全 文 ：科 考 五 叙 第 4 5 卷 第 1 5 期 2 0 0 0年 a 月 简 手及
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1 0
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1 2
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18 : 85 0 一 8 5 3
( 20 0 0
一。一0 6 收稿 , 2 0 0 0 一 0 4一 0 3 收修改稿 )
耐旱植物厚叶旋葫首苔 刀刀N1 脱水素基因的克隆
及表达特性分析
赵恢武① 刘 晗① 于海源① 胡鸯雷① 高 音① 李振宇② 林忠平① `
(①北京大学蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室 , 北京 10 0 8 71 ; ②中国科学院植物研究所 , 北京 l 《x x〕9 3 . * 联系人 ,
E m ia l : l in z P@ l s e
.
P k u乃 d u e n )
摘要 根据 已知植物脱水素基 因的保守区域设计引物 , 采用 R T 一 P C R 方法从耐旱植物厚叶旋葫首
苔的总 c D N A 中扩增出一个 5 0 0 b p 的与植物脱水素基因同源的序列 . 结合 5 ` R A c E获得 了植物脱
水素基 因家族一个新成员 B DNI 的全长 c D N A ( 1 148 b )P . S o u ht e m 杂交分析表 明, B D N I 基 因在厚
叶旋葫首苔基因组中以单拷贝形式存在 . N o rt he m 杂交结果表 明 , 该基因的表达受干旱 、 寒冷及
A B A 的诱导 . 推测该基因与厚叶旋葫首苔的耐旱特性有关 .
关键词 耐旱植物 厚叶旋茹昔苔 脱水素基因 5’ R A C E B D N I
近年来复苏植物成为研究高等植物耐旱机制的热点 . 复苏植物的一个显著特点是它们在
组织 、 器官水平就显示 出对干旱 、 寒冷等缺水胁迫的耐受 . 这一特点有利于排除发育因素对研
究植物耐旱机制的干扰 I ’〕 . 我 国学者曾发现了几种中国特有的类似于复苏植物的物种 l2] , 这些
植物在失水 80 % 一 90 % 以后遇水时仍能存活 . 我们以其中的一种植物厚叶旋茹芭苔作为研究对
象 , 探讨此类植物耐旱的分子机制 . 厚叶旋茹芭苔的保水能力很强 , 其幼苗带少量培养基或少
许附在根际的蛙石一类基质 , 在相对湿度 50 % 的情况下 , 放置 l d 才开始表现萎蔫 , 此时大约
164 8
简 宁及 第 4 5 卷 第 , 5期 2 0 0。 年 8 月 科 考 五 叙
失水 70 % , 给水后可逐渐恢复生长 . 苗龄大的可耐受更长时间的干旱 .
nI gr a m 等人 [ ’ ]发现在复苏植物的叶子中存在着通常见于种子发育早期的脱水蛋白 , 又称
脱水素 (d he y dr in ) . 脱水素是一种广泛存在于高等植物的干早诱导蛋白3[] . 它含有一个或数个
由 1 5个氨基酸组成的富含赖氨酸的保守 区 , 即 E K K GI M D KI K E K L P G[ 41 . 这类蛋白具有很强的
亲水性和热稳定性 . 本研究的 目的在于从复苏植物厚叶旋茹芭苔 (B oe a c ar s lfo ial H e m sl) 中克
隆脱水素类似蛋白的基因 , 探讨它的表达模式以作为进一步研究植物耐早分子机制的基础 .
1 材料与方法
( i) 化学制剂和酶制剂 . T RI oz l 试剂购 自 M BI 公司 ; aT q D N A 聚合酶购 自 s an g on 公司 ;
逆转录酶 、 5 ` R A C E 试剂盒购 自 o ib e o 一 B R L 公司 ; D l e D N ^ L a b e l i n g a n d D e t e e ti o n K i t 试剂盒
购 自 R oc he 公司 ; 内切酶试剂 、 pG EM 一 T aE sy 载体购 自 rP o m eg a 公司 . 玻璃奶 D N A 回收试剂
盒购自原平皓公司 . e h a r g e m o d i if e d n y l o n m e m b r a n e 购 自 s i g m a 公司 .
