全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2010, 45 (5): 588–593, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3969/j.issn.1674-3466.2010.05.008

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收稿日期: 2009-07-23; 接受日期: 2009-11-05
基金项目: 黑龙江省自然科学基金(No.C2005-32)、博士后科学基金(No.LRB04-217)和东北农业大学科研启动基金
* 通讯作者。E-mail: lifuheng1963@126.com
次氯酸钠离析法观测甘蓝叶片脉序的处理条件优化筛选
谭大海, 李富恒*, 裴雪, 黄福山
东北农业大学生命科学学院, 哈尔滨 150030
摘要 次氯酸钠(NaClO)离析法主要用于植物叶片表皮的观测, 在研究过程中发现该法也可用于叶片脉序的观测。以甘蓝
(Brassica oleracea var. capitata)为实验材料, 采用二次正交设计方法对水煮时间、NaOH浓度、NaOH处理时间、NaClO
浓度、NaClO处理温度和处理时间等各种处理条件进行优化筛选, 以期得到适合于甘蓝叶片脉序观测的最佳处理条件组合。
实验结果表明, 新鲜甘蓝叶片水煮3分钟, 10%的NaOH溶液60°C水浴处理2.5小时, 3%的NaClO溶液40°C水浴离析2小时,
叶片脉序的观测效果最佳。
关键词 甘蓝, 次氯酸钠离析法, 脉序, 正交设计
谭大海, 李富恒, 裴雪, 黄福山 (2010). 次氯酸钠离析法观测甘蓝叶片脉序的处理条件优化筛选. 植物学报 45, 588–593.
离析法是一种非切片制片法, 是用化学药品将细胞
与细胞间的夹层物质溶解, 使细胞分离的化学处理方法
(李正理, 1987)。离析的方法有多种, 目前采用较多的是
次氯酸钠离析法(温洁, 1995; 洪亚平和陈之端, 2002)。
离析法目前主要用于叶片表皮的观测。李凤英等(2004)、
孙稚颖(2006)和高艳等(2008)分别用次氯酸钠离析法观
测了蜘蛛抱蛋属、十字花科和丁香属植物的叶片表皮。
在研究过程中我们发现, 该方法也可用于观测叶片脉
序, 离析后获得的叶片材料柔韧性好且观测效果清晰,
既可用做临时制片观察, 又可制成永久制片。
次氯酸钠离析法中的NaClO浓度、处理温度和处
理时间以及在NaClO离析前是否用NaOH进行处理、
处理时间等条件随着植物种类的不同而有较大差异,
并且观测植物叶片脉序的表皮处理条件也有所不同。
本实验以甘蓝(Brassica oleracea var. capitata)叶片
为材料, 采用二次正交设计方法对次氯酸钠离析法中
的各种处理条件进行优化筛选, 以期获得适合甘蓝叶
片脉序观测的最佳处理条件组合。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验材料为新鲜的甘蓝 (Brassica oleracea var.
capitata L.)莲座叶片, 由东北农业大学园艺实验站提
供。
1.2 实验方法
选取甘蓝叶片剪成约1.5 cm ×1.5 cm的小块, 先将叶
片置于沸水中以迅速杀死叶肉细胞, 再将水煮后的叶
片置于NaOH溶液中, 60°C水浴加热, 处理完毕后将
叶片转入NaClO溶液中, 水浴加热条件下进行离析处
理。采用L25(56)正交表对处理过程中的水煮时间、
NaOH浓度、NaOH溶液水浴时间、NaClO浓度、
NaClO处理温度和处理时间等因素进行正交设计
(表1)。分析正交实验结果, 筛选出每一因素取得最佳
处理组合的大概范围, 再应用L16(45)正交表进行二
次正交设计, 最终获得最佳处理组合。经过正交实验
处理的材料, 可以直接在显微镜下进行观测和拍照,
并可用中性树胶封片保存。
2 结果与讨论
2.1 第1次正交实验结果分析
第1次正交实验结果见表2。依据离析结果的清晰程度
和离析后叶片的柔韧性可将25个处理组合的实验结
果分为以下5类。
·技术方法·
谭大海等: 次氯酸钠离析法观测甘蓝叶片脉序的处理条件优化筛选 589
表1 NaOH、NaClO离析法第1次正交实验因素水平
Table 1 The factor and level of eductino with NaOH and NaClO for the first orthogonal experiment
Boiling
time (min)
NaOH
concentration (%)
NaOH
treated time (h)
NaClO
concentration (%)
NaClO treated
temperature (°C)
NaClO treated
time (h)
1 0.0 0 1.0 0.0 25 2
2 1.5 5 1.5 2.5 30 3
3 3.0 10 2.0 5.0 35 4
4 4.5 15 2.5 7.5 40 5
5 6.0 20 3.0 10.0 45 6


