全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2010, 45 (5): 530–540, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3969/j.issn.1674-3466.2010.05.002

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收稿日期: 2010-04-13; 接受日期: 2010-06-08
基金项目: 国家自然科学基金委员会创新团队项目(No. 30821007)和中国科学院“百人计划”项目
* 通讯作者。E-mail: linjx@ibcas.ac.cn
光激活荧光蛋白及其在植物分子细胞生物学研究中的应用
王锋1, 2, 张春雨1, 2, 万里川1, 王钦丽1, 林金星1*
1中国科学院植物研究所, 北京 100093; 2中国科学院研究生院, 北京 100049
摘要 光激活荧光蛋白是指用特定光照射时, 其荧光特性发生显著改变的一类荧光蛋白。借助光激活荧光蛋白的这种特性,
可以实现对活细胞、细胞器或胞内分子的时空标记和追踪。该文介绍了目前光激活荧光蛋白的性质, 并从多个方面对其应
用进行了概括, 包括分子标记与动态分析、蛋白质相互作用、细胞器及细胞组分动态研究、细胞追踪以及在光激活定位显
微镜中的应用等, 且对目前光激活荧光蛋白在植物分子细胞生物学中的应用进行了详细介绍。
关键词 分子标记, 光激活荧光蛋白, 蛋白质相互作用, 时空定位
王锋, 张春雨, 万里川, 王钦丽, 林金星 (2010). 光激活荧光蛋白及其在植物分子细胞生物学研究中的应用. 植物学报
45, 530–540.
绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP),
从维多利亚多管水母(Aequorea victoria)中分离得到,
该蛋白在波长488 nm的激光照射下会发出绿色荧光,
由此得名。绿色荧光蛋白及其变种自1962年被发现至
今, 促进了神经生物学和细胞生物学的极大发展(常
芳和崔素娟 , 2005; 吴沛桥等 , 2009; 张新生等 ,
2009)。日籍科学家下村修(Osamu Shimomura)、美
国哥伦比亚大学的马丁·沙尔菲(Martin Chalfie)和加
州大学圣地亚哥分校的美籍华裔科学家钱永健
(Roger Y. Tsien)由于发明和改进了荧光蛋白, 共同
获得了2008年的诺贝尔化学奖。目前已发现有吸收、
发射不同颜色光且几乎覆盖了可见光光谱的各种荧
光蛋白(Tsien, 2005)。近年来, 又有一类新的荧光蛋
白——光激活荧光蛋白(photoactivatable fluorescent
proteins, PAFP)异军突起, 从而为细胞生物学的发
展开辟了更加广阔的空间。
光激活荧光蛋白的基本特性是在特定激发光的
照射下, 光谱特性发生改变, 其中包括荧光强度由弱
变强(即光激活)或荧光颜色由绿变红(即光转换)。这
一类荧光蛋白, 统称为光激活荧光蛋白, 它们为研究
分子、细胞器或细胞在时空上的动态变化提供了有力
的工具。本文将分别从光激活荧光蛋白的种类、光转
换机制及其应用等方面进行详细介绍。
1 光激活荧光蛋白的种类和光转换机制
最早研究发现, 绿色荧光蛋白及其一些变种在无氧条
件下受光能诱导其颜色由绿变红, 但其具体机制尚不
明确, 从而致使其只能在厌氧生物中运用(Elowitz et
al., 1997)。通常, 光激活荧光蛋白(PAFP)在活体细胞
中, 有些呈单体的形式(可用来标记胞内蛋白, 进行
追踪); 还有些呈四聚体形式(聚合形式可能会影响目
的蛋白功能)。因此, 单体型的PAFP具有更加广阔的
应用前景。Lukyanov等(2005)为研制单体型的光激活
荧光蛋白提出了2个主导思路: (1) 将单体形式荧光
蛋白的发光基团或邻近区域引入突变, 从而引入光转
换的特性; (2) 将四聚体形式的PAFP聚合界面的个
别氨基酸引入突变, 改装为单体型的PAFP。本文依
据PAFP的光转换特点将其分为3类。
1.1 不可逆的光激活(暗态→发光态)
这一类光激活荧光蛋白主要由光激活绿色荧光蛋白
(photoactivatable green fluorescent protein, PA-
GFP, avGFP的变种)、单体型的光激活红色荧光蛋白
PAmRFP1(Dsred的红色光激活变种 )和PAm-Che-
rry1 (mCherry的变种)组成。
avGFP的激发光谱峰值分别为396 nm和476
·特邀综述·
王锋等: 光激活荧光蛋白及其在植物分子细胞生物学研究中的应用 531
nm, 两者比例为6:1; 它们分别对应于发色团的中性
