全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2011, 46 (6): 688–693, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2011.00688
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收稿日期: 2011-06-21; 接受日期: 2011-09-16
基金项目: 山东省自然科学基金(No.ZR2011CQ027)和山东农业大学青年科技创新基金(No.23696)
* 通讯作者。E-mail: jdzhang@sdau.edu.cn
核基质结合区在番茄转基因表达调控中的应用
孙爱清1, 葛淑娟2, 张杰道2*
1山东农业大学农学院, 泰安 271018
2山东农业大学生命科学学院, 作物生物学国家重点实验室, 山东省作物生物学重点实验室, 泰安 271018
摘要 核基质结合区(matrix attachment region, MAR)的应用是提高植物基因转化和表达效率的有效方法之一。将烟草
(Nicotiana tabacum)核基质结合区TM2构建在植物表达载体pBI121上报告基因GUSA表达盒和选择标记基因NPTII表达盒
的两侧翼, 利用农杆菌介导的子叶浸染转化番茄(Lycopersicon esculentum)。结果表明, MAR序列能够显著提高转基因植
株的转化效率和转基因的表达水平。不同长度的CaMV 35S启动子比较表明, TM2的调控活性依赖于启动子的存在, 并且具
有一定的功能重叠。热诱导型启动子的研究表明, TM2仅提高热诱导的表达强度, 而不改变启动子的热诱导表达调控特性。
TM2的表达调控特性符合转基因的表达要求, 该MAR序列可广泛应用于各种植物的基因工程中。
关键词 农杆菌转化, 核基质结合区, 番茄
孙爱清, 葛淑娟, 张杰道 (2011). 核基质结合区在番茄转基因表达调控中的应用. 植物学报 46, 688–693.
番茄(Lycopersicon esculentum)是植物抗逆基
因工程和基因表达调控研究的理想受体材料, 建立
高效遗传转化体系是转基因及其调控研究的基础。自
McCormick等(1986)报道番茄转化方法以来, 尽管已
有利用番茄叶片和果实进行转基因表达分析的报道,
但目前番茄转化仍以农杆菌介导的子叶转化法为主
(McCormick et al., 1986; Pozueta-Romero et al.,
2001; Wroblewski et al., 2005; Orzaez et al., 2006)。
对转化体系的研究也主要集中在培养基配方、农杆菌
遗传背景和浸染浓度、浸染时间等常规因素的调节方
面, 并存在转化效率相对较低和基因型依赖等缺陷
(Frary and Earle, 1996; Pozueta-Romero et al.,
2001; Park et al., 2003; Velcheva et al., 2005; Sun
et al., 2006)。转基因的表达调控对转化效率和基因的
表达水平有重要影响, 通过启动子改造和启动子串联
等方式可以提高基因的表达水平(Kay et al., 1987;
De Amicis et al., 2007)。但是, 启动子固有的调控能
力限制了转基因表达水平的有效提高, 寻找非启动子
的表达增强手段成为提高基因表达水平的另一种途
径。核基质结合区(matrix attachment region, MAR)
是一种染色体上能够与核基质结合的DNA序列, 可
以通过与核蛋白的结合影响染色体的结构及其基因
表达活性。目前已从病毒、微生物、植物、动物和人
基因组中分离和鉴定了大量MAR序列, 但能够在植
物基因组中表现出表达增强作用的只有RB7、ADH1
和CHN50等几个基因侧翼序列, 而且存在功能较弱
或方向性等缺点(Hall et al., 1991; Avramova et al.,
1995; Fukuda, 1999)。
TM2是从烟草(Nicotiana tabacum)基因组中筛
选出的一个MAR序列。前期的研究结果表明, 其在水
稻(Oryza sativa)和烟草植株的愈伤组织中具有显著
的表达增强作用(Xue et al., 2005; Zhang et al.,
2009)。本研究利用TM2序列改良植物表达载体, 通
过转基因番茄中的基因表达分析, 阐明此MAR序列
调控侧翼基因表达的作用特点, 以期为其在番茄基因
工程中的应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
以番茄栽培品种中蔬四号(Lycopersicon esculentum
Mill. ‘Zhongshu No.4’)为实验材料。植物双元表达载
·技术方法·
孙爱清等: 核基质结合区在番茄转基因表达调控中的应用 689
体pBI121(含有抗性选择标记NPTII基因和报告基因
GUSA)和农杆菌菌株LBA4404为实验室保存。限制性
内切酶、T4连接酶、MMLV和Taq聚合酶等主要化学
试剂购自TaKaRa公司。PCR引物由上海生工生物工
程公司合成。
1.2 载体构建
以pBI121(图1I)为基础载体, 构建含TM2 MAR序列
的重组表达载体。为研究TM2对侧翼基因表达水平
的调控作用, 将烟草核基质结合区TM2序列依次插
入NPTII表达盒启动子上游PmeI位点、GUSA表达
盒的NOS终止子下游EcoRI位点及两表达盒之间的
HindIII位点(图1II)。为确定TM2对基因表达调控的
影响是否存在依赖性, 用TM2取代GUSA基因表达盒
中的CaMV 35S启动子, 获得启动子缺失重组载体(图
1III)。为确定TM2序列与CaMV 35S的功能是否有重
叠, 将启动子的上游序列缺失, 仅保留下游的100 bp
序列, 在部分缺失启动子上游插入单端TM2序列(图
1IV)。为明确TM2序列对启动子诱导表达特性的影响,
用番茄热诱导型基因LeFtsh6启动子(PLeFtsh6)取代
CaMV 35S启动子, 获得诱导表达重组载体(图1V)。
1.3 农杆菌介导的番茄转化
农杆菌介导的子叶转化参照Park等(2003)的方法并
加以改进。番茄种子消毒后在MSB基本培养基(MS大
量, MS微量, 维生素B5, 15 g·L–1蔗糖)上萌发出苗。子
叶展开呈120°角时切下子叶柄端1.0 cm左右, 接种



