全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2012, 47 (1): 44–54, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2012.00044
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收稿日期: 2011-07-15; 接受日期: 2011-11-29
基金项目: 国家自然科学基金(No.30900106)和转基因生物新品种培育重大专项(No.2009ZX08009-060B)
* 通讯作者。E-mail: weijianhua@baafs.net.cn; deng@ibcas.ac.cn
复苏植物旋蒴苣苔棉子糖合酶基因的克隆和表达
王智1, 2, 刘永秀2, 魏建华1*, 邓馨3*
1北京市农林科学院农业生物技术研究中心, 北京 100097; 2中国科学院植物研究所北京植物园, 北京 100093
3中国科学院植物研究所植物分子生理学重点实验室, 北京 100093
摘要 复苏植物是研究植物耐脱水机制的特殊模式植物和宝贵的耐旱基因资源植物。以复苏植物旋蒴苣苔(Boea hy-
grometrica)为材料研究其在脱水和复水过程中棉子糖系列寡糖含量的变化, 并克隆了旋蒴苣苔棉子糖合酶基因BhRFS。荧
光定量PCR检测表明, BhRFS受干旱、低温(4°C)、高盐(200 mmol·L–1NaCl)和ABA(100 μmol·L–1)诱导表达上调, 而高温
(37°C)抑制其表达, H2O2(200 μmol·L–1)处理对其没有影响。研究结果表明, BhRFS可能参与了多种非生物逆境胁迫抗性反
应, 并受到ABA依赖的信号通路调控。
关键词 旋蒴苣苔, 棉子糖系列寡糖, 棉子糖合酶, 复苏植物
王智, 刘永秀, 魏建华, 邓馨 (2012). 复苏植物旋蒴苣苔棉子糖合酶基因的克隆和表达. 植物学报 47, 44–54.
随着全球变暖, 干旱已成为农业生产和粮食安全
的最严重威胁因素之一, 尤其是近几年特大干旱频繁
发生, 造成农作物大幅减产。在长期进化过程中, 一
些生活在极端干旱环境中的植物获得了较强的抗旱
能力, 为培育抗旱新品种提供了新的思路和育种资
源。例如, 复苏植物可以忍耐极端干旱, 在失去自身
水分95%以上后仍可长时间存活, 恢复水分供应后还
能很快恢复其生命活动(Gaff, 1971)。研究表明, 这类
植物不具备特殊的保水或吸水结构, 而是通过细胞耐
脱水性来保证大分子物质结构在干旱失水时不被破
坏或者受破坏后可被修复(Deng et al., 2003; Liu et
al., 2009)。这种耐脱水性赋予了植物耐受长时间、高
强度干旱的能力, 增加了植物在严重干旱胁迫下的存
活率。然而复苏植物耐旱的分子机制尚不清楚。
棉子糖系列寡糖(raffinose family oligosaccha-
rides, RFOs)是高等植物中普遍存在的一类寡聚糖,
其合成由肌醇半乳糖苷合酶 (galactinol synthase,
GolS)催化合成肌醇半乳糖苷开始 , 由棉子糖合酶
(raffinose synthase, RFS)、水苏糖合酶(stachyose
synthase, STS)催化合成棉子糖、水苏糖等寡糖。以
往的研究表明 , 从低等的藻类到高等被子植物 ,
RFOs的积累都与植物对低温、干旱、氧化伤害和病
菌侵染等非生物和生物胁迫的耐受性密切相关
(Salerno and Pontis, 1989; Ashworth et al., 1993;
Bachmann and Keller, 1994; Nishizawa et al., 2008;
Cho et al., 2010)。RFS是棉子糖代谢途径的关键酶,
催化肌醇半乳糖苷和蔗糖反应合成棉子糖, 也可以催
化肌醇半乳糖苷和棉子糖反应合成水苏糖(李芳和汪
晓峰 , 2008)。Peterbauer等 (2002)从豌豆 (Pisum
sativum)中克隆出编码RFS的cDNA序列 , 使其在
Spodoptera frugiperda的细胞中表达并验证了其催
化活性。Osumi等(2005)从黄瓜(Cucumis sativus)叶
片中分离出编码RFS的cDNA序列, 也验证了其具有
棉子糖合酶催化活性。拟南芥(Arabidopsis thaliana)
基因组中有6个RFS基因, 其中AtRFS2、-4、-5、-6
受氧化和非生物胁迫诱导表达; 但对于它们的功能和
表达调控还缺乏系统的研究(Zuther et al., 2004; Ni-