形式(质子化)和碱性形式(去质子化)。当用紫外光/紫
光照射时, avGFP中第222位的谷氨酸脱羧, 氢键重
排、发色基团去质子化, 最终导致碱性形式所占比例
增加(图1)。
PA-GFP是avGFP的203位苏氨酸突变为组氨酸
的一个变种 (Patterson and Lippincott-Schwartz,
2002)。PA-GFP发色基团主要呈中性, 其激活光波长
为400 nm, 发射光谱峰值为515 nm。当未激活的
PA-GFP用488–510 nm的激光照射时, 几乎不发光;
而用紫外光(大约400 nm)照射时, PA-GFP的发色基
团则不可逆地从中性转变为碱性形式, 其吸收光谱峰
值和发射光谱峰值分别为505 nm和517 nm (图1);
若再次用488–510 nm的激光照射时, 将发射出绿色
荧光, 荧光强度增强约100倍。
基于mRFP1设计的变种PAmRFP1, 也是通过
紫外光照射发生光激活 (Verkhusha and Sorkin,
2005)。PAmRFP1与mRFP1相比, 分别在148、165
和203位置的氨基酸残基引入了突变。其中最亮的1
个变种——PAmRFP1-1, 激活前有微弱的青色荧光,
当用380 nm的紫外光照射后, 发生不可逆的光转换,
红色荧光强度增强约70倍。
PAmCherry1、2、3是基于mCherry, 分别在148、
165、167和203位氨基酸残基引入不同的突变进行设
计。当用强紫外光照射时, 由暗态转换为可发射红色
荧光的状态。其中, PAmCherry1照射前后荧光强度增
强约4 000倍(Subach et al., 2009)。PAmCherry1为
单体型红色荧光蛋白, 与发射绿光的PAFPs相比, 具
有较低的光毒性。而与PAmRFP1相比, PAmCherry1
具有较快的成熟速度和较高的对比度以及更大的量
子产率。因此, PAmCherry1作为单体型的红色光激活
荧光蛋白具有更好的应用前景。PAmCherry1和PA-
GFP组合使用可进行双色光激活成像, 由于二者激
活后, 其光谱完全不重叠, 可以用405 nm的激光对
其同时进行激活, 然后分别用564 nm和488 nm的激
光进行成像(Subach et al., 2009)。



图1 光激活荧光蛋白的光化学机制 (Lukyanov et al., 2005)

Figure 1 Spectral and photochemical properties of photoactivatable fluorescent proteins (Lukyanov et al., 2005)

532 植物学报 45(5) 2010
1.2 不可逆的光转换荧光蛋白
不可逆的光转换荧光蛋白由青色光转换荧光蛋白
(photoswitchable cyan fluorescent protein, PS-CFP,
起源于水母)、kaede (日语意为“枫树”, 起源于珊
瑚纲)和类kaede蛋白组成。其中, 类kaede蛋白主要
由mcavRFP、rfloRFP、EosFP及其变种mEosFP和
KikGR组成。
青色光转换荧光蛋白(PS-CFP)在非激活形式下,
发射光谱峰值位于468 nm处, 当用紫外光(大约400
nm)照射时, PS-CFP发生不可逆的光转换, 导致511
nm的绿色荧光强度呈300倍的增强, 而青色荧光强
度则下降为之前的1/5, 从而使绿色荧光与青色荧光
强度的比值增加约1 500倍(Chudakov et al., 2004)。
通常PS-CFP呈单体形式存在, 其光激活化学机制与
PA- GFP相同。然而PS-CFP的缺点是在激发前后青
色和绿色荧光的强度都相对较弱 , 但增强型的
PS-CFP2荧光强度却有了实质性的改善。
当用紫外光照射时, kaede发生不可逆的光转换,
从绿色荧光转换为红色荧光, 其红色荧光与绿色荧光
强度的比值增加约2 000倍(Ando et al., 2002; Labas
et al., 2002)。类kaede (kaede-like)蛋白也具有类似
的紫外激活性质。kaede的发色基团由His65-Tyr66-
Gly67组成, 类似于avGFP的发色基团Ser65-Tyr66-
Gly67(图1)。用紫光/紫外光照射时, kaede多肽骨架
断裂, 65位His的α碳脱氨, 该组氨酸的α碳和β碳之间
形成双键, 双键与66位酪氨酸的咪唑环之间形成共
轭π键, 于是kaede的发射波长发生红移(Mizuno et
al., 2003)。
Kaede和类kaede荧光蛋白适用于对细胞和细胞
器进行标记。该类蛋白多数以四聚体形式存在, 不适
合用来研究蛋白的功能。在类kaede蛋白中 , 唯有
mEosFP以单体形式存在 , 因此 , 可以用来标记蛋