表2 第1次正交实验结果
Table 2 The result of the first orthogonal experiment
A: 优; B: 良; C: 中; D: 差 A: Excellent; B: Good; C: Average; D: Poor


第1类为组合2、13、14、16、17和18, 这些处
理组合离析后的清晰程度和叶片柔韧性都较好, 可以
在显微镜下直接观测, 是实验效果较好的组合。其中
组合2(图1A)、13、17(图1B)的实验效果最好。第2
类为离析后在显微镜下观测清晰程度较好, 但是叶片
柔韧性较差的组合, 包括组合7、8、20和24。其中组
合7和20离析后叶片过于柔软, 不易展平; 而组合8和
24则离析后叶片太硬, 容易碎裂。第3类为组合1、9、
12和23(NaClO浓度为0), 这类组合在处理后叶片的
柔韧性都较好, 但叶肉细胞未全部去除干净, 影响

Experiment result Array Boiling time
(min)
NaOH
concentration
(%)
NaOH
treated time
(h)
NaClO
concentration
(%)
NaClO
treated tem-
perature (°C)
NaClO
treated
time (h)
Definition Flexibility
1 0.0 0 1.0 0.0 25 2 D B
2 0.0 5 1.5 2.5 30 3 A A
3 0.0 10 2.0 5.0 35 4 C C
4 0.0 15 2.5 7.5 40 5 D B
5 0.0 20 3.0 10.0 45 6 D D
6 1.5 0 1.5 5.0 40 6 D B
7 1.5 5 2.0 7.5 45 2 B C
8 1.5 10 2.5 10.0 25 3 B D
9 1.5 15 3.0 0.0 30 4 D B
10 1.5 20 1.0 2.5 35 5 D B
11 3.0 0 2.0 10.0 30 5 C B
12 3.0 5 2.5 0.0 35 6 D B
13 3.0 10 3.0 2.5 40 2 A A
14 3.0 15 1.0 5.0 45 3 B A
15 3.0 20 1.5 7.5 25 4 D D
16 4.5 0 2.5 2.5 45 4 B B
17 4.5 5 3.0 5.0 25 5 A A
18 4.5 10 1.0 7.5 30 6 B A
19 4.5 15 1.5 10.0 35 2 C D
20 4.5 20 2.0 0.0 40 3 A C
21 6.0 0 3.0 7.5 35 3 D A
22 6.0 5 1.0 10.0 40 4 C A
23 6.0 10 1.5 0.0 45 5 D A
24 6.0 15 2.0 2.5 25 6 B D
25 6.0 20 2.5 5.0 30 2 D D
590 植物学报 45(5) 2010
表3 NaOH、NaClO离析法第2次正交实验因素水平
Table 3 The factor and level of eductino with NaOH and NaClO for the second orthogonal experiment
NaOH
concentration (%)
NaOH treated time
(h)
NaClO
concentration (%)
NaClO treated
temperature (°C)
NaClO treated
time (h)
1 4 1.5 2 25 2
2 6 2.0 3 30 3
3 8 2.5 4 35 4
4 10 3.0 5 40 5





观测效果。第4类为组合5, 其叶片在处理后全部碎裂,
无法观测。其余组合为第5类, 这类组合处理后的清
晰程度较差, 在显微镜下观测效果不理想。
实验结果表明: (1) 在0–6分钟(不同的)水煮时间
条件下, 都可以得到实验效果较好的组合, 其中水煮
时间为4.5分钟, 有4个组合(16–18和20)的处理效果
较好; 水煮时间为3分钟, 有3个组合(11、13和14)的
效果较好; (2) NaOH浓度为5%、10%和15%的组合中
各有3个组合的处理效果较好, 而另外2个NaOH浓度
(0和20%)处理效果较好的组合都少于3个; (3) 在实
验效果较好的6个处理组合中, 有5个组合的NaClO
浓度为2.5%或5%, 另一个为7.5%; (4) 在实验设计
的5个NaClO处理温度中, 25°C、30°C和40°C各有1
个处理组合效果很好, 其余组合离析效果都较差。(5)
叶片在NaClO溶液中处理2–6小时均有离析效果较好
的组合出现, 其中处理4和6小时各有1个效果较好的
组合, 其余处理时间均有2个以上效果较好的组合。
通过对上述正交实验结果进行分析, 我们初步认
为NaClO离析法中几个因素适宜的范围分别为: 水煮
时间3–4.5分钟, NaOH浓度5%–10%, NaOH处理时
间1.5–2.5小时, NaClO浓度2.5%–5%, NaClO处理温
度25–40°C, NaClO处理时间2–5小时。
本研究使用的实验材料为新鲜的甘蓝叶片, 水煮
的作用是迅速杀死叶片中的叶肉细胞。目前教学科研
实验中使用的材料大部分是经FAA固定液固定的叶
片, 而经过FAA固定液固定的材料在进行离析时可以
不经过水煮。因此, 为简化实验设计和操作步骤, 我
们依据第1次的实验结果将新鲜叶片水煮时间确定为
3分钟, 其它因素采用L16(45)正交表, 在第1次正交
实验结果的基础上进行二次正交设计, 二次正交实验
的因素水平见表3。
2.2 第2次正交实验结果分析
第2次正交实验结果见表4。在第2次正交实验中, 组
合6 (图1C)、11和15(图1D)处理的甘蓝叶片柔韧性和
显微镜下观测的清晰度都较好; 组合2和8处理的叶
图1 次氯酸钠离析法观测甘蓝脉序
(A) 第1次正交实验处理组合2; (B) 第1次
正交实验处理组合17; (C) 第2次正交实验
处理组合6; (D) 第2次正交实验处理组合
15。组合编号见表2和表4。