shizawa et al., 2008; Maruyama et al., 2009)。
旋蒴苣苔(Boea hygrometrica)是分布于我国的
一种复苏植物(resurrection plant), 它在极度脱水的
情况下以一种类似休眠的方式存活, 在水分充足的时
候又能快速地吸收水分恢复生活状态, 继续完成其生
活史(Deng et al., 2003; Jiang et al., 2007)。Wang
等(2009a)从旋蒴苣苔中筛选到42个干旱诱导cDNA
·研究报告·
王智等: 复苏植物旋蒴苣苔棉子糖合酶基因的克隆和表达 45
片段 , 其中BhGolS1编码肌醇半乳糖合酶 , 在烟草
(Nicotiana tabacum)中过表达该基因可以提高转基
因植物的肌醇半乳糖苷和棉子糖含量, 同时大幅度提
高植物耐旱性(Wang et al., 2009b), 表明该途径可能
参与旋蒴苣苔的干旱保护。本文对复苏植物旋蒴苣苔
在脱水和复水过程中RFOs(肌醇半乳糖苷、棉子糖和
水苏糖)的含量变化进行了研究, 并克隆了一个编码
旋蒴苣苔RFS的基因全长cDNA, 分析了其组织特异
性表达及其对环境胁迫的应答, 探讨了棉子糖系列寡
糖积累及该途径关键酶编码基因在植物抗逆反应中
的表达模式, 以期为进一步探讨该途径产物在植物抗
逆反应中的可能作用提供依据。
1 材料与方法
1.1 植物材料
旋蒴苣苔(Boea hygrometrica (Bunge) R. Br.)植株采
自北京植物园樱桃沟。植株于培养室中盆栽土培, 条
件为(25±2)°C, 光周期为16小时/8小时(昼/夜), 光照
强度为137.5 μmol·m–2·s–1, 正常供水。培养2周后,
取离体叶片在人工气候箱(25°C, 相对湿度为50%,
光周期为16小时光照 /8小时黑暗 , 光照强度为125
μmol·m–2·s–1)中脱水处理, 分别在脱水前(d0)、脱水
0.5小时(d0.5h)、2小时(d2h)、8小时(d8h)、24小时
(d24h)、48小时(d48h)和复水8小时(r8h)、48小时
(r48h)取样, 用于提取RNA和糖类。取新鲜植株地下
部分(根部组织)进行RNA提取。离体叶片干旱后的复
水实验在放有湿滤纸的培养皿中进行。
为研究旋蒴苣苔棉子糖合酶基因对激素等信号
分子和其它非生物胁迫的响应, 取旋蒴苣苔叶片分别
浸泡于100 μmol·L–1ABA、200 mmol·L–1NaCl、200
μmol·L–1H2O2溶液、蒸馏水(对照)或在保湿的培养皿
中进行4°C和37°C处理。在处理前(CK)及处理后0.5
小时、8小时和24小时分别取样用于RNA提取。
1.2 BhRFS基因的克隆和序列分析
在旋蒴苣苔干旱处理2小时的cDNA文库中得到一个
长度为506 bp、受干旱诱导的、编码RFS类蛋白C端
序列的cDNA片段(Wang et al., 2009a), 将其命名为
BhRFS。利用5′-RACE技术(Invitrogen, USA)扩增其
全长cDNA序列。以已知序列设计基因特异性引物
BhRFS-race1: 5′-TGACTCCAACTTGAACT-3′ 和
BhRFS-race2: 5′–GCTGCAGCATCATCAAAAGC-
CAA-3′。巢式扩增程序为: 94°C预变性4分钟; 94°C
30秒, 55°C 30秒, 72°C 2分钟, 35个循环; 72°C延伸
10分钟。根据其基因全长的开放读码框, 设计全长引
物: BhRFS-F: 5′-CACCATGGCCCCTAGTTTGAG-
CAAA-3′和BhRFS-R: 5′-CCCAAATAAGTATTCTA-
TCACAGAAG-3′, 从干旱处理 8小时的旋蒴苣苔
cDNA中克隆基因全长并测序。
利用在线软件(http://www.ebi.ac.uk/Tools/ msa/
clustalw2/)对BhRFS和来源于葡萄(Vitis vinifera)、杨
树(Populus trichocarpa)、蓖麻(Ricinus communis)、
黄瓜、豌豆、大豆(Glycine max)、玉米(Zea mays)、
水稻(Oryza sativa var. japonica)、拟南芥等植物的
RFS同源蛋白序列进行比对。利用MEGA4软件, 采用
邻接法(neighbor-joining method)进行系统进化树的
构建。
1.3 BhRFS基因的表达分析
旋蒴苣苔样品采用Trizol法(Transgene)进行总RNA
提取, 用Transcript kit(Qiagen)进行反转录形成单链
cDNA并以其为模板进行扩增。荧光定量PCR采用
SYBR Premix Ex Taq (TAKARA)进行扩增, 荧光定