白。然而mEosFP发色基团的成熟温度小于30°C
(Campbell et al., 2002), 因此, mEosFP不适合用于
哺乳动物细胞的研究。
1.3 可逆的光转换荧光蛋白
可逆的光激活荧光蛋白包括: (1) “可点燃的荧光蛋
白”(kindling fluorescent protein1, KFP1), 由粉红海
葵(Anemonia sulcata)中的色素蛋白(asulCP)发展而
来 ; (2) Dronpa及其变种 , 提取于梳状珊瑚 (Pect-
iniidae sp. coral); (3) 可逆的光激活红色荧光蛋白
rsCherry和 rsCherryRev等。上述光激活荧光蛋白
(PAFP)在无荧光和发射荧光2种状态下, 分别用2种
不同波长的光照射时, 均能发生光转换。
野生型的asulCP在强的绿光照射下, 可以瞬时
转化成红色荧光形式(其激发光和发射光谱的峰值分
别为572 nm和595 nm), 而在黑暗条件下, 红色荧光
会自发弛豫到无荧光的状态; 若用450 nm的蓝光照
射能够迅速使asulCP淬灭, 再次成为无荧光的状态,
上述激活和淬灭都是可逆的过程 (图1)。增强型
asulCP的突变体——KFP1, 依据照射光强度和持续
时间的不同 , 能够发生可逆或不可逆的激活
(Chudakov et al., 2003a, 2003b)。Quillin等(2005)
认为 , 发色基团的反式-顺式异构化 , 可用来解释
KFP1可逆光转换的机制(图1)。
Dronpa是另一类能够在绿色和无色之间发生可
逆光转换的光激活荧光蛋白(Ando et al., 2004)。当其
发射绿色荧光时, 其激发光谱和发射光谱的峰值分别
为503 nm和518 nm。如果延长蓝光的照射时间或增
强蓝光的照射强度, 则会导致蛋白淬灭成无荧光的中
性发色基团形式, 其吸收波长峰值为390 nm。当用
400 nm的激发光照射时, Dronpa可以被可逆地激发
到有荧光的状态。另外, 用488 nm的激发光照射时,
Dronpa发射绿色荧光, 但很快又会熄灭为无荧光的
状态。Andresen等(2008)发现, Dronpa的变种Padron
具有不同的光转换行为, 如用蓝光照射时被激活为可
发射绿色荧光的状态, 而用紫外光照射时Padron则
淬灭成无荧光的状态, 从而弥补了Dronpa在绿光照
射时迅速淬灭的缺点。Dronpa可能具有和KFP1类似
的光化学机制, 但仍需进一步研究加以证明。
rsCherry和rsCherryRev都是在mCherry的基础
上设计的可逆荧光蛋白变种(Stiel et al., 2008)。目前
这2种红色可逆光转换荧光蛋白的缺点是具有较高的
背景荧光, 限制了它的应用。
2 利用PAFP进行成像的注意事项
应用PAFP进行光转换实验, 对显微镜的光源配置要
求较高。除配备有成像光源外, 还需配有荧光蛋白的
激活光源(目前对多数PAFP激活采用405 nm的激
王锋等: 光激活荧光蛋白及其在植物分子细胞生物学研究中的应用 533
光)。由于用紫外光照射PAFP使其发生光转换时 ,
对细胞具有较大的光毒性 , 为克服这一缺点 ,
Watanabe等(2008)利用近红外(波长为750 nm)的飞
秒级双光子激光脉冲, 对光转换荧光蛋白kaede进行
了由绿色向红色的荧光转换, 从而实现了在空间上对
细胞器的选择性标记 , 同时还降低了对细胞的光
毒性。
对仪器配备不完善的实验室而言, 可借助普通的
宽场荧光显微镜进行光转换。最近, Baker等(2010)
在装备有DAPI、荧光素和罗丹明滤镜组, 并以汞灯作
为照明光源的荧光显微镜下, 利用DAPI滤镜组, 照
射5–10秒也可以实现光激活荧光蛋白的光转换。
无可否认, 理想的PAFP应该能够便捷地实现光
转换, 同时在转换前后仍具有较高的对比度。但是每
类PAFP都具有其自身的特点, 使其更适于进行某一
方面的应用。例如, 对蛋白进行追踪时, 首先必须要
选择单体形式的光激活荧光蛋白。如进行短时间的重
复追踪, 宜选Dronpa(无色 绿色)。如果进行长时
间追踪, 则要求蛋白在光转换后要有足够的光稳定
性 , 为 此 应 选 择 PAmcherry1( 无 色 → 红 色 ) 、
mEosFP(绿色→红色 )、PA-GFP(无色→绿色 )和
PS-CFP2(青色→绿色)等光激活荧光蛋白。在多重荧
光标记的实验中, PAFP之间应尽量避免光谱重叠。通
常在应用高分辨率的显微镜观察时, 要求单个PAFP
分子的亮度要高, 而背景噪音应尽量低。
无论采用何种PAFP, 都要对成像的条件进行优
化。如在衍射极限成像中, 要预先估计光激活后目的
蛋白荧光强度的增加幅度, 从而避免检测器色彩过饱
和。此外, 光激活时所用的激光强度也要进行优化,