( il ) 材料 . 厚叶旋茹昔苔从广西野外采集 . 该植物除菌后培养在 M S培养基上 , 长成 5荀
叶的幼苗后 , 取出进行干旱诱导 . 在室温下干燥的环境中放置 24 h , 失水 35 % , 用于 RN A 的分
离 .
( in ) 引物 . 由上海 s an g on 公司和 中国科学院微生物研究所合成 . 用于 RT 一 P c R 反应的上
游引物为 : (4 3 2 17 ) 5 ’ T G G 认C C o G A ( A /G ) A A ( G /C )A T ( T zC /A ) A A (G / C )G A ( ^ / o )A A 3 , , 下
游引物为 : ( 4 3 2 18 ) 5 ` G C G G C C G C T ( 1 8 ) 3 ’ . 用于 5 ’ RA e E 的上游引物为 : (4 6 12 1 ) 5 ’ e o e e e G -
A C G T C G C AT G 3
` 和 (4 6 12 2 ) 5 ’ G G C C C G A C G T C G C袱 G A A T T C ( 1 2 ) 3 ` : 下游引物为 :
(4 3 5 1 3 ) 5
’
T T G G A I , T C T C A G T G G C A I
,
G C 3
’ ,
(4 3 5 1 4 ) 5
`
T A C A C T T C C T C G G T C T T C
-
T T G 3
` 和 (k 1 4 9 4 ) 5 ` C G T A C T T C T C A A C T G GAT C A G 3 ` : 克隆 刀D N I 基因编码区的上游
引物为 : ( k l 4 9 5 ) 5 ` T T C AT G G C C G AT
r
r A C C A A C AT C
A C 3
’
; 下游引物为 : (4 3 5 1 3 ) 5 ` T T G -
G 户1L , T C T C A G T G G C A I , G C 3 ’ .
( iv ) RT
一
PC R 反应 . 采用 T IR oz l 试剂从干旱胁迫处理后的厚叶旋茹芭苔的叶片提取总
R N A
, 加 D N as e l 消化去除残存的 D N A , 用引物 4犯 18 逆转录合成 c D N A 第 1链 . 样品经 94 ℃
预变性 5 m i n , 用引物 4 3 2 17 和 4 3 2 1 8 , 9 4 ℃ , 3 0 5 , 5 3 ℃ , 3 0 5 , 7 2℃ , 2 0 5 , 3 0 个循环 , 7 2 ℃延伸 10
m i n 作 PC R 反应 .
( v ) 5
’
R A C E 反应 . 总 。 D N A 参照文献 [5 ]用引物 4 3 2 1 8 , 4 6 12 1 , 4 6 12 2 , 4 3 5 13 和 4 3 5 14 完
成第 l 次 5 ’ R A C E 反应 ; 由于得到的 。 D N A 不完整 , 用引物 4 3 5 1 3 , 4 3 5 14 , k l 4 9 4 以及 5 , R A C E
试剂盒自身所带的引物 A A P 和 A U A P, 按照 5 , R A C E 试剂盒说明进行第 2 次 5 , R A C E 反应 . 所
用 引物在 目标基因上的位置如图 1 所示 .
A A P A U A P
- - - 一卜
- 一
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-
-
.
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Po ly G
图 1
k l 4 9 4 4 3 5 14 4 3 5 13
P o ly A
峭一一一 -
-
目一4 3 2 1 8
克隆厚叶旋茹芭苔脱水素类似基因时所用引物的相对位置
( vi ) B D NI 基因编码区的克隆 . 采用引物 k 14 95 和 4 3 5 13 , 用 RT 一 P C R 方法从干旱胁迫处
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科 考 五 叙 第 5 4卷 第 15 期 20 0 0 年8 月 简 手及
理的厚叶旋茹芭苔叶片中提取的总 RN A克隆 BD NI 基因的编码区 , P C R 反应条件为 : 94 ℃预变
性 5 m i n , 9 4℃ , 3 0 5 , 5 5℃ , 3 0 : , 7 2 ℃ , 2 0 5 , 3 0 个循环 ; 7 2 ℃延伸 1 0 m i n .
(v山 目的片段的克隆及序列测定 . 将经过玻璃奶回收的 P C R 片段与 rP o m eg a 公司的
p G EM
一
T aE sy 载体连接后转化大肠杆菌 D H 5 a 菌株 , 序列测定 由中国科学院微生物研究所用
自动测序仪完成 .
