全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (11): 1639~1644　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0298 1639
收稿 2014-07-03　　修定 2014-09-28
资助 国家自然科学基金(31260059和30900105)、教育部科学
技术研究重点项目(211190)、甘肃省财政厅高校基本科
研业务费项目、西北师范大学基金项目(NWNU-kjcx-
gc-03-77、NWNU-09-31、NWNU-LKQN-10-32)。
* 通讯作者(E-mail: fenghanq@nwnu.edu.cn; Tel: 13008762166)。
细胞外ATP通过刺激NADPH氧化酶缓解水杨酸诱导的细胞死亡
冯汉青*, 白晶月, 管冬冬, 贾凌云, 孙坤
西北师范大学生命科学学院, 兰州730070
摘要: 水杨酸(SA)是植物重要的信号分子, 低浓度的SA能够诱导植物的抗病反应, 而高浓度的SA导致植物细胞死亡。本文
采用500 μmol·L-1的SA处理烟草悬浮细胞BY-2, 研究了细胞外ATP在SA诱导的细胞死亡中的作用及可能的机制。结果显
示, 外源ATP可缓解SA诱导的细胞死亡水平的上升。另外, SA导致NADPH氧化酶活性下降, 而外源ATP则刺激其活性上
升。外源ATP能缓解SA对NADPH氧化酶活性的抑制, 且这种缓解作用可被NADPH氧化酶的抑制剂——二亚苯基碘(DPI)
所消除。DPI还可部分消除外源ATP对SA所诱导的细胞死亡的缓解作用。上述结果表明, 胞外ATP通过刺激NADPH氧化
酶活性缓解SA诱导的细胞死亡。
关键词: 细胞死亡; 胞外ATP; 水杨酸; NADPH氧化酶
Extracellular ATP Alleviates the Salicylic Acid-Induced Cell Death by Stimulating
NADPH Oxidase
FENG Han-Qing*, BAI Jing-Yue, GUAN Dong-Dong, JIA Ling-Yun, SUN Kun
College of Life Sciences, Northwest Normal University, Lanzhou 730070, China
Abstract: Salicylic acid (SA) is an important signalling molecule for plant cells. At a lower concentration, SA
can induce the resistance responses of plants to bacterial (or viral) pathogens, while at a higher concentration,
SA can cause cell death. By using the tobacco (Nicotiana tabacum cv. Bright Yellow-2) cell suspension culture,
the role of extracellular ATP in the SA-induced cell death and the possible mechanism were studied in the cell
subjected to 500 μmol·L-1 SA. The results revealed that treatment with exogenous ATP partially alleviated the
cell death induced by 500 μmol·L-1 SA. It was found that treatment with SA decreased the activity of NADPH
oxidase, while exogenous ATP increased the activity of NADPH oxidase. Exogenous ATP partially alleviated
the inhibition of NADPH oxidase activity by SA. However, the alleviative effect of exogenous ATP on the SA-
induced inhibition of NADPH oxidase activity was abolished by diphenylene iodonium (DPI), an inhibitor of
NADPH oxidase. And, this inhibitor also partially abolished the alleviative effect of exogenous ATP on the SA-
induced cell death. These results indicate that the extracellular ATP can alleviate the SA-induced cell death by
stimulating NADPH oxidase activity.