量 PCR 仪为 MX3000P(Stratagene), 所用引物为
BhRFS-QF: 5′-CGATGCTCAAGATTTGGAACC-3′
和BhRFS-QR: 5′-AATGTTTGGCCGTCTTGTATG-
3′, 扩增cDNA产物长度为202 bp, 跨159 bp长度的
内含子。内参基因用actin2, 引物为actin2-f: 5′-AG-
GAACACCCTGTTCTCCTGACTG-3′, actin2-r: 5′-C-
AGAGAAAGCACAGCCTGGATAG-3′。扩增反应分3
步。第1步: 95°C预变性2分钟; 第2步: 40个循环, 每
个循环94°C变性20秒, 55°C退火20秒, 72°C延伸20
秒; 第3步: 95°C 1分钟, 55°C 30秒, 95°C 30秒。扩
增结果用MX3000P软件分析, 根据其Ct值计算出对
actin2的相对表达量, 用于比较基因在不同处理和不
同组织间的相对表达水平。
1.4 糖类物质含量的测定
收集离体叶片样品0.2 g, 在不同处理后于液氮中保
存。样品于研钵中液氮研磨, 然后用3 mL 50%乙醇提
取, 同时加入内标100 μg(β-苯基葡糖苷)。在80°C水
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浴中加热15分钟 , 再在15 000 × g下离心20分钟
(25°C)。收集上清液, 沉淀用1 mL 50%乙醇再提取一
次, 合并所收集的上清液。取1 mL提取液通过0.2 μm
的滤膜(millipore)过滤, 然后进样10 μL进行高效液相
色谱(HPLC)分析(Agilent 100)。采用标准物质(肌醇
半乳糖苷、棉子糖、水苏糖)的保留时间对样品峰进
行准确定性, 采用内标法以峰面积计算定量(Peters
et al., 2007)。采用半叶法测定旋蒴苣苔叶片干重。收
集取完0.2 g样品的叶片剩余部分(一般为0.2–0.3 g),
立即称重 (测重); 在105°C下杀青15分钟 , 接着在
85°C下烘至恒重 (24小时), 在分析天平上称重(干
重)。计算其叶片干重/测重的比值。根据每个样品对
应的干重/测重比, 确定其干重。
2 结果与讨论
2.1 旋蒴苣苔脱水和复水过程中RFOs的含量变化
干旱导致旋蒴苣苔叶片含水量迅速下降, 在d2h时降
至45%, 在d48h时降至5%以下; 但在恢复供水48小
时内迅速吸水复苏, 含水量可回复至100%(Jiang et
al., 2007)。为了解RFOs在此过程中的作用, 我们从
d0、d2h、d8h、d48h和r48h的旋蒴苣苔叶片中提取
糖类物质并利用HPLC技术测定肌醇半乳糖苷、棉子
糖和水苏糖的含量, 结果如图1所示。肌醇半乳糖苷
和棉子糖的含量变化趋势相同, 均在干旱2小时显著
升高, 随后下降, 保持在接近新鲜时的水平, 复水48
小时后含量又迅速升高; 而水苏糖不同, 其含量在干
旱过程中缓慢升高, 干旱48小时达到最高值, 随着复
水又迅速下降。该结果暗示不同寡糖在旋蒴苣苔脱水
和复水过程中进行了相互转换。
2.2 BhRFS基因的克隆和序列分析
Wang等(2009a)筛选到的42个干旱诱导的旋蒴苣苔
cDNA片段之一U-91编码RFS部分序列。根据该
cDNA片段序列设计引物进行5′-RACE, 获得了长度
为2 282 bp的5′端cDNA序列, 其中含5′-UTR 79 bp、
一个编码793个氨基酸残基的完整的RFS编码区
2 382 bp和3′-UTR 175 bp, 表明获得了BhRFS全长
cDNA (Accession No. JN 642717)。通过BLAST
search和序列同源性分析, 表明该基因为棉子糖合酶
基因。利用DNAMAN软件进行序列分析, 推测其编


图1 旋蒴苣苔脱水和复水过程中棉子糖途径寡糖(RFOs)的含
量变化
数据为2次实验的平均值±标准差; d0、d2h、d8h、d48h和r48h
分别代表脱水前和脱水2小时、8小时、48小时和复水48小时。

Figure 1 Changes of the RFOs content during dehydration
and rehydration of Boea hygrometrica
The data are the means±SD from two independent experi-
ments; d0, d2h, d8h, d48h and r48h indicated leaves
untreated, dehydrated for 2 h, 8 h, 48 h and rehydrated 48 h,
respectively.