(恤 ) s o u ht e r n 杂交 . 用 E c o R I , 刀a m H I 和 万i n d l 分别酶切 10 林g 用 SD S 法提取的厚叶
旋茹芭苔的总 D N A . 以 D IG 标记的 B DNI 基因的编码区为探针 , 按照 DI G D N A aL be iln g an d
D e t e e ti o n K i t 试剂盒说明进行 S o u th e r n 杂交 .
i( x) N or ht er
n 杂交 . 采用 T RI oz l 试剂分别提取水饱和 、 干旱胁迫 (完整的厚叶旋茹芭苔植
株置于敞口 的锥形瓶中放 12 h , 处理后的植株质量为处理前的 70 % ) 、 冷胁迫 (厚叶旋茹芭苔在
4 ℃生长 24 h) 和 A B A 处理 ( 10 林m ol 几 的 A B A 溶液在 1Z h 内喷洒厚叶旋茹芭苔 4 次 )后的厚叶
旋茹芭苔的叶片总 RN A . 各取 10 此 R N A 用 甲醛变性胶电泳分离后转至 S ig m a 公司的 hc a gr e
m o d i if e d n y l o n m e m b r a n e 上 . 以 D I G 标记的 B D N I 基因的编码区双链 D N A 为探针 , 按照 D IG
D N A L a b e l i n g a n d D e t e e ti o n K i t 试剂盒说明进行 N o r t h e r n 杂交 .
2 结果与讨论
2
.
1 厚叶旋茹苍苔脱水素类似基因 c D N A 部分片段的分离 、 克隆和测序
逆转录经过干旱胁迫处理的厚叶旋葫芭苔总 R N A 合成 c D N A 第 1链 . 用按照已知脱水素
基因一个富含赖氨酸的保守区设计的一条简并引物和一条接有 L个 No lt 酶切位点的 Ol i g o( d )T
引物进行 P C R 扩增 . 得到两条特异带 , 一条长度约 50 bP , 另一条长度约 20 bP .
将这两个片段分别克隆到 p G E M 一 T E as y 载体中 , 得到的两种重组质粒进行测序 . 测序结
果表明 , 所克隆的 Zo bP 片段在 EM B L 数据库中找不到具有显著同源性的基因 (序列略 ) . s o bP
的片段与 E M B L 数据库中欧洲草墓 (F ar g ar ia ve sc a) 一个与成熟有关的基因的同源分数达到
70 %
, 把它记为 B D N I . 它包含有 3 个可能的聚腺昔酸加尾信号和 1个 21 3 bP 的可读框 . 在这
个可读框编码的氨基酸序列 中有两个脱水素蛋白的富含赖氨酸的保守区 (图 2) .
G G I人 C C门 G 六G A A G A I C ^ A C G A G A A G C I诱 C C C G G C O G C A A G A A G A C C G A G G八 A G T G T A C G C A C C G C C G C C A C C G A A G A G G
图 2 厚叶旋茹芭苔脱水素类似基因 B D N I 的 c D N A 3 ’ 端
序列两端由下划线标记的两个序列中 , 前一个是与所用引物相对应的序列 , 后一个是与所用引物互补的序列 .
由黑体标记的 3 个序列是可能的加聚腺普信号 16 . 由方框标记的 3 个核昔酸是可读框的终止子
2 .2 B D NI 基因 c D N A S ` 端的克隆 、 测序和分析
根据所获得的 B D N I 基因 c D N A 的 3 ’ 端部分序列 , 参照文献【5] 设计克隆 B D NI 基因 c D N A
的 5 , 端引物 4 6 1 2 1 , 4 6 12 2 , 4 3 5 1 3 和 4 3 5 14 . 用引物 4 3 5 13 和 4 6 1 2 1做第 l 次 PC R 反应 , 得到
16 50
简 手及 第 4 5 卷 第 1 5 期 2 0 0 0 年 a 月 拼 考 近 叙
一个约 4 0 0 b p的片段 ; 10 0 倍稀释第 l次 Pe R反应的产物 , 用引物 4 3 5 一4 和 4 6一2 2做 n e s t e d 一 P e R
反应 , 得到一个约 20 bP 的特异片段 . 克隆 2 0 帅 的片段 , 测序表明它是刀D N Z基因。 D N A S , 端
的部分序列 (图 3) .