Figure 1 Observation of nervation from
Brassica oleracea var. capitata by using
NaClO eductino
(A) Group 2 of the first orthogonal ex-
periment; (B) Group 17 of the first
orthogonal experiment; (C) Group 6 of
the second orthogonal experiment; (D)
Group 15 of the second orthogonal ex-
periment. Group No. see Table 2 and
Table 4.

谭大海等: 次氯酸钠离析法观测甘蓝叶片脉序的处理条件优化筛选 591
片观测效果较好但柔韧性较差; 其余组合的叶片显微
镜下观测效果都不理想。
通过离析处理, 可观察到甘蓝叶片脉序为分支曲
行羽状脉; 一级脉较粗, 二级脉每侧有4–7条, 三级
脉为不规则结网型; 叶片微脉岛由2–5级脉构成, 微
脉岛大小中等且发育不完全; 微脉岛内具盲脉, 盲脉
不分支、1次或2次分支, 偶有3次分支。
在3组观测效果和柔韧性都较好的组合中, 组合
6的NaOH和NaClO处理时间累计为6小时, 组合11为
7.5小时, 而组合15为4.5小时。由此可见, 在柔韧性
和观测效果都较好的组合中, 组合6化学试剂用量最
少, 而组合15所需时间最短。由于本实验所用化学试
剂的价格低廉, 从操作简便高效和实验效果角度考虑
可选择组合15为最佳处理组合。
2.3 讨论
目前观测植物叶片的非切片类方法主要有透明法和
离析法两大类, 如乳酸-石炭酸透明法、氢氧化钠透明
法、过氧化氢-醋酸离析法、铬酸-硝酸离析法和次氯
酸钠离析法等。在这些方法中, 乳酸-石炭酸透明法主


表4 第2次正交实验结果
Table 4 The result of the second orthogonal experiment
Experiment result Array NaOH
concentration
(%)
NaOH
treated time
(h)
NaClO
concentration
(%)
NaClO treated
temperature
(°C)
NaClO
treated time
(h)
Definition Flexibility
1 4 1.5 2 25 2 C C
2 4 2.0 3 30 3 A C
3 4 2.5 4 35 4 D A
4 4 3.0 5 40 5 D A
5 6 1.5 3 35 5 C B
6 6 2.0 2 40 4 A A
7 6 2.5 5 25 3 C B
8 6 3.0 4 30 2 B D
9 8 1.5 4 40 3 D A
10 8 2.0 5 35 2 C C
11 8 2.5 2 30 5 A A
12 8 3.0 3 25 4 C A
13 10 1.5 5 30 4 C A
14 10 2.0 4 25 5 C C
15 10 2.5 3 40 2 A A
16 10 3.0 2 35 3 C D
A、B、C和D见表2。A, B, C and D see Table 2.