图1 植物表达载体pBI121及其TM2重组载体的T-DNA结构

Figure 1 T-DNA constructs of plant expression vector
pBI121 and its recombination with TM2
到培养基(MSB, 30 g·L–1蔗糖, 1–2 mg·L–1ZT)上并预
培养1天。用OD600=0.5的农杆菌液浸染15分钟后, 转
移至含500 mg·L–1羧苄青霉素的恢复培养基上培养3
天。再转移至选择培养基上筛选分化抗性芽, 最后进
行生根移栽。
1.4 植物总DNA的提取和PCR鉴定
采用CTAB法(Miao et al., 2007)提取转基因植株叶片
的总DNA, 稀释适宜倍数后进行PCR鉴定。上游引物
为CaMV 35S启动子区序列 : 5′-CGCACAATCC-
CACTATCCTT-3′; 下游引物为GUSA基因编码区序
列: 5′-GAGCATTACGCTGCGATGG-3′。
1.5 总RNA提取及半定量RT-PCR分析
番茄叶片总RNA提取采用Trizol法(Invitrogen Co.)。
吸取2 μg总RNA, 用oligo(dT)18通用引物进行反转
录获得cDNA, 稀释适宜倍数后进行基因表达的半定
量RT-PCR分析。内参基因ACTINI的特异引物对为:
5′-CTTCAGTCCACAATCGGTGG-3′和5′-CATTCC-
GAGTTGAGCTGCTG-3′; GUSA基因的特异引物对
为: 5′-GAGGATCCCCGGGTGGTCAGTCCCT-3′和
5′-AAGAGCTCGAGCATTACGCTGCGATGG-3′。
NPTII基因的特异引物对为: 5′-GAACAAGATGGATT-
GCACGC-3′和5′-GAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3′。
1.6 转基因植株GUS基因表达的酶活测定
参考Jefferson等(1987)的方法, 以未转基因植株为对
照, 选取番茄转基因幼苗的第5–6片真叶, 用液氮研
磨成粉, 加入3倍体积提取缓冲液(0.05 mol·L–1磷酸
缓冲液(pH7.0), 0.01 mol·L–1EDTA, 0.1%β-巯基乙醇
(v/v), 0.1%Triton X-100(v/v), 0.1%Sarcosyl (m/v)),
调成匀浆。离心得上清液, 采用Bradford法测定蛋白
含量。吸取20–50 µL上清液进行GUS酶活的荧光测
定, 酶活力单位定义为每分钟水解4-MUG生成1 nmol
4-MU所需的酶量。选取转基因和对照植株各20株,
测定GUS的酶活性, 取平均值。
2 结果与讨论
2.1 植物改良表达载体的构建
将含PmeI、HindIII和EcoRI酶切黏性末端的TM2
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MAR序列依次插入pBI121载体的3个酶切位点, 获
得重组植物表达载体。提取质粒DNA, 利用PmeI、
HindIII和EcoRI 3种酶分别进行单酶切鉴定。电泳结
果表明, 3个MAR序列被成功引入3个酶切位点(图
2)。其它重组植物表达载体也通过HindIII或HindIII+
BamHI酶切鉴定。
2.2 TM2提高番茄转基因表达水平
摘取6叶龄烟草转基因植株第4片真叶测定GUS活
性。结果表明, TM2 MAR序列能够显著增强侧翼基
因的表达活性, 转基因植株群体GUS活性平均增至
对照(未转基因植株)的3.5倍(图3A)。分别取其中4