既要保证激活程度最大化, 又要使样品造成的光漂白
尽可能减小。当使用由暗变亮的PAFP时, 还要保证
进行光激活时准确选择感兴趣的区域。
众所周知, 在传统的衍射极限显微镜中, Z轴的
分辨率较低, 因此很难在空间尺度上限定光激活的范
围。利用双光子显微镜激发PAFP时, 可以精确到亚
飞升的范围, 由于该方法减少了Z轴方向上的光激活,
从而降低了对细胞的光毒性。利用全内反射显微镜,
则可以将光激活的范围限定在紧贴细胞膜表层的区
域, 从而精确地对定位于膜表面的蛋白进行局部的光
学标记实验。因此, 借助于全内反射荧光显微镜和双
光子荧光显微镜能够有效地界定激活的三维区域
(Testa et al., 2008a, 2008b)。
3 光激活荧光蛋白的使用范畴
光激活荧光蛋白的应用主要体现在细胞、细胞器和分
子水平上。通常, 利用常规的荧光标记物进行实时追
踪时, 需要长时间持续成像, 造成较强的光毒性和光
漂白, 而PAFP则突破了此限制, 拓展了对细胞学研
究的时空范围。由于光激活荧光蛋白的新颖性, 近年
来多数研究者尚未意识到PAFP的独特价值。在此,
我们将结合国内外已有的文献报道, 对PAFP在细胞
生物学中可能的应用范畴进行初步的总结和分析, 以
供读者参考(表1)。
3.1 分子标记和动态分析
当光激活荧光蛋白与目的蛋白融合后, PAFP可以提
供蛋白的定位和循环及其在活细胞中运动的方向和
速率等信息。异聚体G蛋白(α、β、γ)介导了哺乳动物
细胞中的信号转导途径。长期以来, 人们一直认为G
蛋白位于质膜上。Chisari等(2007)利用光漂白后荧光
恢复、荧光漂白损失技术, 以及通过光激活Dronpa和
G蛋白不同亚基的融合蛋白, 对G蛋白的时空定位动
态进行了分析。结果发现, G蛋白亚基在质膜和内膜
系统之间可快速地穿梭, 并通过感应质膜胞质面和内
膜系统中G蛋白库的浓度在二者之间建立通讯。
利用可逆的PAFPs可以进行重复激活, 并在不
同的亚细胞区域连续进行光标记。Ando及其同事利
用Dronpa连接胞外信号调节激酶(extracellular sig-
nal-regulated kinase-1, ERK1), 通过反复的光激活
和擦写对ERK1在胞内和核内的信号进行了研究, 结
果发现ERK1可以进出细胞核, 当细胞受到外界刺激
时, ERK1的运动速率会发生改变(Ando et al., 2004)。
由此可见, 可逆的光激活荧光蛋白可被反复激活的优
点, 将有助于我们绘制目的蛋白在细胞中转运及参与
信号途径的“活地图”。
除对蛋白进行标记外, 还可以通过构建荧光蛋白
与DNA/RNA结合结构域的融合表达载体, 以实现对
DNA或RNA的活体标记。通过在染色体的不同区域插
入定位序列(如乳糖操纵子), 利用荧光蛋白和对应的
DNA结合结构域(乳糖阻遏蛋白)构建融合蛋白, 然后
用DAPI染色方法分析染色体上荧光蛋白点的数目
和强度, 即可为我们提供核内复制和染色单体的信息
534 植物学报 45(5) 2010
表1 光激活荧光蛋白选择原则及应用范围
Table 1 Criteria for selecting photoactivatable fluorescent proteins and their potential applications at three levels
标记层面 PAFP名称 激活光 荧光颜色变化 寡聚状态 目前应用范畴
Kaede 紫外光 绿色→红色 四聚体 组织中的细
胞追踪 KFP1* 紫外光 无色→红色 四聚体
细胞定位; 细胞的分裂速率; 细胞
的形态和体积
PS-CFP2 紫外光 青色→绿色 单体
mEosFP 紫外光 绿色→红色 单体
Kaede 紫外光 绿色→红色 四聚体
细胞器和囊
泡
KFP1* 紫外光 无色→红色 四聚体
运动速率和方向; 分裂和融合事件;
囊泡内含物的交换; 膜扩散和流动
速率
PA-GFP 紫外光 无色→绿色 单体
PAmCherry 紫外光 无色→红色 单体
PA-CFP2 紫外光 青色→绿色 单体
mEosFP 紫外光 绿色→红色 单体
Dronpa 紫外光/绿光 无色 绿色 单体
活细胞内分
子标记
Padron 绿光/紫外光 无色 绿色 单体
蛋白、DNA或RNA运动速率和方向;
扩散系数; 生理条件下的寡聚状态;
蛋白的翻译后修饰、降解; 蛋白质相
互作用
* KFP1能够发生可逆或不可逆的光激活过程, 具体取决于激活光的照射强度和持续时间。
* KFP1 is capable of both reversible and irreversible photoactivation depending on the intensity and duration of the activating
light.