图2 甘蓝脉序不同方法制片效果
(A) 氢氧化钠透明法; (B) 次氯酸钠离析法; (C) 正交实验优化后的次氯酸钠离析法

Figure 2 The mounting effect of nervation from Brassica oleracea var. capitata by using different methods
(A) NaOH clearing; (B) NaClO eductino; (C) NaClO eductino after orthogonal experiment optimization
592 植物学报 45(5) 2010
要用于小材料的透明观察; 过氧化氢-醋酸离析法在
叶片离析研究中仅见少量应用(Setten and Koek-
Noorman, 1986; 马清温和张金保, 2003; 马清温等,
2005); 铬酸-硝酸离析法主要用于观察木质材料, 在
叶片结构的观测中主要用于扫描电镜观察角质层内
表面结构的制片(Stockey and Taylor, 1978; Stockey
et al., 1992); 只有氢氧化钠透明法和次氯酸钠离析
法常用于植物叶片观测的制片, 其中又以次氯酸钠离
析法最为常用。另外, 氢氧化钠透明法和次氯酸钠离
析法目前主要应用于叶片表皮的制片观测, 而且在实
际应用中有时需要与其它处理方法结合起来使用(潘
开玉等, 1990)。对叶片脉序的制片观测, 特别是4、5
级叶脉和微脉岛的观测目前还没有形成一套完整且
高效的制片方法。图2A和图2B分别是用氢氧化钠透
明法和次氯酸钠离析法处理甘蓝莲座叶片获得的脉
序照片。从图2可以看出, 单独使用氢氧化钠透明法
或次氯酸钠离析法获得的装片清晰度和柔韧性都较
差, 可以用于定性观察, 但不适用于定量测量。我们
在实验研究过程中发现, 将氢氧化钠透明法与次氯酸
钠离析法相结合并对次氯酸钠离析法中各种处理条
件进行适当优化, 可以制备出适用于叶脉与脉岛, 特
别是4、5级叶脉和微脉岛观测的清晰装片(图2C)。
次氯酸钠离析法具有离析液作用温和、药品价格
低廉、操作步骤简单和对环境污染小等优点(洪亚平
和陈之端, 2002)。鉴于在实际应用时, 离析效果随植
物种类的不同而存在较大差异, 在进行实验前, 需要
对实验条件进行优化筛选。实验条件优化一般采用多
次单因素设计法, 这种方法不仅工作量较大, 而且忽
略了各单因素间的交互作用对实验效果造成的影响,
结果不够精确。本实验采用二次正交设计, 首先确定
各因素的大体范围, 再进一步筛选出最佳的实验处理
组合, 简化了实验设计方案, 节省了化学试剂用量,
同时减轻了工作量并提高了工作效率。
本研究通过二次正交实验得到适用于新鲜甘蓝
莲座叶片的离析条件, 经过FAA固定的甘蓝叶片也可
以应用本研究确定的处理条件并可获得较好的实验
结果。此外, 这一处理条件在与甘蓝莲座叶片类似的
植物叶片中推广应用时效果较好。例如, 利用本研究
结果处理花椰菜(Brassica oleracea var. botrytis)叶
片可以得到清晰的装片。应用次氯酸钠离析法处理其
它实验材料时应根据材料特点对离析条件进行适当
调整。纸质叶片、革质叶片和标本干叶离析所用的实
验条件与本研究获得的应用于新鲜肉质叶片的实验
条件具有较大差异。
在叶片离析处理前, 新鲜的叶片需要水煮以迅速
杀死叶肉细胞, 而经过FAA固定液固定的材料可以省
略水煮步骤。但有研究表明, 水煮可使实验材料在一
定程度上软化, 如李学花等(2009)先用水煮方法软化
固定后的芦苇(Phragmites australis)叶片, 再对叶片
进行离析。因此, 对于FAA固定后较为坚硬的材料,
如禾本科植物叶片, 在离析前也可以用水煮方法对叶
片进行初步软化。
本研究在二次正交实验设计的基础上得出次氯
酸钠离析法观测甘蓝叶片叶脉的最佳处理条件为: 新
鲜叶片水煮3分钟, 10%的NaOH溶液60°C水浴2.5小
时, 3%的NaClO溶液40°C水浴离析2小时。
参考文献
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李凤英, 唐绍清, 王任翔, 李光照 (2004). 中国蜘蛛抱蛋属植
物营养器官的解剖学研究. 广西植物 24, 239–242.
李学花, 杨晓杰, 程加春, 陈静 (2009). 扎龙湿地羊草叶表皮
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nonaceae in the Neotropics. Bot Jahrb Syst 108, 17–50.

The Optimization of Experimental Conditions of NaClO Maceration
for Brassica oleracea var. capitata Leaf Nervation Observation
Dahai Tan, Fuheng Li*, Xue Pei, Fushan Huang
College of Life Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China
Abstract NaClO maceration is used to observe the epidermis of plant leaves. Here, we reviewed its use for observing
leaf nervation. The Brassica oleracea var. capitata leaf was used as material, and the optimal reaction conditions of Na-
ClO maceration with boiling time, NaOH concentration and treatment time, as well as NaClO concentration and treatment
temperature and time were obtained by orthogonal design performed twice. The reaction condition of NaClO maceration
for leaf nervation observation was determined. For fresh leaves, the best condition was boiling for 3 min, then 10% NaOH
60°C water bath for 2.5 h, then 3% NaClO 40°C water bath for 2 h.
Key words Brassica oleracea, NaClO maceration, nervation, orthogonal design
Tan DH, Li FH, Pei X, Huang FS (2010). The optimization of experimental conditions of NaClO maceration for Brassica
oleracea var. capitata leaf nervation observation. Chin Bull Bot 45, 588–593.
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* Author for correspondence. E-mail: lifuheng1963@126.com
(责任编辑: 孙冬花)






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中国科学院上海植物生理生态研究所王永飞课题组现面向社会招聘博士后或研究助理2名。本课题组主要
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