Key words: cell death; extracellular ATP; salicylic acid; NADPH oxidase
三磷酸腺苷(ATP)通常存在于细胞内部, 并作
为能量货币分子去支持细胞的各种代谢活动。尽
管ATP是极性分子而无法自由穿过细胞膜, 但近年
来的研究表明, 动物、植物和微生物细胞可以通
过通道蛋白等方式将细胞质中的部分ATP释放到
细胞外基质中, 从而使得细胞外也有ATP存在, 即
胞外ATP (extracellular ATP, eATP) (Khakh和Burn-
stock 2009)。
植物胞外ATP的研究已越来越受到关注和重
视。研究表明, 植物细胞能够通过ATP结合转运载
体蛋白或膜泡运输的方式将细胞内的ATP释放到
胞外 , 使得植物细胞存在一定水平的胞外ATP
(Kim等2006; Thomas等2000)。Choi等(2014)已在
模式植物拟南芥中鉴定出能特异性结合胞外ATP
的受体蛋白。植物的胞外ATP是一种重要的胞外
信号分子, 并通过受体介导的作用来调节植物的
生长、发育、抗病反应和向地性等生理活动
(Tanaka等2010)。此外, 胞外ATP还能够刺激钙离
植物生理学报1640
子通道(Dichmann等2000)、质膜的NADPH氧化酶
(Demidchik等2009)以及茉莉酸和乙烯合成相关基
因的表达(Song等2006)。这些研究表明胞外ATP
可能是通过引起钙离子和活性氧等胞内信号分子
的产生而调节植物的生理学反应。
水杨酸(salicylic acid, SA)是植物最为重要的信
号分子之一, 较低水平的SA能够诱导植物产生对病
毒和病原菌的抗性(Bartsch等2006), 而较高水平的
SA则引发细胞死亡(Alvarez 2000; Brodersen等2005),
这是一些生物性或非生物性因素(如病原菌侵染和
盐胁迫等)诱导植物出现细胞程序性死亡的关键环
节之一(O’Donnell等2001)。关于SA引起上述反应
的机制一直是植物生理学研究的重点和热点。
有趣的是, 最近的研究表明SA和胞外ATP之
间可能存在密切联系。Chivasa等(2009)发现, 外源
施加一定水平的SA能够导致烟草叶片胞外ATP水
平下降; 而增加胞外ATP则导致SA含量降低。此
外, Chivasa等(2009)还发现, 加入胞外ATP能够抑
制SA对烟草抗病反应的诱导作用。然而, 在高水
平的SA导致细胞死亡的过程中, 胞外ATP是否也
能影响该过程中细胞死亡的发生或水平则尚无明
确的报道。
基于此, 我们通过胞外ATP已知的一个作用位
点——NADPH氧化酶, 研究了胞外ATP在SA诱导
的细胞死亡过程中所扮演的生理学角色, 旨在认
识SA和胞外ATP生理学功能的相互关系, 进一步
了解植物细胞死亡的调控机制。
材料与方法
1 烟草悬浮细胞培养
烟草悬浮细胞BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv.
Bright Yellow-2)由香港中文大学姜里文教授馈
赠。将悬浮细胞置于添加了3% (W/V)蔗糖和0.4
mg·L-1 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的MS (Murashige
和Skoog 1962)液体培养基(pH为5.8) (Sigma-Al-
drich)中, 在25 ℃黑暗的条件下振荡培养(振荡速率
为130 r·min-1)。每7 d移取10 mL的细胞培养物, 转
至100 mL新鲜的培养基中进行传代培养。所有操
作都在无菌条件下完成。
2 悬浮细胞的处理
在传代培养5 d后的烟草悬浮细胞中分别加
入: (1) 100、300、500或700 μmol·L-1的SA, (2) 500
μmol·L-1 SA、50 μmol·L-1 ATP-Na2或500 μmol·L
-1
SA+50 μmol·L-1 ATP-Na2, (3) 500 μmol·L
-1 SA、50
μmol·L-1 ATP-Na2、500 μmol·L
-1 NADPH氧化酶的
抑制剂——二亚苯基碘(diphenylene iodonium,
DPI)、500 μmol·L-1 SA+50 μmol·L-1 ATP-Na2或500
μmol·L-1 SA+50 μmol·L-1 ATP-Na2+500 μmol·L
-1, 在
25 ℃黑暗条件下孵育10 h; 以未经任何化学处理的
悬浮细胞液作为对照。
3 细胞死亡水平的检测