C (奋{ ; CCC (; AC( }1’C (导C A` l’ ( ;AAI 「C C C C C C C C C C C犷A A A A A A A A A A A A A A A A A A G C G G C C G C A A A G A A G A A 6 A A A A A G A A G GG T T TA
. … … 嗯 . . . . . . . . . . . . . . . … …
C C GG C GG C A A G A A G A C C G A G G A A G T G丁八 粉
图 3 厚叶旋茹苗苔脱水素类似基因 B D N I 的 c D N A S ’ 端的部分序列
下划实线箭头示 4 61 21 引物片段 , 下划圆点示 4 3 2 18 引物片段 , 下划双线示引物 4 3 5 14 的互补片段 , 下划虚线
箭头和下划双线为与 2 . 1 中所得 B D N I 基因 c D N A 3 ’ 端 69 bP 的重叠序列
该序列不含起始密码子 AT G , 并且含有 4犯 18 引物片段序列 , 推测它是 B D N I 基因 c D N A
5
’ 端的部分序列 . 可能在用玻璃奶纯化总 c D N A 时 , 4 3 2 18 引物清除不干净 , p ol y G 是加在
43 2 18 引物上的 , 通过 P C R 非特异扩增反应从 B D N I 基因 c D N A 中扩增出以上片段 .
为了得到 B D N I 基因 c D N A 完整的 5 , 端序列 , 采用 5 , R A C E 试剂盒进行克隆 . 用 4 3 5 14
和 A A P 做 ne st de 一 P c R 反应得到多条带 ; 经多次改变 P c R 条件仍无特异条带 , 因此根据所获得
的 刀D N I 基因 。 D N A S ` 端的部分序列设计了引物 k l 4 9 4 . 用引物 k l 4 9 4 和 A U A P 做 n e s t e d 一 P C R
反应得到了一条特异条带 . 将该条带克隆到 p G EM T 一 ea sy 载体 , 测得阳性克隆的序列如 图 4
所示 .
该序列 的第 1个 AT G 距离该片段的 5 ’ 端为 1 14 bP , 周围的序列基本符合植物基因起始密
码子 的特点 [6 ]’ , 即 夕 N N N N A N A zu N u zA A N N N N A N N A u o G e u 3 , , 并且综合所得到的全部序
列 , 将它作为起始密码子恰好是最大的可读框 . 推断我们得到了厚叶旋茹芭苔的一个脱水素
基因家族的新成员 B DNI 基因的全长 c D N A , 登录 G en B a nk , 获得序列号 A 1F 9 0 4 7 .4
已〕C C A C G〔 G T C G A C 户 I认 G I A C G G G GG G G GG G G GG G A 】T C G A A人T C A A A G C T I. C C A C T T T I ,A C A G C G A C T C A GC A C T G A I , C T C
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图 4 厚叶旋茹芭苔脱水素类似基因 B D N I c D N A 完整的 5 ’端序列
下划箭头示引物 A u A P, 下划双线示引物 kl 4 94 , 下划虚线和下划双线为与前述 B D N I 基因 c D N A S ’ 端部分
序列 108 bP 的重叠片段
.2 3 厚叶旋荫苍苔脱水素类似基因
厚叶旋葫芭苔脱水素类似基因
B D N I
B D N I
的 c D N A 结构分析
的全长 。 D N A 及其编码的氨基酸序列见图 5 . 该
B D N I 基因的 c D N A 全长为 1 14 8 bP , 包含一个 7 53 帅 的可读框 , 编码 2 51 个氨基酸 . 它的 5 ’
16 5 1
科 考 五 叙 第 45 卷 第 15 期 2 0 0 0年 a 月 简 乡及
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5 7
1 14
2 0 4
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5 3 4
1 5 0
6 5 4
1 8 0
7 4 4
2 1 0
8 3 4
2 4 0
9 24
2 5 1
10 14
1 10 4
1 14 8
图 5 B D N I 基因的全长 c D N A 及其编码的氨基酸序列
黑体标记的是 3 个可能的 oP ly A 加尾 , 方框标记的是富含 s er 区 , 下划线标记的是两个富含 yL s 区
端非翻译区长为 一14 b p , 3 ’ 端非翻译区长为 2 8 1 b p . 3 ` 端非翻译区有 3 个可能的加 p o l y A 信号 :
AT
TAT
,
A A T A A
,
AT AT A A
.