码蛋白分子量约为87.0 kDa, 等电点为 5.58。利用全
长引物扩增得到其基因组序列2 933 bp, 其中包含4
个外显子和3个内含子。
棉子糖合酶催化肌醇半乳糖苷和蔗糖形成棉子
糖。利用NCBI网站信息和分别来自葡萄、杨树、蓖
麻、黄瓜、豌豆、大豆、拟南芥、玉米和水稻等植物
的RFS同源氨基酸序列进行比对分析和系统进化树
构建。同源分析表明, RFS蛋白都具有KXD和RXXXD
2个保守催化域, 在BhRFS当中是KVD和RVGDD(图
2)。其中KXD中的天冬氨酸基团(D)可以作为一个亲
核基团与糖基形成一个共价键的糖基-酶中间体, 从
而完成糖基转移反应, 而RXXXD结构域中的天冬氨
酸基团可以作为一个双功能的酸碱催化基团发挥作
用(Hart et al., 2000; Ly et al., 2000; Li et al., 2007)。
从系统进化树(图3)上可以看出, 所比对的RFS同源
王智等: 复苏植物旋蒴苣苔棉子糖合酶基因的克隆和表达 47


图2 BhRFS及其同源蛋白序列(阴影为保守氨基酸序列)
蛋白登录号: 黄瓜CsRFS2 (AAD02832); 豌豆PsRFS (CAD20127); 拟南芥AtRFS5 (BAB11595)。用下划线表示保守催化域KXD
和RXXXD。

Figure 2 Sequence alignment of BhRFS and its homologous proteins from other plants (the identical amino acids labelled in
shadow)
Accession numbers of selected proteins are CsRFS2 (AAD02832) from Cucumis sativus; PsRFS (CAD20127) from Pisum sati-
vum; AtRFS5 (BAB11595) from Arabidopsis thaliana. Conserved catalytic motifs KXD and RXXXD are underlined.


蛋白可以分为3类: a类为双子叶木本和藤本植物; b类
为双子叶草本植物; c类为单子叶禾本植物。BhRFS
位于b类, 在系统进化中与拟南芥的AtRFS5和黄瓜
的CsRFS2关系较近, 同源性分别为79%和82%, 暗
示它们在功能上可能具有相似性。
2.3 BhRFS基因的干旱诱导表达与组织特异性
BhRFS是从脱水2小时上调表达的旋蒴苣苔cDNA文
库中获得的基因。荧光定量PCR研究表明, BhRFS从
脱水2–48小时均被诱导表达, 在脱水2小时表达量就
升高到了最初(d0)的200多倍, 脱水8小时达到最高,
脱水24小时其仍维持较高水平。而复水过程没有检测
到其表达(图4A), 表明BhRFS在旋蒴苣苔耐脱水过程
中受诱导表达。旋蒴苣苔是一种多年生草本植物, 其
叶片为其植株的主要部分(占其株重的大部分), 而根、
茎等组织所占比例较少。研究发现BhRFS主要在叶片
中表达(图4B), 表明它主要参与叶片的耐脱水反应。
2.4 BhRFS基因对高盐、冷害、高温、氧化胁迫
和ABA的响应
以前的研究表明, 棉子糖与植物对多种非生物逆境的
反应密切相关(Salerno and Pontis, 1989; Ashworth
et al., 1993; Bachmann and Keller, 1994; Nishizawa
et al., 2008)。我们检测了BhRFS对高盐、冷害、高
温、氧化胁迫和ABA的响应。结果表明, 高盐胁迫处
理能诱导BhRFS大量转录表达(图5A), 初期(0.5小
时)提高13.4倍, 8小时提高27倍, 达到最大, 随后又
显著下降, 但在24小时仍保持在高于对照处理6.7倍
的水平。低温(4°C)也可以显著诱导BhRFS表达, 与
高盐胁迫相似, 低温处理0.5小时诱导BhRFS转录本
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图3 利用MEGA 4软件和邻接法构建的不同种属植物RFS同源蛋白系统进化树
蛋白登录号 : VnRFS(葡萄 )XP_002275628; PtRFS(杨树 )XP_002328139; RcRFS(蓖麻 )XP_002524657; CsRFS1(黄瓜 )
ABD72603; CsRFS2(黄瓜 )AAD02832; AtRFS5(拟南芥 )BAB11595; PsRFS(豌豆 )CAD20127; GmRFS2(大豆 )ACD13461;
ZmSTS(玉米)NP_001147581; OsRFS(水稻)BAD68247

Figure 3 Phylogenetic tree of BhRFS and homologous proteins from other plants with neighbor-joining method using MEGA 4
software