(Kato and Lam, 2003)。
通过在mRNA序列上添加颈环结构的核酸适体
(该适体可以与荧光标记的配体特异结合), 就可实现
对RNA转运等动态过程进行实时活体观察。例如, 将
融合表达荧光蛋白与噬菌体MS2荚膜蛋白, 及MS2
荚膜蛋白与MS2重复序列(mRNA分子与其串联)特异
结合 , 就可实现对特异mRNA分子 -蛋白复合体
(mRNPs)的动态观察(Janicki et al., 2004)。Shav-Tal
等 (2004)利用PA-GFP标记MS2荚膜蛋白检测了
mRNPs从转录位点释放后随时间扩散的动态, 并通
过能量耗竭实验提出了mRNPs的运动不需要能量,
由此符合扩散运动的模型。
除了对目的蛋白的动态、定位和循环等进行分析
外, 还可从单细胞水平上对蛋白的降解作定量分析。
目前检测蛋白半衰期的常用方法为: 放射性脉冲追踪
和放线菌酮追踪。其中放射性脉冲追踪对正常细胞的
生理功能影响较小, 但该方法费力又需要放射性标
记; 而放线菌酮追踪则严重影响细胞代谢。而且, 这2
种方法都不能在单细胞水平上进行实时测定。Zhang
等(2007)应用光激活荧光蛋白, 在单细胞水平上对蛋
白降解进行了分析。由于融合蛋白稳态时浓度和对应
的荧光蛋白强度取决于蛋白的合成/成熟速率和降解
速率, 当对整个细胞进行光转换后, 光激活产生的荧
光信号只依赖于蛋白的降解速率(观察过程中的光漂
白必须进行补偿)。因此, 实时观察激活的光激活荧光
蛋白就能对标记的目的蛋白降解过程进行定量分析。
3.2 蛋白相互作用的检测
激光共振能量转移(fluorescence resonance energy
transfer, FRET)是指受激发的荧光基团(供体)的能量
转移到邻近另一个荧光基团(受体), 受体的激发光谱
与供体的发射光谱相互重叠。当用外界光刺激供体时,
受体发光则意味着荧光共振能量转移。利用不可逆的
光激活荧光蛋白(PAFP)作为供体/受体, 并在光激活
的FRET显微镜下进行观察, 即可同时对蛋白的时空
定位和相互作用进行检测。如果在光激活以外的区域
检测到光激活荧光蛋白供体和荧光蛋白受体之间荧
光共振能量转移的现象, 这就表明连有光激活荧光蛋
白的目的蛋白可能在这2个位置之间发生了运动。
近年来, 国内外在应用PAFP进行FRET成像方
面已取得了可喜的进展。Giordano等(2002)利用具有
“光致变色现象(photochromism)”的二芳基乙烯类
有机染料, 作为激光共振能量的受体。当用特定波长
的激光照射供体时, 如果供体和受体之间发生FRET,
借助于受体的吸收光谱能够发生可逆变的特点, 从而
实现FRET“开”和“关”之间的可逆性转换, 即光
致变色的FRET (photochromic FRET, PC-FRET)。
Rizzo等 (2004)将可逆的光转换荧光蛋白 (KFP1和
Dronpa)也用于PC-FRET技术。当光激活以后, PAFP
的吸收光谱发生根本性的改变, 这为FRET的检测提
王锋等: 光激活荧光蛋白及其在植物分子细胞生物学研究中的应用 535
供了内参。将近年发展起来的CFP(也叫作Cerulean)
与Dronpa组合 , 即可进行PC-FRET(Rizzo et al.,
2004)。Cerulean的发射光(峰值为475 nm)和Dronpa
的激发光(峰值为503 nm), 二者光谱显著重叠, 这就
保证了较高的FRET效率。当用433 nm的激光照射
Cerulean时, 若发生FRET作用, 能量传递给Dronpa,
Dronpa发射绿色荧光, 但同时会引起Dronpa迅速淬
灭。然而, 潜在的问题是用来激发Cerulean的激发光
可以快速导致已经淬灭的Dronpa再次被激活。
通过运用FRET方法, 即经过长时间累积的供体
发射光的作用 , 以激活光激活荧光蛋白 ( 如以
Luciferase作为供体, 不可逆的PAFP作为受体)。如
果Luciferase的荧光激活了邻近的光激活荧光蛋白,
PAFP的光激活程度与FRET的效率和FRET配对互
作时间成比例。基于光激活作用的累积效应, 该方法
可以检测蛋白和蛋白之间较弱的相互作用, 或胞内已
经发生的相互作用。不过 , 到目前为止 , 能够与
Luciferase进行FRET组合配对的PAFP数目比较有
限, 且激活光也主要集中在紫外光区域。因此发射光
为400 nm的Luciferase蓝移变种(Deng et al., 2001)
更加适合在该检测方法中作为FRET的供体。
利用双分子荧光互补技术研究蛋白的相互作用
虽已取得了较大的进展(严晶和霍克克, 2006), 但若
利用光激活荧光蛋白进行双分子荧光互补技术研究蛋
白的相互作用, 则可对互作蛋白在胞内的路径进行实
时记录。由于双分子荧光互补技术只需要荧光蛋白的2
个部分相互靠近即可发光, 从而导致较高的假阳性。
3.3 细胞组分标记与动态分析
3.3.1 线粒体研究
早在2003年, Jakobs等(2003)利用avGFP作为光学
标记物, 在低氧条件下, 用蓝光诱导avGFP光转换,
使avGFP吸收和发射光谱红移, 红色荧光呈百倍增
加, 从而成功实现了对酵母线粒体基质的局部光学
标记。
Karbowski等(2004)利用线粒体基质定位的光激
活荧光蛋白PA-GFP, 对单个线粒体进行局部的光标
记, 观测和定量分析正常细胞和凋亡细胞中线粒体的
融合速率。研究发现, 在凋亡过程中Bax/Bak的激活
