全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2015, 50 (5): 623–627, www.chinbullbotany.com
doi: 10.11983/CBB14174
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收稿日期: 2014-09-22; 接受日期: 2015-03-30
基金项目: 吉林省科学技术厅自然科学基金(No.201115131)
* 通讯作者。E-mail: lcy_lcy2002@163.com
以黄花乌头发根为外植体的再生培养体系建立
刘莉莉, 卢淑波, 徐佳萍, 张庆田, 李昌禹*
中国农业科学院特产研究所, 长春 130112
摘要 为获得黄花乌头(Aconitum coreanum)发根再生植株, 将其发根在添加0.5–5.0 mg·L–1 6-BA及0–0.5 mg·L–1 NAA的
1/2MS固体培养基上进行光诱导培养, 发根经脱分化形成愈伤组织, 然后形成芽及芽丛, 最终获得发根再生植株。结果表
明, 愈伤组织及不定芽分化的最适培养基为1/2MS+2.0 mg·L–1 6-BA+0.2 mg·L–1 NAA+3%蔗糖; 不定芽生根最适培养基为
1/2MS+0.5 mg·L–1 6-BA+0.1 mg·L–1 NAA+5 mg·L–1 GA+3%蔗糖。
关键词 黄花乌头, 发根, 植株再生, 培养体系
刘莉莉, 卢淑波, 徐佳萍, 张庆田, 李昌禹 (2015). 以黄花乌头发根为外植体的再生培养体系建立. 植物学报 50, 623–627.
黄花乌头(Aconitum Coreanum)为毛茛科乌头属
植物, 又称关白附或白附子, 是长白山区道地药材,
以五年生根入药, 主治心痛血痹, 具祛风、止痛、燥
湿和化痰等功效(中国科学院中国植物志编辑委员会,
1979)。其特有成分关附甲素现已被开发为一类新型
抗心律失常药——盐酸关附甲素。目前, 对盐酸关附
甲素的市场需求增长较快, 而野生黄花乌头已属渐危
种, 为国家二类保护植物(Bai et al., 2013)。黄花乌头
生长缓慢, 种子当年只形成子叶, 次年才能形成植
株, 并且其植株个体高, 茎细弱, 抗风害能力极差,
易被风吹折、倒伏, 严重影响其生长发育。黄花乌头
人工生产栽培规模有限, 其根头小且5年后才能采集
入药, 且生长周期长。因此药源短缺的矛盾严重影响
了盐酸关附甲素的生产及应用, 已成为制约其发展的
瓶颈。
李昌禹等(2005)已经建立了以叶片为外植体的
再生苗体系。通过发根农杆菌浸染黄花乌头叶片, 目
前已获得黄花乌头发根A0489, 建立了发根培养体系
(李昌禹等, 2006; Li et al., 2013)。在此基础上又进行
发根诱导再生苗研究, 建立起发根再生苗快繁体系
(李昌禹等, 2012)。本文报道了以黄花乌头发根为外
植体获得再生植株的方法, 旨在为促进黄花乌头种
质创新、获得新品种并提高栽培的经济效益提供参

考, 并为黄花乌头细胞或基因工程改良提供技术支
撑。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验所用外植体材料为黄花乌头 (Aconitum core-
anum (Levl.) Rapaics)发根(图1A)。所用固体基本培
养基为1/2MS (大量元素减半 ), 附加不同浓度的
NAA、IBA、BA及GA。
1.2 实验方法
1.2.1 发根培养
发根培养基为含20 g·L–1蔗糖和0.2 mg·L–1 NAA的B5
培养基, 在(23±2)°C下进行暗培养, 每隔35天继代1
次。

1.2.2 再生苗诱导
愈伤组织诱导及再生苗分化以1/2MS为基本培养基,
加入0–0.5 mg·L–1 NAA及0.5–5 mg·L–1 6-BA, 组成培
养基M1–M20 (表1)。每个处理接种发根30条, 每个三
角瓶接种生长旺盛的发根6条(约1–2 cm), 分别接种
在上述20种固体培养基上, 在光强2 000 µmol·m–2·

·技术方法·
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图1 黄花乌头发根诱导植株再生
(A) 发根; (B) 基部膨大的发根; (C) 愈伤组织; (D) 芽丛; (E)
完整植株; (F) 白化苗; (G) 再生根。Bar=5 mm