Accession numbers of selected proteins are VnRFS(Vitis vinifera)XP_002275628; PtRFS(Populus trichocarpa)XP_002328139;
RcRFS(Ricinus communis)XP_002524657; CsRFS1(Cucumis sativus)ABD72603; CsRFS2(Cucumis sativus)AAD02832;
AtRFS5(Arabidopsis thaliana)BAB11595; PsRFS(Pisum sativum)CAD20127; GmRFS2(Glycine max)ACD13461; ZmSTS(Zea
mays)NP_001147581; OsRFS(Oryza sativa var. japonica)BAD68247


水平上升8.2倍, 处理8小时上升39.2倍, 达到最大,
随后也保持在较高的表达水平, 处理24小时仍保持
在高于对照25.9倍的水平(图5B)。与高盐和低温不同,
高温处理明显抑制BhRFS的表达: 初期(0.5小时)就
显著下降为对照的1/8, 在处理8小时和24小时分别
降至对照的1/25和1/14(图5C)。干旱、高盐和低温对
基因的诱导表达调控网络互有交叉, 各有一部分基因
受到ABA的调控。为检测BhRFS的表达是否依赖于
ABA信号通路, 我们检测了BhRFS在ABA处理下的
转录水平变化。结果表明, ABA处理0.5小时就诱导
BhRFS表达量显著增加(为对照的8.8倍), 8小时和24
小时后分别达到对照处理的25.0和21.5倍(图5D)。诱
导表达趋势与BhRFS在干旱、高盐和低温胁迫时相
似, 表明其对胁迫的响应可能至少部分通过ABA依赖
的信号通路调控。
拟南芥的多个AtRFS受氧化胁迫诱导表达(Nis-
hizawa et al., 2008; Maruyama et al., 2009), 但
BhRFS的表达水平仅在H2O2处理0.5小时升高了2倍
多, 随后急剧下降到对照的0.28倍(8小时)和0.08倍
(24小时)(图5E); 而水处理对照诱导BhRFS只在初期
(0.5小时)有1倍多的升高, 随后急剧下降到对照的
0.07倍(8小时)和0.04倍(24小时)(图5F)。表明BhRFS
的表达基本不受H2O2诱导。
2.5 讨论
棉子糖系列寡糖代谢与植物生长发育、种子活力、逆
境胁迫适应等关系密切。研究发现, RFOs的积累及消
失与种子脱水耐性的消长模式相一致, 表明RFOs与
种子脱水耐性密切相关(张以顺等, 2001)。ABA不敏
感的拟南芥突变体(abi3-4, abi3-5)及ABA不敏感和缺
乏的双突变体(abi3-1; abi1)中棉子糖系列寡糖(棉子
糖、水苏糖)含量比较低, 脱水耐性也比野生型差, 表
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图4 旋蒴苣苔BhRFS的干旱诱导表达与组织特异性表达
(A) 脱水和复水过程中BhRFS干旱诱导表达的定量RT-PCR检
测结果(3次重复平均值±标准差, d2h、d8h、d48h和r8h分别代
表脱水2小时、8小时、48小时和复水8小时); (B) BhRFS组织特
异性表达的定量RT-PCR检测结果(3次重复平均值±标准差)

Figure 4 Expression of BhRFS during dehydration and
rehydration, and in different organs of Boea hygrometrica
(A) The relative expression level of BhRFS to actin2 during
dehydration and rehydration by quantitative RT-PCR, which
was performed with total RNAs isolated from leaves at dif-
ferent periods of dehydration and rehydration (The data rep-
resented the means of three replicates±SD, d2h, d8h, d48h
and r8h indicated leaves dehydrated for 2 h, 8 h, 48 h and
rehydrated 8 h, respectively); (B) Relative expression level of
BhRFS to actin2 in different organs by quantitative
RT-PCR(The data represented the means of three repli-
cates±SD)


明这类突变体脱水耐性的丧失与寡糖缺乏有关
(Ooms et al., 1993)。
除了在种子中, 很多植物营养组织在低温、干旱
等胁迫下也都会大量积累RFOs。RFOs在细胞脱水中
能保护膜结构的完整性, 同时也能维持蛋白质的三维
结构 , 防止蛋白质的折叠和变性(Gurusinghe and