阻止了线粒体的融合。
Haigh等(2007)利用PA-GFP标记线粒体基质定
位蛋白确定单个线粒体的边界; 同时标记线粒体膜电
势, 跟踪单个线粒体随时间变化的情况。在网管状的
线粒体中, 选择多个位点依次进行光转换, 发现分枝
状的线粒体是由不连续的部分组成的。当线粒体分裂
后, 子线粒体依然紧靠, 线粒体的形态在分裂前后保
持不变, 但具有不同的膜电势。也就是说, 在形态学
上可以分辨的分裂, 还需要线粒体分裂后沿骨架运动
并互相分离。
Liu等(2009)运用PA-GFP标记线粒体内膜基质
并结合光转换等手段, 在哺乳动物细胞中鉴定到“完
全融合”和“瞬时融合”2种类型的线粒体融合事件,
并重点对瞬时融合及其调控进行了分析。其中瞬时融
合是指线粒体靠近, 交换内膜间隙中可溶性的基质蛋
白, 再次分开, 仍然保持先前的状态。瞬时融合在连
续快速的融合分裂过程中展现了极为快速的动力学
效应, 但其只允许整合膜蛋白的部分交换。另外, 内
膜融合蛋白Opa1的表达水平和微管骨架参与调控线
粒体的融合。

3.3.2 囊泡转运研究
众所周知, 在细胞的胞吞和胞吐等过程中, 囊泡在物
质交换和膜系统的循环中起着重要作用, 但目前光激
活荧光蛋白在囊泡转运中的应用仍处于起步阶段。例
如Chudakov等 (2004)利用青色光转换荧光蛋白
(PS-CFP)对人类的多巴胺转运子的转运途径进行了
研究。另外, 在中等强度的激发光照射下, pH稳定的
青色荧光蛋白标签既可以对蛋白进行标记, 又可用于
激光共振能量转移。
吞噬泡在成熟过程中与内吞途径中的组分发生
活跃的分裂和融合事件。Lee等(2005)用光激活荧光
蛋白PA-GFP标记Fcγ受体进行局部标记发现, 有些
受体呈小泡状脱离, 有些依然贮于吞噬泡上。Fcγ受
体在新形成的吞噬泡膜上呈连续分布, 随后呈簇状、
点状和多泡状分布, 直到消失。当利用pH敏感的荧光
蛋白标记Fcγ受体时, 受体的胞质域进入酸性组分中,
其向内出芽形成了多泡状结构。如果阻碍多泡体的形
成并不会影响晚期内体和溶酶体的形成, 那么则暗示
吞噬泡的分裂和融合过程的控制是相互独立进行的。

3.3.3 细胞骨架动态研究
Tulu等(2003)利用GFP的变种PA-GFP标记α-微管蛋
536 植物学报 45(5) 2010
白, 光漂白和光激活标记实验表明, 非中心体相关微
管参与了含中心体细胞的纺锤体形成。通常周质微管
向正在形成中的纺锤体运动, 是由转运和侧向滑动的
相互作用所导致 , 而非踏车运动。后来 , Rusan和
Wadsworth(2005)利用转盘共聚焦显微镜观察表达
GFP-tubulin的LLCPK1细胞系 , 结果发现细胞分裂
末期开始后微管迅速延伸到细胞的周质, 中心体片段
化形成簇状的微管 , 并释放出单根的微管。当用
PA-GFP标记微管, 通过光激活的方法标记中心体微
管的负端时, 在分裂末期中心体释放的微管则是分裂
中期释放量的7倍。无论是单根或成簇的微管, 其运
动均具有一定的方向性。通过结合抑制剂实验表明,
有方向性的微管释放可能与依赖微管某些组分的定
位和收缩环形成的位点有关。

3.3.4 染色质动态研究
DNA损伤的识别和修复发生在染色质环境下。将荧光
蛋白与DNA损伤应答蛋白融合后就可得到代谢中基
因组损伤的时空信息。Kruhlak等(2009)用PA-GFP标
记核心组蛋白H2B并通过UVA激光照射来引入DNA
损伤的方法, 对染色质的动态结构进行了观察。
在哺乳动物中, DNA甲基转移酶在表观遗传学研
究控制基因表达的调节网络中具有中心地位。通过添
加核酸类似物, 核复制位点里新合成的DNA中即可
插入核酸类似物, 利用荧光蛋白标记DNA甲基转移
酶1(Dnmt1), 就可以通过“捕获测定”在那些位点检
测Dnmt1的荧光(Schermelleh et al., 2005)。应用光
漂白或光激活的方法检测哺乳动物细胞发现 , 当
Dnmt1催化中心发生突变时, 就无法捕获。这种“捕
获测定”显示了DNA甲基转移酶在自然环境下被固定
后的动力学性质, 使在活细胞中研究DNA甲基转移
酶调节和催化能力成为可能。
柯浩体(Cajal body)作为一种存在于细胞核里的
细胞器, 在多数细胞类型中的直径均小于1 μm, 从而
降低了对其进行观察的可能性。然而, 在两栖动物卵
母细胞(幼芽泡)中, 人们发现柯浩体的直径大约为
2–10 μm。由此Deryusheva和Gall(2004)就利用爪蟾
卵母细胞对coilin(在柯浩体中富集)进行了动力学分
析。首先用PA-GFP标记coilin, 然后在激光共聚焦显
微镜下对其进行活体动态分析。结果表明, coilin离开
和进入柯浩体的速度一样慢 , 均为分钟级 ; 同样
coilin在柯浩体中的扩散速度也较慢, 但其运动并不
受核的转录状态或正在进行核质交换的影响。
3.4 光激活荧光蛋白对细胞的标记
PAFP为人们提供了一种在活体组织中对特定细胞类
型进行非入侵性的标记和追踪方法。比如, PAFP可用
于器官发生过程中细胞迁移和细胞系的形成, 以及病
毒颗粒在宿主细胞内的迁移等方面的研究。Stark和
Kulesa应用显微注射PAGFP的方法, 对鸡胚特定区
域中的单个细胞进行活体标记, 结果只有极少数细胞
有标记荧光, 然后他们再通过实时成像观察这些细胞
最终发育成的细胞系(Stark and Kulesa, 2005)。由于
在动物胚胎发育的早期, 中胚层的迁移是一个核心事