图2 含3个TM2序列的重组植物表达载体的酶切分析

Figure 2 Digestion analysis of plasmid DNA of recombinant
plant expression vector containing three TM2 MARs

个转基因植株进行半定量RT-PCR分析, 结果表明,
尽管单个植株之间的转录水平有差异 , 但含侧翼
TM2的转基因植株中GUSA基因的mRNA水平显著
提高, 说明GUS活性的提高发生在基因表达的转录
水平上(图3B)。
2.3 TM2提高番茄转化效率
农杆菌浸染的番茄子叶在共培养后, 转移到选择培
养基上筛选抗性愈伤组织, 分化出芽。结果表明, 改
良表达载体能够明显提高抗性愈伤组织及抗性芽的
获得率, 平均出愈率是对照的1.8倍, 独立转化系出
芽率是对照的2.3倍(图4A)。将10个转基因植株叶片
等量混合后半定量RT-PCR分析表明, 这种增强效
应主要来自MAR序列对抗性选择标记基因NPTII的
表达调控作用。正如TM2对GUSA基因的转录增强
作用, 转基因植株中MAR序列增强了NPTII的表达
水平(图4B), 大大降低了因NPTII表达水平低导致
的筛选过程中的假阴性率, 进而提高了抗性愈伤组
织和抗性芽的选择效率。
2.4 TM2的功能对启动子的依赖性
为了验证TM2的功能是否依赖于启动子的存在, 用
去除CaMV 35S启动子后的载体瞬时转化番茄叶
片。GUS酶活检测结果表明, TM2序列本身没有启
动子活性, 其表达增强功能是通过启动子发挥作用

图3 TM2对GUSA基因表达水平的影响
(A) 转基因植株叶片GUS活性测定; (B) 转基因植株叶片GUSA基因表达的半定量RT-PCR分析

Figure 3 The effect of TM2 on the expression level of GUSA gene
(A) The GUS activity assay of transgenic leaves; (B) The semi-quantitative RT-PCR assay of GUSA expression in
transgenic leaves
孙爱清等: 核基质结合区在番茄转基因表达调控中的应用 691


图4 TM2对抗性愈伤组织和抗性芽筛选(A)及NPTII基因表达(B)的影响

Figure 4 Effects of TM2 on selection of resistant callus and shoot regeneration (A) and NPTII gene expression (B)


的, 即TM2具有类似增强子的功能(图5)。在只保留
下游–100 bp长度的35S启动子(mini35S)时, 上游
TM2序列表现出更强的表达增强作用(图5)。说明启
动子上游序列也具有表达增强作用, 其功能与MAR
序列有部分冗余。
2.5 TM2不改变启动子的表达调控特性
用番茄热诱导型基因LeFtsh6启动子片段侧翼取代
CaMV 35S启动子, 对转基因植株进行37°C热激处



图5 TM2对CaMV 35S启动子的依赖性

Figure 5 The dependence of TM2 on the CaMV 35S
promoter



图6 TM2对LeFtsh6启动子(PLeFtsh6)热诱导调控特性的影响

Figure 6 Effect of TM2 on the heat inducible regulation
of LeFtsh6 promoter (PLeFtsh6)