Figure 1 Different stages of plantlet regeneration from
Aconitum coreanum hairy roots
(A) Hairy root; (B) Base enlargement hairy roots; (C) Callus;
(D) Buds; (E) A whole plantlet; (F) An albino seedling; (G)
Induced roots. Bar=5 mm

s–1下培养。

1.2.3 再生苗生根
分别用附加0.1–1.5 mg·L–1 IBA、GA、NAA和6-BA
的1/2MS固体培养基对再生苗进行生根诱导。

1.2.4 数据处理
愈伤组织诱导率=(形成愈伤组织的根数/接种的总发
根数)×100%;
不定芽诱导率=(形成的不定芽数/接种的总发根
数)×100%;
发根转绿率=(变绿的发根数 /接种的总发根
数)×100%。
2 结果与讨论
实验结果显示, 在光下诱导培养黄花乌头10天后, 发
根出现膨大现象; 继续培养18天后, 发根膨大(图1B)
数目增加, 个别发根呈现绿色; 膨大的发根在25天时
出现较多黄色和黄绿色的愈伤组织; 35天, 黄绿色愈
伤组织(图1C)明显增多; 42天, 部分黄绿色发根基部
出现绿色的球状突起; 48天, 发根绿色突起逐渐变粗
变绿; 58天, 发根绿色突起发育成原始芽丛, 完成芽
的分化, 将其继代后, 形成了芽丛(图1D), 少量形成
植株(图1E)。
2.1 不同激素配比对发根诱导愈伤组织及不定芽
的影响
发根经脱分化及再分化诱导形成再生苗需50天, 各
处理间存在较大差异。M7、M8、M11、M12、M16、
M17、M19及M20处理组获得了较高的愈伤组织诱导
率; 而M12和M16则获得了较高的不定芽诱导率。
在无NAA处理中, 部分发根转绿, 当6-BA浓度
为1.0 mg·L–1 时, 发根转绿率较高, 但未形成愈伤组
织及芽, 培养材料存活率低, 表明单用细胞分裂素不
适合发根诱导愈伤组织及芽。各浓度的NAA处理中,
含1.0 mg·L–1 6-BA的各组合发根转绿率均高于其它
浓度; 在0.1 mg·L–1 NAA处理中, 随6-BA浓度的升
高, 发根出现芽点数量有所提高, 但诱导成芽较优的
是M16处理(0.2 mg·L–1 NAA+4.0 mg·L–1 6-BA)。
6-BA浓度范围为0.5–4.0 mg·L–1时, NAA浓度为0.2
mg·L–1和0.5 mg·L–1的处理组之间愈伤组织诱导率无
显著差异; 6-BA浓度为5.0 mg·L–1并配以NAA各浓度
处理, 愈伤化明显, 而成芽较少(表1)。
2.2 多次继代对发根诱导再生植株的影响
在诱导愈伤组织及不定芽结束后, 将存活的植物材料
在原培养基上进行继代培养1次。结果表明, 经再次
诱导, 部分培养基中材料白化死亡; 除M8处理外, 其
它材料经原培养基继续诱导, 都有芽点出现, 部分培
养基分化出芽丛。培养50天后, 芽丛分化率介于5%–
30%之间(表2)。M7和M20处理出现了芽丛; 而M11、
M12、M14、M15及M19处理有绿芽点, 经第3次在相
应原培养基上继代培养后也形成了少量的芽丛, 但芽
生长状态不佳, 对后续的扩繁培养也不利, 这些芽生
长不良可能与初始诱导条件不适宜有关。
在第3次继代培养时, 以上述配方为依据, 进行
了适宜培养基的筛选研究。结果表明, 继代后, M7和
刘莉莉等: 以黄花乌头发根为外植体的再生培养体系建立 625

表1 不同激素配比对诱导黄花乌头产生愈伤组织及不定芽的影响
Table 1 Effects of different plant growth regulators on inducing callus and adventitious buds of Aconitum coreanum
Phytohormone
composition (mg·L–1)
No. of
medi-
um NAA 6-BA
Color change of hairy roots Callus
induced
Adventitious buds induced
M1 0 0.5 10% turned green – –
M2 0 1.0 30% turned green – –
M3 0 2.0 10% could see green spots – –
M4 0 4.0 5% could see green spots – –
M5 0 5.0 5% could see green spots – –
M6 0.1 0.5 50% turned green – 3%
M7 0.2 0.5 60% turned yellow-green 20% Few adventitious buds were induced
M8 0.5 0.5 40% turned yellow-green 20% –
M9 0.1 1.0 90% turned yellow-green – 10%
M10 0.2 1.0 40% turned yellow-green, 20% turned green 25% Few adventitious buds were induced
M11 0.5 1.0 50% turned yellow-green 30% Few adventitious buds were induced
M12 0.1 2.0 30% turned yellow-grown 30% 30%
M13 0.2 2.0 40% turned yellow-grown, 20% turned green – –
M14 0.5 2.0 40% turned yellow-green Few callus
were obtained
–
M15 0.1 4.0 30% turned green – –
M16 0.2 4.0 30% turned yellow-green 20% 40%
M17 0.5 4.0 40% turned yellow-green 20% –
M18 0.1 5.0 20% turned green – –
M19 0.2 5.0 50% turned yellow-green, 50% turned green 50% Few adventitious buds were induced
M20 0.5 5.0 50% turned yellow-green 20% 20%
– 无愈伤组织或不定芽形成。
– No callus or adventitious buds were induced.