件。Murray和Saint(2007)用PAGFP与α-微管蛋白构
建融合表达载体, 在原肠胚形成前对中胚层细胞进行
光激活。结果发现, 中胚层细胞绕过外胚层细胞进行
迁移, 由此证明趋化反应和亲和力的不同是中胚层细
胞迁移的主要动力。
Kurup等(2005)的报道认为, 在植物细胞中, 利
用热休克-转座子体系也可以实现对特定细胞系进行
标记。而借助于光激活荧光蛋白, 就可以简便地实现
对植株组织中部分细胞进行选择性标记。
光激活荧光蛋白也可用于细胞分拣技术。例如,
可通过两步分拣出分别用GFP、RFP和kaede标记的
3类细胞。首先, 将表达GFP和kaede的细胞系与表达
RFP的细胞系分开, 然后再用紫外光-紫光照射, 使
kaede发生光激活, 绿色荧光变为红色荧光, 从而将
表达kaede的细胞与GFP细胞分开。
3.5 光激活定位显微镜
在荧光显微镜中, 自然光光衍射极限是200 nm, 而
近来报道的一种新概念 , 即“受激发射损耗”
(stimulated emission depletion, STED), 它打破了光
学显微镜的衍射极限。STED是指先用激光进行激发,
然后立刻用秒级的强激光使其淬灭, 从而形成环状模
式, 在中心的荧光区域具有大约几十个纳米级的衍射
大小(陈文霞等, 2005; Betzig et al., 2006)。人们可借
助该方法, 利用可逆光激活荧光蛋白可以历经无数次
在暗态和荧光态之间转变的特点, 使较低光强下高分
辨率的活细胞成像。目前, 利用光激活荧光蛋白的特
性, 并结合高分辨率光镜技术发展起来的光激活定位
王锋等: 光激活荧光蛋白及其在植物分子细胞生物学研究中的应用 537
显微镜(或称光敏化定位显微镜, photoactivated lo-
calization microscopy, PALM), 对分子在纳米尺度
上的动力学参数等均能提供更加详细而精确的信息
(Lippincott-Schwartz and Patterson, 2009)。
依据PALM的应用特点 , 主要分为结构性的
PALM、多色标记PALM、活细胞PALM和单分子追踪
PALM等。结构性的PALM是指利用固定的细胞, 通过
以高密度(每平方微米>105个分子)揭示PAFP分子在
亚细胞结构上的分布(Betzig et al., 2006)。多色标记
PALM指在同一个样品中, 利用多种颜色的PAFP进
行标记成像。其中应用双色PALM, 如利用PA-GFP
和PAmCherry或者Dronpa/EosFP进行双重标记现已
成为现实(Shroff et al., 2007; Subach et al., 2009)。
活细胞PALM是利用活细胞进行光激活定位的显微
镜。目前随着PALM图像采集速度的加快、激发光功
率和探针亮度的改进等 , 活细胞PALM已成为可能
(Shroff et al., 2008)。单颗粒追踪PALM是指PALM技
术结合单颗粒追踪对PAFP标记的单个分子动态进行
成像观测和分析 , 或称 sptPALM(single particle
tracking PALM)。由于在传统的单分子追踪中, 要求
被标记的分子之间的间距要大于它们的衍射极限, 因
此追踪单分子的数目和密度就极为有限。如果通过激
活、定位和漂白不同亚细胞区域定位的光激活荧光蛋
白, 则可得到更多和更高密度单分子的动态信息。最
近, Manley等(2008)在COS7细胞系中, 利用全内反
射和高狭缝的物镜, 以较高的光强度激发光激活荧光
蛋白EosFP7(较高光子产率和较高对比度), 以及优
化的数据采集速率(以每秒20帧的速度, 该参数不会
对细胞活性造成明显的影响)对膜蛋白gag和VSVG进
行成像, 结果得到了数以千计的膜蛋白运动轨迹图,
从而在活细胞中成功地实现了sptPALM。由此可见,
应用该方法可得到比传统的单分子追踪高几个数量
级的分子轨迹信息, 同时在分子尺度上还可获得有关
细胞动态和局部环境等空间分辨率的信息。因此, 利
用sptPALM技术, 并通过研究分子动态的不同亚型,
可以为膜在时空分布上的异质性提供新的见解。
4 光激活荧光蛋白在植物分子细胞生物
学研究中的应用
目前, 荧光蛋白在植物分子与细胞生物学研究中的应
用极为广泛(黄国存等, 1998; 赵华等, 2003; 王宏和
林金星, 2004), 但在植物细胞生物学中的应用仍较
落后。2004年, Arimura等利用光激活荧光蛋白kaede
标记线粒体 δ-ATPase, 转化烟草 (Nicotiana ta-
bacum ‘Bright Yellow 2’)悬浮细胞和洋葱 (Allium
cepa)表皮细胞, 并用普通荧光显微镜进行局部的紫
外光照射, 从而诱导线粒体由绿色(green-kaede)变
为红色(red-kaede), 并随着时间的推移, 逐渐呈现出
大量黄色的线粒体。这一结果首次证实了在植物细胞
中线粒体也存在频繁的分裂融合事件(Arimura et al.,
2004)。
Runions等(2006)利用PA-GFP对内质网膜蛋白
的动态进行了分析。通过构建内质网膜标志蛋白
calnexin的跨膜区与PA-GFP的融合蛋白, 对转基因
植株的叶表皮细胞进行光激活实验, 分析内质网膜蛋
白的运动速率, 结合LatB解聚微丝表明其运动可能
受微丝骨架的调控。
Dhonukshe等(2007)将光激活荧光蛋白EosFP
与生长素外流载体PIN构建重组蛋白, 再用紫外光照