Bradford, 2001)。生化研究发现, 棉子糖的构象不随
温度的下降而发生改变, 这一特性赋予了棉子糖在异
常温度变化时具有保护蛋白质和细胞膜等结构稳定
的功能(Lineberger and Steponkus, 1980; Jeffrey
and Huang, 1990)。RFOs还可抑制蔗糖结晶、促进
细胞质玻璃化(Franks et al., 1991), 使细胞质变得黏
稠, 分子运动减少, 防止干旱过程中有害的化学反应
及结构化学位点的改变。这些研究表明, 在胁迫条件
下棉子糖可以从多个方面直接参与对胞内多种成分
的保护。
Taji等(2002)发现拟南芥在高盐(150 mmol·L–1
NaCl)、低温(4°C)、干旱条件下肌醇半乳糖苷的含量
随着胁迫时间的延长而增加; 而复苏植物Boea hy-
groscopica和Xerophyta viscose只在干旱前期大量
积累肌醇半乳糖苷, 随着干旱的持续肌醇半乳糖苷含
量逐渐降低(Albini et al., 1999; Peters et al., 2007)。
旋蒴苣苔在脱水过程中肌醇半乳糖苷含量变化趋势
与复苏植物一致(图1), 但不同于非复苏植物拟南芥。
这表明作为细胞保护性物质, 肌醇半乳糖苷可能参与
了复苏植物脱水初期的耐脱水保护反应的快速启动,
但在非复苏植物中仅在脱水后期缓慢积累, 因此肌醇
半乳糖苷在复苏植物中的快速积累可能是复苏植物
特有的耐旱能力的关键因素之一。在拟南芥和复苏植
物X. viscose中棉子糖随着干旱缓慢积累(Taji et al.,
2002; Peters et al., 2007), 但复苏植物B. hygro-
scopica中棉子糖与水苏糖含量随着脱水过程缓慢下
降(Albini et al., 1999)。在旋蒴苣苔中棉子糖含量在
脱水过程中先升后降, 与肌醇半乳糖苷的动态变化高
度一致, 而水苏糖缓慢积累(图1)。这些差异可能是由
于不同实验条件下脱水速率或测定的时间点不同造
成的, 也可能与物种特异性有关。复水后, B. hy-
groscopica中肌醇半乳糖苷、棉子糖与水苏糖含量均
显著回升; X. viscose中三者均显著下降(Albini et al.,
1999; Peters et al., 2007); 而在旋蒴苣苔中肌醇半
乳糖苷和棉子糖含量显著回升, 水苏糖含量明显下降
(图1)。由此可见, 脱水过程中, 棉子糖和水苏糖在不
同的复苏植物中变化可能存在差异; 复水过程中, 肌
醇半乳糖苷和棉子糖含量的变化在旋蒴苣苔和B.
hygroscopica中表现一致, 但不同于X. viscose。这些
结果暗示了RFOs在复苏植物和非复苏植物中有着不
50 植物学报 47(1) 2012

图5 旋蒴苣苔BhRFS对高盐、冷害、高温、H2O2和ABA的响应(BhRFS的转录表达模式)
(A) 200 mmol·L–1NaCl; (B) 4°C低温; (C) 37°C高温; (D) 100 μmol·L–1ABA; (E) 200 μmol·L–1H2O2处理; (F) 对照(H2O)
结果为3次重复平均值±标准差; 数据均进行了t检验显著性分析; 不同字母代表各处理之间差异显著(P≤0.05)

Figure 5 Expression analysis of BhRFS in response to salt, low temperature, high temperature, oxidation stresses and ABA
treatment
(A) 200 mmol·L–1NaCl; (B) 4°C low temperature; (C) 37°C high temperature; (D) 100 μmol·L–1ABA; (E) 200 μmol·L–1H2O2; (F)
CK(H2O)
The data represented the relative expression level of BhRFS to actin2 as the means of three replicates ±SD by quantitative
RT-PCR; t test was used for statistic significance analysis; bars with different letters denoted a significant difference (P≤ 0.05)


同的消长动态和转换水平, 这可能是由于其关键步骤
催化酶以及多种参与RFOs代谢分解的半乳糖激酶的
不同水平和活性造成的(Gao and Schaffer, 1999;
Carmi et al., 2003), 而不同的复苏植物由于分布生
王智等: 复苏植物旋蒴苣苔棉子糖合酶基因的克隆和表达 51
态性和进化关系上的差异其RFOs的积累动态也不完
全一致。肌醇半乳糖苷作为RFOs代谢途径的糖原供
体, 在复苏植物耐脱水性中除了直接对细胞起保护作
用外, 可能还具有启动植物应激反应的关键性阀门作
用。
在RFOs代谢途径中, GolS、RFS、STS都是其