理1.5小时, 然后测定GUS表达活性。结果表明, 高
温处理后, 含上游TM2的转基因植株其GUS活性水
平显著提高, 说明此MAR序列对诱导型启动子同样
具有表达增强作用; 另一方面, 无论是否插入侧翼
TM2序列 , LeFtsh6启动子(PLeFtsh6)调控GUS表
达水平都呈热诱导型表达(图6)。说明TM2不改变启
动子的基因表达调控特性。
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2.6 讨论
在转基因表达调控过程中, 除了获得基因的高水平表
达, 选择标记的高水平表达对于高频转化也很重要。
已有的研究表明, 尽管TM2在烟草和水稻转基因研究
中表现出双向表达调控特性, 但在启动子上游的作用
效果强于终止子下游, 即具有一定的距离效应(Xue
et al., 2005; Zhang et al., 2009)。我们在选择标记基
因NPTII表达盒和报告基因GUSA表达盒两侧翼分别
插入MAR序列, 同时获得了选择标记和报告基因的
高水平表达。一方面, NPTII基因的表达增强降低了转
基因植株筛选的假阴性率, 从而产生更高的转化效
率。另一方面, 在共转化后的选择培养过程中可以提
高选择压力, 进而提高获得高水平表达转基因植株的
效率, 减少后期筛选步骤。此外, 由于转化子抗性增
强, 转化细胞生长和分化速度加快, 转化周期缩短,
同时也减少了因长时间选择培养产生的玻璃化现象,
有效提高了抗性苗的移栽成活率。
不同MAR序列在方向性和启动子的选择性上具
有多样性。在番茄转基因植株中, TM2序列虽然能够
增强侧翼基因的表达, 但不能降低转基因植株间的表
达差异, 这暗示此MAR序列不能改变染色体上转基
因表达的位置效应。TM2序列对CaMV 35S组成型启
动子和PLeFtsh6热诱导型启动子的调控作用说明,
其对侧翼基因的表达调控作用仅表现在增强启动子
的调控水平上, 并不改变其调控特性, 这与此MAR在
烟草和水稻中对RB7根特异启动子的调控作用相似
(Xue et al., 2005)。这种调控特点使TM2在应用过程
中避免了干扰侧翼启动子表达调控特性的不利影响,
具有更广泛的适应性, 可以用于各种植物表达载体的
构建及基因工程。
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Use of Matrix Attachment Region in Regulating Transgene
Expression of Tomato
Aiqing Sun1, Shujuan Ge2, Jiedao Zhang2*
1College of Agronomy, Shandong Agricultural University, Taian 271018, China; 2 Shandong Provincial Key Laboratory of
Crop Biology, State Key Laboratory of Crop Science, College of Life Sciences, Shandong Agricultural
University, Taian 271018, China
Abstract Use of matrix attachment regions (MARs) is an important method to improve gene transformation and trans-
genic expression in plants. We constructed the TM2 MAR from tobacco at the flanking sides of the expression cassettes
of reporter gene GUSA and selective gene NPTII in a plant expression vector, pBI121. The recombinant constructs were
introduced into tomato plants by Agrobacterium-mediated cotyledon transformation. The transgenes were increasingly
transformed and expressed in the transformants. Comparison of the effect of TM2 on different lengths of CaMV 35S
promoter showed that the transcription enhancement of TM2 depended on the existence of promoter and showed par-
tial functional redundancy. The effect of TM2 on transcription regulated by heat-inducible promoter indicated that the MAR
did not change the regulation pattern but improved the expression level of the heat-inducible promoter. These character-
istics of TM2 MAR fulfill the regulation requirements for transgenic expression and can be widely used in diverse plant
biotechnology.
Key words Agrobacterium-mediated transformation, matrix attachment region, tomato
Sun AQ, Ge SJ, Zhang JD (2011). Use of matrix attachment region in regulating transgene expression of tomato. Chin
Bull Bot 46, 688–693.
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* Author for correspondence. E-mail: jdzhang@sdau.edu.cn
(责任编辑: 孙冬花)