射后对重组蛋白进行局部标记, 结果发现该重组蛋白
能够在内吞小泡和质膜之间进行循环。如果利用抑制
剂抑制笼形蛋白 (clathrin), 也可使PIN的内吞被抑
制。由此证明, Clathrin介导了生长素外流载体PIN的
内吞。显然, EosFP的成熟温度小于30°C, 限制了它
在哺乳动物细胞中的应用, 但其在植物细胞中的应用
前景则相当广阔。
利用光激活荧光蛋白, 还可对分子的胞间运输
(比如胞间连丝等)和细胞通讯等方面进行研究。例如,
在烟草的表皮毛基部与其邻近的表皮细胞有大量胞
间连丝相互连接。Christensen等(2009)借助显微注射
方法向烟草表皮毛基部注射荧光探针, 结果发现, 荧
光探针并不能跨过胞间连丝向表皮毛基部邻近的表
皮细胞运输, 但如果向表皮细胞中注射荧光探针时,
荧光探针就可通过胞间连丝向表皮毛运输。最近 ,
Christensen等(2009)利用稳定转化PA-GFP的转基
因烟草同样证明了上述类似的结果, 即分子不能通过
胞间连丝从表皮毛向邻近表皮细胞运输, 这是由于从
表皮细胞通过胞间连丝向表皮毛的物质转运是一种
单向的转运过程。随着植物分子生物学和植物细胞转
导研究的不断深入, 同时借助于光激活荧光蛋白的独
特优势, 植物细胞生物学将会迎来更加广阔的发展
538 植物学报 45(5) 2010
空间。
5 前景与展望
利用光激活荧光蛋白能对较复杂的细胞学事件进行
检测和分析, 但目前能被应用的PAFP数目依然较少,
基因工程方法和分子进化策略将会被用于研发更多
具有不同颜色的单体型光激活荧光蛋白。随着成像技
术的进步, 荧光显微镜将可利用光谱成像和线性分离
的方法对单个细胞内的多种颜色进行成像。此外, 通
过研究表明, 除光照射以外, 极端的pH值和尿素等
也都可以诱导发色团在荧光态和暗态之间转换
(Verkhusha and Sorkin, 2005)。因此, 若将光激活荧
光蛋白与敏感结构域融合, 即能产生具有高灵敏度的
生物感受器, 然后通过对荧光信号变化的检测, 最终
将可实现胞内极低水平信号在时空上的可视化。
致谢 感谢中国科学院植物研究所胡玉熹研究员对
本文的斧正。
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Photoactivatable Fluorescent Proteins and Their Application in
Plant Molecular Cell Biology
Feng Wang1, 2, Chunyu Zhang1, 2, Lichuan Wan1, Qinli Wang1, Jinxing Lin1*
1Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China
2Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
Abstract Photoactivatable fluorescent proteins (PAFPs) undergo pronounced changes in fluorescent properties by
irradiation with specific light. These changes enable the spatial and temporal optical labelling and tracking of living cells,
organelles and intracellular molecules. Here we introduce the characteristics of known PAFPs and their potential applica-
tions from several aspects, including molecular labelling and dynamic analysis, protein-protein interaction, organelle and
cellular compartment dynamics, cell tracking, and recent use in photoactivated localization microscopy. We also discuss
the use of photoactivable fluorescent protein in plant molecular cell biology.
Key words molecular labelling, photoactivatable fluorescent proteins, protein-protein interaction, temporal and spatial
localization
Wang F, Zhang CY, Wan LC, Wang QL, Lin JX (2010). Photoactivatable fluorescent proteins and their application in
plant molecular cell biology. Chin Bull Bot 45, 530–540.
———————————————
* Author for correspondence. E-mail: linjx@ibcas.ac.cn
(责任编辑: 白羽红)