代谢途径的关键酶。我们前期的研究已证明BhGolS1
在旋蒴苣苔中受干旱诱导表达, 在其过表达转基因植
物中可以提高肌醇半乳糖和棉子糖的含量, 进而提高
植物耐旱性, 表明其在植物耐旱性中发挥着重要作用
(Wang et al., 2009b)。关于RFS基因的研究报道较少,
现在虽已从豌豆、黄瓜等植物中分离出编码RFS的
cDNA序列并进行了生化活性验证(Peterbauer et al.,
2002; Osumi et al., 2005), 但仍缺乏关于其表达和
功能的系统研究。拟南芥中有6个RFS编码基因, 但
有关系统的功能分析尚未见报道。我们从旋蒴苣苔中
克隆了编码棉子糖合酶的基因BhRFS, 序列分析发
现其编码产物与拟南芥AtRFS5同源性较高 , 达到
80%(图2), 推测它们可能在系统进化关系上较近, 功
能上有一定的相似性。在RFS蛋白中具有催化能力的
2个保守的天冬氨酸基团催化域, 其在BhRFS中分别
是KVD和RVGDD(图2), 保守性较高, 暗示BhRFS在
催化功能上与其它RFS一样具有糖基转移的酶蛋白
活性(Li et al., 2007)。
复苏植物旋蒴苣苔具有耐干旱脱水的性状 ,
BhRFS受干旱胁迫诱导表达, 而且从干旱初期(d2h)
开始表达, 在干旱处理8小时达到最高, 之后始终维
持在较高的水平, 直至复水后才下降(图4A)。表明其
可能参与旋蒴苣苔的脱水保护过程, 但不参与旋蒴苣
苔的复水修复过程。BhRFS这种脱水快速诱导表达的
方式与BhGolS1一样, 也和其产物肌醇半乳糖苷和棉
子糖脱水诱导快速积累的方式一致, 但不同于拟南芥
中干旱诱导肌醇半乳糖苷和棉子糖进行的缓慢积累。
说明复苏植物和脱水敏感植物在耐脱水过程中RFOs
积累的不同水平很可能是由于其相关基因(如GolS、
RFS等)具有不同的调控表达机制所致。旋蒴苣苔中
棉子糖含量在干旱2小时即达到高峰, 早于BhRFS转
录本的干旱8小时达到最高, 这与肌醇半乳糖苷及其
催化酶基因 BhGolS1 的动态相似 (Wang et al.,
2009b)。我们推测有如下几种可能: (1) GolS和RFS
蛋白及其酶活性可能受到翻译和翻译后水平的调控,
脱水后期GolS和RFS转录本虽然增加, 但酶活降低,
故而肌醇半乳糖苷和棉子糖的积累减少; (2) 棉子糖
合酶在一定条件下也具有催化肌醇半乳糖苷和棉子
糖形成水苏糖的能力(李芳和汪晓峰, 2008), 棉子糖
合酶和水苏糖合酶的作用使脱水后期水苏糖大量合
成而导致肌醇半乳糖苷和棉子糖的消耗; (3) 一些低
分子量的RFOs也可以由半乳糖激酶水解更高的同系
物产生, 这些因素最终导致棉子糖的积累与GolS及
RFS基因的表达之间变化并不完全一致。但其具体机
制还需要深入研究。
关于GolS基因的表达调控已经积累了一些数据,
很多研究都证明不同来源的GolS基因虽然在抗旱等
逆境胁迫上具有相似的功能, 但其表达和调控方式有
很大的区别。如拟南芥中的GolS3在低温胁迫中受
DREB1A的调控表达 , GolS、GolS2受热激因子
HsfA1a、HsfA1b和HsfA2的调控, 而热激因子HsfA2
还调控GolS4的表达。在复苏植物旋蒴苣苔中我们则
发现BhGolS1在脱水胁迫中受WRKY转录因子和A9
类热激因子BhHSF1的调控(Taji et al., 2002; Zuther
et al., 2004; Nishizawa et al., 2008; Wang et al.,
2009b; Zhu et al., 2009)。因此, 作为BhGolS1同一
代谢途径下游的关键酶编码基因, BhRFS很有可能也
受到多种胁迫响应信号和转录因子的调控。我们研究
发现, BhRFS受高盐胁迫(200 mmol·L–1NaCl)和低温
(4°C)诱导表达(图5A, B), 证明BhRFS参与了植物的
耐旱、耐冷和耐盐胁迫反应。拟南芥基因组中的6个
RFS基因中只有AtRFS2、-5、-6受低温胁迫诱导表达;
其中AtRFS2、-5还受干旱诱导表达(Zuther et al.,
2004; Maruyama et al., 2009)。表明RFS在参与植物
的干旱、低温等耐受性调控中具有一定的保守性, 但
也有差异。关于RFOs途径参与植物耐高温胁迫的研
究报道很少, 我们发现高温处理导致BhRFS表达下
降(图5C), 表明它可能不参与高温胁迫的耐受反应。
ABA作为一种广泛的激素信号, 很多研究都表明其参
与了植物抗旱、抗盐等多种抗逆反应(Ramanjulu and
Bartels, 2002; Deng et al., 2006)。我们也发现
BhRFS在ABA处理时被大量诱导表达, 而且其变化
模式与在低温、高盐等胁迫下诱导表达方式相似(图
5D), 表明它可能是ABA依赖的信号通路的靶基因,
参与ABA信号介导的多种抗逆反应。拟南芥中
AtRFS2、-4、-5、-6均受氧化胁迫诱导表达。H2O2
52 植物学报 47(1) 2012
可作为一种氧化胁迫剂和信号分子参与多种逆境胁
迫反应, 因此我们研究了H2O2对BhRFS表达的影响。
结果表明, BhRFS在H2O2处理下的表达与对照处理
