变软,
并开始出现明显的伸长生长。这种胞壁松弛和伸长生
长可被.OH、O2–. 和H2O2的清除剂及POD抑制剂所抑
制(Liszkay et al., 2003)。POD活性抑制剂SHAM
(salicylhydroxamic acid)可抑制豌豆和豇豆 (Vigna
unguiculata)胞壁产生O2–.的57%–64%; 大豆根H2O2
的产生明显受到外源NADH的刺激, POD抑制剂KCN
和NaN3则对其产生具有强烈抑制作用, 表明胞壁结
合的POD参与了NADH决定的O2–. 的形成(Kiba et al.,
1997; Frahry and Schopfer, 1998)。Passardi等
(2006)发现过量表达拟南芥POD编码基因的2个极为
相似的同系物可促进根的生长。在一些体外实验中,
将 NADH 和 O2 供给辣根的 POD 可产生 .OH, 用
POD+NADH+O2处理纯化的胞壁, 可引起可溶性低
分子量的多糖混合物从胞壁中释出, 可见在体内胞壁
的POD可产生 .OH, .OH使胞壁多糖网络的承载键断
裂, 导致胞壁松弛(Schweikert et al., 2002)。然而,
POD介导O2–. 的产生与NOX不同, 2个酶对O2的Km值
和对抑制剂(如KCN、NaN3和DPI)的敏感性有差别,
POD对O2的亲和力和对DPI的敏感性比NOX低, 对
KCN和NaN3的敏感性比NOX高。NADPH和NADH均
可作为POD的电子供体, 而NOX只以NADPH为电子
供体(Liszkay et al., 2003)。POD除了可通过羟化环
产生 .OH, 还可通过过氧化环和羟化环2个环的运行
调节H2O2的水平 , 进而调控细胞的伸长生长(Pas-
sardi et al., 2004)。
此外, Sagi等(2004)认为ROS除了调节细胞的生
长外, 还可能有更为复杂的作用, 如控制器官形成的
启动和数量、发育和性别分化, 例如NOX可调节真菌
Aepergillus nidulans子实体闭囊壳的形成。缺乏
Nox A活性的noxA突变体不能形成ROS和子实体
(Lara-Ortíz et al., 2003)。H2O2处理的拟南芥有9%的
植株基因表达被改变, 一些编码抗氧化酶、氧化酶及
木质素生物合成途径相关蛋白的基因表达被上调, 而
与胞壁软化有关的蛋白质(如细胞壁扩展蛋白(ex-
pansins))基因表达则被下调, 表明ROS通过控制一
些基因的表达来调节发育的程序(Ros Barceló and
80 植物学报 47(1) 2012
Gómez Ros, 2009)。
3 活性氧的检测方法
植物中活性氧的检测方法很多, 依所用的仪器不同可
分为分光光度法、高效液相法、发光光度法、荧光法
(荧光分光光度计和激光共聚焦显微镜)、电子顺磁共
振波谱(EPR/ESR)法和组织化学 /细胞化学定位法
等。这些方法各有优劣, EPR技术可直接、有效且精
确地检测自由基信号, 荧光法比分光光度法更灵敏,
分光光度法所需的仪器较简单, 而组织/细胞化学定
位法可明确ROS产生的位点及分布。
3.1 羟自由基
3.1.1 分光光度法
(1) Rhb B (罗丹明) + .OH → oxRhb。550 nm测定
(Yu et al., 2008)。
(2) DMSO (二甲基亚砜) + .OH → Methane-
sulfonic acid (亚磺酸甲烷) + .CH3。
Methanesulfonic acid + Fast blue BB salt (固蓝
BB盐 ) → Diazosufone (重氮砜 )。420 nm测定
(Steiner and Balls, 1990; Popham and Novacky,
1991)。

3.1.2 高效液相色谱法(HPLC)
(1) .OH + SA (水杨酸) → 2,3-DHBA (2,3-二羟基苯
甲酸) + 2,5-DHBA(Shen et al., 1995)。
(2) .OH + DMSO → Methanesulfonic acid
(Scaduto, 1995)。

3.1.3 荧光法
.OH+TPA (对苯二甲酸钠) → TPA-OH。Ex 326 nm、
Em 431 nm测荧光强度(Barreto et al., 1995; Frein-
bichler et al., 2008)。