荧光素双醋酸酯(fluorescein diacetate, FDA)
可与有活力的细胞结合, 并在被激发后释放出绿
色荧光(Guilbault和Kramer 1964), 用于定性检测细
胞死亡的水平。悬浮细胞液中加入40 mg·L -1的
FDA (Sigma-Aldrich), 在室温下黑暗培养10 min。
将染色后的样品在荧光显微镜下进行观察并成像
(Leica, DM5000 B, Wetzlar, Germany)。
伊文思蓝(Evans blue)可与死亡的细胞结合
(Kawai和Uchimiya 2000), 用于定量检测细胞死亡
的水平。1 mL的悬浮细胞液中加入100 μL 0.25%
(W/V)的伊文思蓝染液, 混匀并染色8 min, 然后在
1 600×g条件下离心3 min, 吸去上清液。用磷酸缓
冲液(PBS)清洗细胞, 再于1 600×g条件下离心3
min, 吸去上清液, 重复多次, 以洗去未与细胞结合
的染料。之后加入1 mL 1% (W/V)的十二烷基磺酸
钠(SDS, 用50%甲醇配制而成)溶液, 在50 ℃的恒
温水浴中放置30 min, 使细胞破裂。在10 000×g条
件下离心3 min, 取500 μL上清液, 加去离子水稀释
至3 mL。用721分光光度计测定600 nm处的吸光
值, 以此表示细胞死亡的程度。
4 NADPH氧化酶活性的测定
NADPH氧化酶(NADPH oxidase, EC1.6.3.1)
活性的测量采用植物NADPH氧化酶活性光度法定
量检测试剂盒(上海杰美基因医药科技有限公司),
具体操作参考产品说明书进行。
5 统计学分析
实验结果均用平均值±标准差表示。数据采用
双总体t检验, 检验在P<0.05水平上的差异显著性。
实验结果
1 SA对细胞死亡的诱导
悬浮细胞中分别加入100、300、500或700
μmol·L-1的SA处理10 h, 结果显示, 在100 μmol·L-1
SA的作用下, 细胞死亡水平略有上升, 但和对照相
比差异不显著; 在300 μmol·L-1 SA作用下, 细胞死
冯汉青等: 细胞外ATP通过刺激NADPH氧化酶缓解水杨酸诱导的细胞死亡 1641
亡水平显著上升; 随着SA浓度的升高, 细胞死亡水
平进一步上升, 但500和700 μmol·L-1 SA处理下的
细胞死亡水平之间无显著性差异(图1)。
2 胞外ATP缓解SA对细胞死亡的诱导
图2显示, 500 μmol·L-1 SA导致细胞死亡水平
显著上升, 单独加入50 μmol·L-1外源ATP未引起细
胞死亡水平的显著变化; 但在500 μmol·L-1 SA处理
的细胞中加入50 μmol·L-1外源ATP则明显降低细
胞死亡水平, 使其接近对照水平。可见, 胞外ATP
能够缓解SA诱导的细胞死亡。
图1 不同浓度SA处理下的细胞死亡水平
Fig.1 The level of cell death under treatment with different SA concentrations
A: 伊文思蓝染色, 结果为6次试验的平均值, 不同字母表示在P<0.05水平差异显著; B: FDA染色。
图2 不同处理下的细胞死亡水平
Fig.2 The level of cell death under different treatments
A: 伊文思蓝染色, 结果为6次试验的平均值, 不同字母表示在P<0.05水平差异显著; B: FDA染色。
3 SA和外源ATP对NADPH氧化酶活性的影响
由图3可见, 500 μmol·L-1的SA导致NADPH氧
化酶活性显著下降, 而50 μmol·L-1的外源ATP则使
得NADPH氧化酶活性显著上升; 在500 μmol·L-1
SA处理下的细胞中加入50 μmol·L-1外源ATP后,
NADPH氧化酶活性显著上升。表明胞外ATP能够
缓解SA对NADPH氧化酶活性的抑制。
4 DPI抑制ATP对SA诱导的细胞死亡的缓解作用
DPI是常用的NADPH氧化酶活性的抑制剂
(Raeymaekers等2003)。本研究用500 μmol·L-1的
DPI处理细胞, 导致NADPH氧化酶活性显著降低
(图3), 表明该浓度的DPI能有效抑制细胞NADPH
植物生理学报1642
氧化酶的活性。在SA和ATP处理的细胞中加入
DPI后, NADPH氧化酶活性显著下降(图3)。这说
明尽管胞外ATP能够缓解SA对NADPH氧化酶活
性的抑制, 但这一作用会因DPI的加入而消除。
单独加入DPI未对细胞死亡水平产生显著影