相似(图5E, F), 只在初期有一个较弱的上调表达。表
明BhRFS与拟南芥中的同源基因在感受氧化胁迫方
面存在差异, 也意味着虽然BhRFS在蛋白序列和功
能上与AtRFS5有较高保守性, 但表达调控机制有所
不同。
综上所述, RFOs作为一类作用广泛的寡糖物质,
在植物抗逆性中的作用正被逐步发现和证明, 其作用
机制也正被不断揭示(Zuther et al., 2004; Peters et
al., 2007; Nishizawa et al., 2008; Wang et al.,
2009b)。但耐脱水植物(如复苏植物)和脱水敏感植物
(如拟南芥)在脱水过程中RFOs含量变化及相关基因
表达存在差异(Taji et al., 2002; Wang et al., 2009b),
暗示着复苏植物特有的耐脱水干旱能力可能与RFOs
在干旱等胁迫下的消长及相关基因的表达调控密切
相关。
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54 植物学报 47(1) 2012
Cloning and Expression of a Gene Encoding a Raffinose Synthase
in the Resurrection Plant Boea hygrometrica
Zhi Wang1, 2, Yongxiu Liu2, Jianhua Wei1*, Xin Deng3*
1Beijing Agro-Biotechnology Research Center, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Science, Beijing 100097, China
2Beijing Botanical Garden, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China; 3Key Laboratory of
Plant Molecular Physiology, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China
Abstract Resurrection plants are a valuable resource for understanding the mechanisms of dehydration tolerance and
for mining candidate genes that can be used to improve drought tolerance in crops. Here, we determined the contents of
galactinol, raffinose and stachyose in dehydrated and rehydrated leaves of a resurrection plant Boea hygrometrica. We
cloned a dehydration-inducible gene encoding a raffinose synthase from B. hygrometrica and found that BhRFS was
upregulated by cold (4°C), high salt (200 mmol·L–1NaCl), and abscisic acid (ABA, 100 μmol·L–1) but downregulated by
high temperature (37°C) and not affected by H2O2 (200 μmol·L–1). BhRFS may function in responce to various abiotic
stresses, possibly regulated by ABA-dependent signal pathways, therefore it is a good candidate gene for plant breeding
to enhance plant stress tolerance.
Key words Boea hygrometrica, raffinose family oligosaccharides, raffinose synthase, resurrection plant
Wang Z, Liu YX, Wei JH, Deng X (2012). Cloning and expression of a gene encoding a raffinose synthase in the resur-
rection plant Boea hygrometrica. Chin Bull Bot 47, 44–54.
———————————————
* Authors for correspondence. E-mail: weijianhua@baafs.net.cn; deng@ibcas.ac.cn
(责任编辑: 白羽红)