M8处理绿芽较小, 叶片短小且不能完全展开, 再次
继代后, 也不能形成明显的芽或芽点, 而愈伤组织
形成较多; M12培养基中材料经原培养基继代培养
第3、4次后, 芽丛分化率高, 形成的芽及叶片正常,
多次继代后芽保持状态良好 , 形成较好的再生苗 ,
表明M12培养基较为适合芽的增殖和继代培养 ;
M19与M20培养基中材料在原培养基继代培养后 ,
芽丛不能继续分化形成更多的芽, 长出的叶片细长
且畸形, 多数形成了白化苗(图1F), 不能再次进行
继代培养。
2.3 再生苗生根
利用已形成的芽丛及再生苗进行生根诱导, 生根数最
多为8, 根长为1.0–5.0 cm, 粗0.5–2.0 mm。研究表
明 , 配比为0.5 mg·L–1 6-BA+0.5 mg·L–1 GA+0.1
mg·L–1 NAA的培养基生根效果最好, 较高浓度的IBA
(1.0–1.5 mg·L–1)次之。与IAA和NAA相比, 添加IBA
对再生芽生根效果较好(表3)。
2.4 讨论
从无芽外植体诱导再生苗, 一般多使用幼叶, 且较易
获得再生苗, 用根诱导再生苗较难因而较少使用。本
研究以黄花乌头发根为外植体经脱分化形成愈伤组
织, 并从愈伤组织上形成再生苗, 所用激素种类及配
比与以黄花乌头叶片诱导再生植株(李昌禹等, 2005)
相比差异较大。结果表明, 诱导再生植株与所用外植
体材料有关, 外植体材料不同, 诱导植株再生的最适
激素种类及配比均有差异; 发根诱导形成再生植株的
比率较低, 再生植株矮小, 茎节间短, 根粗壮且有离
地生长的趋势, 这可能与再生植株中含有外来基因
(rol)有关。
6-BA作为一种细胞分裂素, 在一定浓度下能够
促进大多数植物愈伤组织的增殖、分化和再生。本实
验表明, 适宜的生长素与细胞分裂素配比是诱导再生
626 植物学报 50(5) 2015

表2 植物材料在原培养基上继代培养1次后的生长状态
Table 2 Grow phenomena of the materials subcultured at the same inducing medium
Phytohormone composition (mg·L–1) No. of
medium NAA 6-BA
Description of hairy root growing and differentiation status
M6 0.1 0.5 The material turned albino and died
M7 0.2 0.5 30% of the material turned brown, 10% turned green, 30% turned yellow slim
hairy roots, 10% produced cluster buds
M8 0.5 0.5 80% turned yellow slim hairy roots, the base section of hairy roots became
enlargement and 10% base section turned green
M9 0.1 1.0 The material turned albino and died
M10 0.2 1.0 The material turned albino and died
M11 0.5 1.0 30% base section of hairy roots turned green, 20% new produced hairy roots
grew long and thin, others were short and thick
M12 0.1 2.0 30% of the material turned green, 30% kept yellow-green and enlargement
M13 0.2 2.0 The material turned albino and died
M14 0.5 2.0 50% of the material turned green and was going to be buds, hairy roots grew
thick, 40% hairy roots were becoming brown
M15 0.1 4.0 40% of the material turned green and some were going to be buds, hairy roots
were enlargement and strong, 50% were becoming brown
M16 0.2 4.0 The material turned albino and died
M17 0.5 4.0 The material turned albino and died
M18 0.1 5.0 The material turned albino and died
M19 0.2 5.0 40% of the material turned green, 20% kept yellow-green and grew strongly,
20% turned brown
M20 0.5 5.0 50% of the material turned green and grew strongly, 10% became cluster
plantlets, 20% turned brown


表3 黄花乌头再生苗诱导生根适宜培养基
Table 3 Media selection of rooting from regenerated plantlet
in Aconitum coreanum
No. of root Phytohormone composition
(mg·L–1) 0.1 0.5 1.0 1.5
IBA 1 2 6 6
NAA 5 3 1 0
IAA 0 1 3 4
0.5 mg·L–1 6-BA+NAA 4 3 2 1
0.5 mg·L–1 6-BA +0.5 mg·L–1 GA+
NAA
8 3 1 0