3.1.4 EPR/ESR法
利用电子自旋捕获剂捕获短寿命的.OH, 产生稳定长
寿的自旋加合物, 利用EPR特有波谱的自由基信号
强度和自旋数检测.OH的生成。其捕获剂如下:
(1) .OH + DMSO → CH3SO2H + .CH3
PBN(phenyl-N-t-butylnitrone) + .CH3 → PBN/
.CH3加合物(Burkitt and Mason, 1991)。
(2) .OH + DMPO(5,5-dimethylpyrroline-N-ox-
ide) → DMPO-OH加合物(Mojović et al., 2004)。
(3) .OH + DEPMPO(5-diethoxyphosphoryl-5-
methyl-1-pyrroline-N-oxide)→DEPMPO-OH加合物。
此产物的稳定性比DMPO更强(Mojović et al., 2004)。
(4) .OH + 4-POBN[(4-pyridyl-1-1-oxide)-N-tertb-
utylnitrone] → hydroxythyl-4-POBN加合物。若用
EPR L-band分光光度计测定, 则可直接测得单个完
整幼苗的根等小组织样品的.OH产生位点(Liszkay et
al., 2004; Renew et al., 2005)。
3.2 超氧阴离子自由基
3.2.1 分光光度法
(1) O2
–. + Epinephrine (肾上腺素 ) → Adreno-
chrome (肾上腺素红)。480 nm测定肾上腺素红形成
的速率(Mohammadi and Karr, 2001)。
(2) O2
–. + Ferricytochrome C (Fe3+-cyt C) →
Ferrocytochrome C (Fe2+-cyt C) + O2。550 nm测定
(Sandalio et al., 1988)。
(3) O2
–. + NH2OH.HCI (盐酸羟胺) → OON-
HOH → NO2– + H2ONO2– + sulfanilic acid (对氨基
苯磺酸)→Diazotized sulfanilic acid(重氮化氨基苯磺
酸) + α-naphthylamine(α-萘胺) → 偶氮染料。530
nm测定(Elstner and Heupel, 1976)。
(4) O2
–. + Coumaric acid (香豆酸) + NADH +
NBT + Mn2+ → Formazan(甲月朁)。560 nm测定(Kiba
et al., 1997)。
(5) O2
–. + XTT (Na;3[(phenylamino)-carbonyl]-
3,4-tetrazolium-bis(4-methoxy-6-nitro))水溶性的蓝
色甲月朁。470 nm测定(Frahry and Schopfer, 2001)。

3.2.2 化学发光法
O2
–. + Lucigenin (光泽精) → ox lucigenin。用发光
计测定发光数。此法比化学法灵敏度高且对细胞毒性
小, 但需在非生理pH9.0下保温, 否则会因自氧化而
产生假象(Frahry and Schopfer, 2001)。

3.2.3 EPR法
与测定 .OH的方法相似。自旋捕获剂包括Tiron(1,2-
二羟基苯-3,5-二磺酸钠)、DMPO和DEPMPO等。其
林植芳等: 活性氧调控植物生长发育的研究进展 81
反应式为:
O2
–. + Tiron → Tiron semiquinone (Tiron半醌
自由基)(Qui et al., 1995)。
O2
–. + DMPO → DMPO-OOH加合物(Bačić
and Mojović, 2005)。
O2
–. + DEPMPO → DEPMPO-OOH加合物
(Mojović et al., 2004)。

3.2.4 组织化学定位
O2
–. + NBT (专一的组织化学探针) → 蓝色不溶性甲
月朁出现于O2–. 产生的部位, 显微镜观察并拍照或用计
算机分析其成像的像素比例, 得出半定量结果(Fryer
et al., 2002; Romero-Puertas et al., 2004)。

3.2.5 细胞化学定位
O2
–. + DAB (3,3-diaminobenzidine tetrahydrochlo-
ride) + Mn2+ → Mn3+-DAB + H2O2。形成不溶性喜锇
聚合物, 经戊二醛固定、脱水、后固定、包埋和超薄
切片系列过程后, 用透射电子显微镜观察O2–. 在亚细
胞器中的分布位点及特征(Romero-Puertas et al.,
2004)。
3.3 过氧化氢
3.3.1 分光光度法
(1) H2O2 + Titanium sulfate (硫酸钛)或Titanium
chloride → Ti4+沉淀, 20%H2SO4溶解。410 nm测定
(Lara-Nuñez et al., 2006; Huang et al., 2011)。
(2) H2O2 + KI。390 nm测定(Velikova et al.,
2000)。
(3) H2O2 + Hemoglobin (血红蛋白) + ODA。438
nm测定(Sun et al., 2005)。
(4) H2O2 + Xylenol orange (二甲基酚橙) + Fe2+
→ Fe3+-Xylenol orange complex。560 nm测定(Gay
et al., 1999)。

3.3.2 化学发光法
H2O2 + Luminol (鲁米诺) + K3Fe(CN)6或H2O2 + Lu-
minal + POD。用发光计或闪烁分光光度计检测发光
数(Warm and Laties, 1982; Bolwell et al., 1998; Dat
et al., 1998)。