B D N I 基因编码的 25 1个氨基酸序列具有脱水素类蛋白明显的特征 :
一个富含 s er 区和两个富含 yL s 区 14] . 用蛋白质序列分析软件分析 B D N I 蛋白的结构可知 , 它
容易形成 a 一螺旋的二级结构 , 具有很强的亲水性 .
检索 EM B L 蛋白质数据可知 , 由 B D N I 基因的 c D N A 推导的蛋白质序列与拟南芥中一个
受低温 、 干早等水分亏缺逆境诱导的蛋白 LT I 45 7[] 有较大的同源性 , 同源分数达到 52 % .
.2 4 B D NI 基因编码区的克隆
根据所得的 B D N I 基因的全长 c D N A 设计引物 k l 4 9 5 , 用引物 k l 4 9 5和 4 3 5 13通过 RT 一P C R
从干早胁迫处理厚叶旋茹芭苔提取的总 R N A 中克隆到 B D NI 基因编码区 . 它长约 7 0 bP , 与
预期 的大小相符 . 以厚叶旋茹首苔的总 D N A 为模板 , 用引物 k1 4 95 和 4 3 5 13 扩增 召刀刀了基因
时所得到的一条特异片段的大小与 B D N I 基因编码区相 同 . 它们的测序结果一致 . 故推测该基
因不含内含子 .
2
.
5 B刀N 了基因的 S o u t h e r n 杂交分析
用 cE 口R l , iH dn l 和 B a m H I 分别酶切厚叶旋茹首苔的总 D N A , 以 B D N I 基因编码区为
探针 , 按照试剂盒说明进行 S ou ht e m 杂交分析 , 得到如图 6 所示的图谱 . 可见用 cE o R I , B a m H I
16 52

拼 考立 叙 第 4 5 卷 第 15 期 20 0 0 年 a 月 简 手及
2
3
4
5
6
7
8
9
l 0
l 1
胡莺雷 , 林忠平 . 还魂草与耐早基因工程 . 植物杂志 , 1 9 9 8 , 5 : 45
C l o s e T J
.
D e h y d r i n s : e m e r g e n e e o f a b i o c h e m i e a l r o l e o f a f a m i l y o f P l a n t d e h y d r a ti o n P r o t e i n s
.
P h y s i o l P l a n t
,
19 9 6
,
9 7 :
7 9 5 ~ 80 3
C l o s e T J
.
D e h y d r i n s : a e o m m o n a l t y i n th e r e s P o n s e o f P l a n t s t o d e h y d r a t i o n a n d l o w t e m P e r a t u r e
.
P h y s io l P l a n t
, 19 9 7
,
10 0 :
2 9 ] ~ 2 9 6
K im u r a Y, N a k a z a w a M
,
T s u e h i y a N
,
e t a l
.
G e n Q m i e o r g a n i z a t i o n o f th e 0 5
一夕 g e n e a n 1 P l i if e d i n h u m a n s a r e o m a s . J
B i o e h e m
,
1 9 9 7
,
12 2 : 1 19 0 ~ 1 19 5
H e i d e e k e r G
,
M e s s i n g J
.
S t r u e t u r a l a n a l y s i s o f P l a n t g e n e s
.
A n n u R e v P l a n t P h y s i o l
,
19 8 6
,
3 7 : 4 3 9 ~ 4 6 6
K iy o s u e T
,
K a z u k o Y S
,
K a z u o S
,
S h i n o z a k i K
.
C h a r a e t e r i z a t i o n o f tw o e D N A s ( E R D 10 a n d E R D 14 ) e o r r e s P o n d i n g t o
g e n e s th a t r e s P o n d r a P id ly t o d e h y d r a t i o n s t r e s s in A ra b idOP
s i s t h a l i a n a
.
P l a n t C e l l P h y s io l
,
1 9 94
,
3 5 : 22 5 一 2 3 1
K a z u o S
,
K a z u k o Y 5
.