苗成功的关键。6-BA对愈伤组织的形成有促进作用,
但单独使用6-BA不能诱导产生愈伤组织和芽; 材料
在6-BA和NAA组合的培养基中培养时产生的愈伤组
织长势较好, 浅绿色居多, 分化出的绿色芽点也较
多, 但随着6-BA浓度的升高, 愈伤组织质地变硬。这
与侯丽丽等(2014)利用烟草(Nicotiana tabacum)毛
状根诱导再生植株的结果相近。
诱导产生的再生植株在未添加外源植物激素的
1/2MS培养基中培养也能部分生根, 但生根数量少,
而添加外源激素的处理生根数目较多, 说明外源植物
激素具有促进生根的作用。再生植株在只含有一定浓
度的NAA培养基中能诱导产生较多的再生根, 这与
前人的多数研究结果相同(冯欢等, 2014; 施和平等,
2014)。培养基中加入少量的GA, 其生根率较未加入
生长素及单独使用生长素的组合高。这可能是GA启
动了未知的生根程序而促进了生根, 有待于进一步研
究证实。经过多次生根继代培养, 再生根数目增多,
根短而粗壮(图1G)。
本文建立了以黄花乌头发根为外植体的植株再
生体系。愈伤组织诱导、芽分化及继代增殖最适培养
基为: 1/2MS+1.0–2.0 mg·L–1 6-BA+0.1 mg·L–1 NAA
+3%蔗糖; 再生植株生根最适培养基为: 1/2MS+0.5
mg·L–1 6-BA+0.1 mg·L–1 NAA+0.5 mg·L–1 GA+3%蔗
糖。
参考文献
冯欢, 易姝利, 谢佳恒, 雷梦琦, 黄萱 (2014). 微型月季愈伤
刘莉莉等: 以黄花乌头发根为外植体的再生培养体系建立 627

组织诱导及植株再生. 植物学报 49, 595–602.
侯丽丽, 施和平, 余武, 曾宝强, 周卓辉 (2014). 烟草毛状根
多倍体诱导及其植株再生. 生物工程学报 30, 581–594.
李昌禹 , 王英平 , 卢淑波 , 张庆田 , 孔祥义 , 徐佳萍 , 艾军
(2012). 黄花乌头转基因苗及其获得方法. 中国专利. 2011-
10317204.4. 2012-06-20.
李昌禹 , 王英平 , 杨福合 , 卢淑波 , 臧埔 , 孔长伟 , 孔祥义
(2006). 黄花乌头发根及其获得方法. 中国专利. 2006100-
89523.3. 2006-12-27.
李昌禹, 王英平, 臧埔, 卢淑波, 宋婷婷 (2005). 黄花乌头叶
片诱导植株再生研究. 特产研究 27(2), 34–36.
施和平, 朱远锋, 王蓓, 孙蒋兵, 黄胜琴 (2014). 香石竹毛状根诱
导、离体培养及其植株再生. 生物工程学报 30, 1742–1750.
中国科学院中国植物志编辑委员会 (1979). 中国植物志(第27
卷). 北京: 科学出版社. pp. 323.
Bai YZ, Li CY, Zhao JH, Zheng PH, Li YL, Pan YQ, Wang
YP (2013). A high yield method of extracting alkaloid from
Aconitum coreanum by pulsed electric field. Chroma-
tographia 76, 635–642.
Li CY, Lu SB, Kong XY, Liu LL, Wang YP (2013). Optimi-
zation of suspension culture conditions for hairy roots of
Aconitum coreanum (Levl.) Raipaics. Agric Biotechnol
2(4), 5–7.

Establishment of Plant Regeneration System from Hairy Roots of
Aconitum coreanum
Lili Liu, Shubo Lu, Jiaping Xu, Qingtian Zhang, Changyu Li*
Institute of Special Animal and Plant Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130112, China
Abstract The hairy roots of Aconitum coreanum were used as explants to induce callus via differentiation in 1/2MS
medium with 0.5–5 mg·L–1 6-BA and 0–0.5 mg·L–1 NAA, then regeneration plantlets were induced from the callus. A whole
transgenetic plantlet was obtained. The optimal medium for inducing callus and adventitious buds was 1/2MS+2.0 mg·L–1
6-BA+0.2 mg·L–1 NAA+3% sugar. The optimal medium for inducing roots was 1/2MS+0.5 mg·L–1 6-BA+0.1 mg·L–1 NAA+5
mg·L–1 GA+3% sugar.
Key words Aconitum coreanum, hairy root, plant regeneration, culture system
Liu LL, Lu SB, Xu JP, Zhang QT, Li CY (2015). Establishment of plant regeneration system from hairy roots of Aconitum
coreanum. Chin Bull Bot 50, 623–627.
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* Author for correspondence. E-mail: lcy_lcy2002@163.com
(责任编辑: 白羽红)