3.3.3 荧光法
(1) H2O2 + Homovanillic acid (高香草酸) + POD。315
nm激发, 425 nm检测荧光发射升高的强度(Frahry
and Schopfer, 1998)。
(2) H2O2 + Hydroxyphenyl fluorescein (羟基苯
荧光素) + NADPH。Ex 490 nm、Em 515 nm测定荧
光强度(Dunand et al., 2007)。
(3) H2O2 + Scopolen (7-羟基-6-加氧基香豆素) +
POD。Ex 346 nm、Em 455 nm测定荧光猝灭(Frahry
and Schopfer, 1998)。
(4) H2O2 + Dihydrorhodamine (二氢罗丹明) +
POD。荧光显微镜观察成像或Ex 350 nm、Em 550
nm测定荧光猝灭(Paciolla et al., 2004)。
(5) H2O2 + Dichlorofluorescin diacetate (DCFH)
→ Fluorescent dichlorofluorescin (DCF)。Ex 498
nm、Em 522 nm测定荧光强度(Schopfer et al., 2002;
Bortolami and Cavallini, 2009)。

3.3.4 电化学法
H2O2 + Hemoglobin (血红蛋白) + ODA。电化学法测
定(Sun et al., 2005)。

3.3.5 组织化学定位
H2O2 + DAB (二氨基联苯胺 -四盐酸化物 ) →
H2O2-DAB红棕色的聚合物。显微镜观察组织中产生
红棕色的部位, 用电脑软件分析得定量数据(Thor-
dal-Christertensen et al., 1997)。

3.3.6 细胞化学定位
H2O2 + CeCI3 (氯化铈 ) → Ce(OH2)OOH + Ce
(OH3)OOH (Ce过氧化物)不溶性沉淀。在透射电子显
微镜下观察其在亚细胞器中的分布位点(Bestwick et
al., 1997)。
4 研究展望
活性氧参与植物生长发育的调控机理已成为近10多
年来新的研究热点, 尤以研究.OH和H2O2对根、根毛
的生长及种子发芽的调控作用及NOX和POD胞外产
生ROS的机理较多。然而, 目前人们对细胞表面产生

82 植物学报 47(1) 2012
H2O2的分子机理及NOX活性与SOD功能间的偶联仍
不甚清楚, 尚缺乏SOD在质膜上的定位及其在电子
传递链中作用的资料, 也未有证据证明质外体区隔中
存在NAD(P)H (Glyanko and Ischenko, 2010)。对酶
学调节机制的认识还不够全面, ROS在植物细胞生长
发育中是否还有其它作用等诸多问题, 尚有待进一步
研究。此外, 关于花和果实的生长发育与ROS的关系
尚知之甚少, 目前仅有少量的研究观察到ROS在伸
长的花粉管中大量产生以及ROS可控制成熟果实的
软化。ROS是否也对不同花器官和幼果的生长具调控
作用, 值得关注。近年来我们已对一些花和果实的发
育与ROS的关系做了初步研究, 结果表明ROS参与
调控其生长发育的进程(未发表资料)。
Bailey-Serres和Mittler(2006)认为, 我们已进入
研究植物中ROS信号的关键时期, ROS介导的途径
如何与生长、发育和胁迫响应的信号网络整合, 以及
ROS与Ca信号间如何相互作用 , 均是今后研究的
重点。
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Research Progress in the Control and Regulation of Plant Growth
and Development by Reactive Oxygen Species
Zhifang Lin*, Nan Liu
South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510650, China
Abstract Reactive oxygen species (ROS) are the byproducts of plant aerobic metabolism. ROS are considered to have
double functions (harmful and beneficial) in many plant processes. Oxidative damage to cells and signal transduction in
the induced protection response by ROS have been investigated intensively. ROS are increasingly thought to control plant
growth and development in particular. Cell growth is the important component of plant development, and control of plant
development by ROS is by regulating cell growth, so ROS is an important regulator of plant growth and development.
Here, we review the research progress in the control and regulation of plant growth and development by hydroxyl radicals
and their precursors, superoxide radical and hydrogen peroxide, and the mechanism, the generation pathway of ROS, the
methods for detecting ROS, and prospects for future study.
Key words cell wall loosening, NADPH oxidase, peroxidase, plastic membrane, reactive oxygen species
Lin ZF, Liu N (2012). Research progress in the control and regulation of plant growth and development by reactive oxy-
gen species. Chin Bull Bot 47, 74–86.
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* Author for correspondence. E-mail: linzhif@scbg.ac.cn
(责任编辑: 孙冬花)