M o l e e u l a r r e s P o n s e s t o d r o u g h t a n d e o ld s t r e s s C u r r e n t O P i n i o n i n B i o t e e h n o l o g y
,
19 9 6
,
7 : 1 6 1一 1 6 7
K a z u k o Y S
,
K a z u o 5
.
C h a r a e t e r i z a t i o n o f th e e x P r e s s i o n o f a d e s i e e a t i o n
一
r e s P o n s i v e rd Z姐 g e n e o f A ra b id op s i s ht a l i a n a
a n d a n a ly s i s o f i t s P r o m o t e r i n t r a n g e n i e P l a n t s
.
M
o l G e n G e n e t
,
19 9 3
,
2 3 6 : 3 3 1一 3 4 0
L i u Q
,
K a s u g a M
,
S ak u m a Y, e t a l
.
1、 ,0 t r a n s e r i P t i o n fa e t o r s , D R E B I a n d D R E B Z , w i th a n E R E B P /A P Z D N A b i n d i n g
d o m a i n s e P a r a t e tw o e e l l u l a r s i g n a l t r a n s du e t i o n P a th w a y s i n d r o u g h t
一
a n d l o w
一
t e m P a r a t u r e
一
r e s p o n s i v e g e n e e x P r e s s i o n
,
r e s P e e t i v e ly
,
in A ra b id op
s i s t h a l i a n a
.
P l a n t C e l l
,
1 9 9 8
,
10 : 1 3 9 1一 14 0 6
K a s u g a M
,
L i u Q
,
M i u r a S
,
e t a l
.
Im Pr o v i n g P l a n t d r o u g h t
,
s a l t
,
a n d fr e e z i n g t o l e r a n e e b y g e n e t r a n s fe r o f a s i n g l e
s t r e s s
一
i n d u e ib l e t r a n s e r i P t io n f a e t o r
.
N a t B i o t e e h n o l
,
19 9 9
,
17 : 2 8 7 一 2 9 1
( 20 0 0
一
0 1
一
2 9 收稿 , 2 0 0 0 一 0 3 一 3一收修改稿 )
法门阶上部米兰柯维奇旋回在中国发育的一致性
赤俘维城
(北京大学地质学系 , 北京
白顺 良 江大勇
] 0 0 8 7 1
.
Em a i l : s b a i @ g e o m s
.
g e o 币k u . e d u . e n )
摘要 化学一生物地层学研究表明 , 在碳酸盐岩地层序列中 , C e几 a 值的周期性变化可以反映米兰
柯维奇 10 O ak 偏心率旋回 . 广西黄茹泥盆系法门阶上部地层 中 C e几 a 值的曲线形式可以与贵州睦
化 、 新疆塔里木盆地 中部 (塔中)很好地对比 , 而且旋回数 目也一致 . 黄茹和睦化与塔中剖面现在相
距 3 OO 0 km , 泥盆纪时相距可能更远 . 研究证实 , 同时期的 、 周期为 10 O k a 的米兰柯维奇偏心率
旋 回的沉积记录 , 可以追 索到相距很远的不同沉积 区 . 由于区域性乃 至全球性气候的制约 , 使该
旋 回同时发育于不同的沉积地点 , 不 同的沉积相区 , 从而进一步支持米兰柯维奇理论 .
关键词 米兰柯维奇旋回 泥盆系 法门阶 中国
米兰柯维奇提出了气候与地球轨道定量关系的理论 , 用 以解释冰期的机理 . 地球的偏心
率 、 倾斜度及岁差发生中期变化 , 这些变化直接影响气候 [ ’ ,2] . 人们 已测得与轨道要素变化机
理相关的 、 时限与之大致吻合的反映古温度记录的旋回 , 主要资料来源于深海新生代沉积物岩
芯的氧同位素比值 13 一 5 ] . 气候的波动影响海平面变化 [ ’ ] , 从而影响沉积记录 . 米兰柯维奇岁差
旋回的周期年限为 lZ ka , 倾斜度旋回的周期年限为 4I ka , 偏心率旋回的周期年限分别为 10 0,
4 13和 1 3 0 0 k a [6 ].
在地质时期 由于地球 自转速度减慢 , 以及地球与月亮的距离增大 , 所以古代的岁差旋回
与倾斜度旋回的周期年限 比现代短 , 然而偏心率旋回的周期年限在漫长地质时期是稳定的 17, 8] .
1 65 4