响, 但在SA和ATP处理的细胞中加入DPI后, 细胞
死亡水平显著上升(图4), 表明细胞外ATP对SA诱
导的细胞死亡的缓解作用会被DPI部分消除。
讨　　论
本文结果显示, 在300 μmol·L-1或更高浓度SA
的处理下, 细胞死亡水平显著上升(图1), 表明高浓
度的SA能够诱发植物细胞的死亡。其他研究也表
明, 较高浓度或较长时间的SA处理能够导致细胞
图3 不同处理下的NADPH氧化酶活性
Fig.3 The activity of NADPH oxidase under
different treatments
结果为6次试验的平均值, 不同字母表示在P<0.05水平上差异显著。
图4 不同处理下的细胞死亡水平
Fig.4 The level of cell death under different treatments
A: 伊文思蓝染色, 结果为6次试验的平均值, 不同字母表示在P<0.05水平差异显著; B: FDA染色。
死亡的发生(Qiao等2003; Broderse等2005)。在植
物和病原物互作过程中, 植物通过积累较高水平
的SA引发或加速被侵染组织的细胞程序化死亡,
从而作为一种防御策略以限制病原的生长和蔓延
(Alvarez 2000; Gust和Nürnberger 2012)。
研究表明, SA通过阻碍线粒体电子传递、干
扰三羧酸循环以及影响NPR转录因子的行为等机
制诱导细胞死亡的发生(Norman等2004; Rüffer等
1995; Gust和Nürnberger 2012)。Chivasa等(2009)发
现, 胞外ATP能够抑制SA对植物抗病反应的诱导
作用。我们也发现, 较高浓度SA (500 μmol·L-1)引
起的细胞死亡水平的上升可以因外源ATP的加入
而明显下降(图2), 表明胞外ATP作为一种胞外分
子, 参与SA对植物细胞死亡诱导的调节作用。由
此提示SA对植物细胞死亡的诱导机制也和胞外基
质有关。
NADPH氧化酶是胞外ATP的重要作用位点
(Demidchik等2009)。Hao等(2012)发现, 胞外ATP
通过增加NADPH氧化酶的活性而提升叶片气孔的
开放程度。本文研究了胞外ATP对SA诱导的细胞
冯汉青等: 细胞外ATP通过刺激NADPH氧化酶缓解水杨酸诱导的细胞死亡 1643
死亡的缓解作用与NADPH氧化酶的关系, 结果表
明, SA抑制NADPH氧化酶的活性, 胞外ATP能够缓
解SA对NADPH氧化酶活性的抑制(图3), 同时也缓
解了SA对细胞死亡的诱导(图2)。采用NADPH氧
化酶的抑制剂DPI, 进一步证明胞外ATP的这种缓
解作用与其刺激NADPH氧化酶活性有关(图4)。
进一步分析表明, 尽管SA能引起细胞死亡和
NADPH氧化酶活性的降低(图1和3), 但DPI在降低
NADPH氧化酶活性的同时, 并没有导致细胞死亡
水平的上升, 而只是部分消除了胞外ATP对SA诱
导的细胞死亡的缓解作用(图3和4)。因此, SA对细
胞死亡的诱导作用可能和NADPH氧化酶活性受到
抑制无关, 而胞外ATP对SA诱导的细胞死亡的缓
解作用则依赖于NADPH氧化酶活性的上升。另
外, Torres等(2005)注意到病原菌侵染对于拟南芥
NADPH氧化酶活性的刺激也能抑制植物细胞死亡
的发生, 提示了NADPH氧化酶的激活可引发一种
干扰细胞死亡发生的生理机制。本研究表明, 胞
外ATP刺激NADPH氧化酶活性, 从而阻碍SA对于
细胞死亡的诱导作用。
基于研究结果, 本文提出胞外ATP和NADPH
氧化酶影响SA诱导细胞死亡的可能机理, 即高浓
度的SA引起细胞死亡, 同时抑制NADPH氧化酶的
活性; 胞外ATP刺激NADPH氧化酶活性, 从而引发
一种机制去干扰SA对细胞死亡反应的诱导(图5)。
但由于SA引起细胞死亡的机制较多, 胞外ATP导
致的NADPH氧化酶活性的增加具体影响哪一种机
制, 尚需进一步研究。
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图5 细胞外ATP、SA和NADPH氧化酶在SA诱导的
细胞死亡中可能的相互关系
Fig.5 A possible model of the interrelationship among
extracellular ATP, SA and NADPH oxidase
in the SA-induced cell death
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