全 文 ：食用菌学报２０１３．２０（１）：９～１２
收稿日期：２０１２－１２－０３原稿；２０１３－０１－０８修改稿
基金项目：福建省农业科学院青年创新基金项目（编号：２０１０ＱＢ－３）、省属公益类科研院所基本科研专项（编号：
２０１１Ｒ１０２２－３）的部分研究内容
作者简介：蔡志欣（１９８３－），男，２００９年毕业于福建农林大学微生物学专业，硕士，助理研究员，主要从事食用菌生
物信息学和分子生物学研究。
＊本文通讯作者　Ｅ－ｍａｉｌ：ｉｅｆ．ｆａａｓ＠１８９．ｃｎ
文章编号：１００５－９８７３（２０１３）０１－０００９－０４
农杆菌介导的双孢蘑菇菌丝转化技术探讨
蔡志欣，陈美元，廖剑华，李洪荣，郭仲杰，蔡丹凤，王泽生＊
（福建省农业科学院食用菌研究所，福建福州３５００１４）
摘　要：以双孢蘑菇（Ａｇａｒｉｃｕｓ　ｂｉｓｐｏｒｕｓ）Ａｓ２７９６液体培养菌丝为农杆菌转化受体，经潮霉素抗性平板筛选，共
获得１７个阳性转化子，对转化子进行外源插入基因的ＰＣＲ扩增验证。研究结果表明：以液体培养菌丝为受体
的农杆菌转化效率为８％～１０％，相比菌褶作为转化受体效率低，但该方法周期短，且能满足实验室的日常转
化需求。
关键词：双孢蘑菇；菌丝；液体培养；农杆菌转化
　　通过基因转化可改良食用菌品种，曾用在
双孢蘑菇（Ａｇａｒｉｃｕｓ　ｂｉｓｐｏｒｕｓ）上的有原生质体
法［１］、基因枪转化［２］、电击转化［３］和聚乙二醇介
导转化等［４］，但由于各自的缺点没有得到广泛
应用。
１９９８年，ＤＥ　ＧＲＯＯＴ等［５］首次将农杆菌介
导法应用于丝状真菌的遗传转化，并在双孢蘑
菇中转化成功，开启了其在双孢蘑菇上应用的
先河，但 转 化 效 率 非 常 低。２００１ 年，ＣＨＥＮ
等［６］成功地应用双孢蘑菇子实体菌褶作为农杆
菌侵染受体将转化效率提高到３０％。
２００４年，ＲＯＭＡＩＮＥ等［７］将转化效率提高
到７０％～８０％，并证明了子实体菌褶、菌盖和
菌柄作为受体转化效率之间没有显著差异。
陈美元等［８］应用此套转化方法成功地将耐热
相关基因０２８－１全长ｃＤＮＡ序列片段转化双
孢蘑菇菌株８２１３，提高了其耐热性。目前，以
子实体菌褶为受体的农杆菌介导转化法已成
为双孢蘑菇转化的常规方法，但该法使用新鲜
的子实体菌褶，需进行制种、栽培等过程，操作
周期比较长，给实验室的日常转化带来不便。
笔者采用新鲜培养的双孢蘑菇液体菌丝作为
农杆菌侵染受体，以期缩短双孢蘑菇农杆菌介
导转化的操作周期，并为其它食用蕈菌的遗传
转化提供借鉴。
１　材料与方法
１．１主要材料
　　双孢蘑菇（Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ）菌株 Ａｓ２７９６由福
建省农业科学院食用菌研究所提供。农杆菌
菌株 ＡＧＬ－ｐＢＨＧ （含有ｐＢＨＧ质粒）、农杆菌
菌株 ＡＧＬ－１由美国Ｓｙｌｖａｎ公司提供，保存于
福建省农业科学院食用菌研究所遗传育种研
究室。
１．２方法
　　农杆菌介导转化参考美国宾州大学的方
法［６］并作些改进。本研究受体材料为液体培养
的新鲜菌丝。包括以下步骤（需无菌操作）：
（１）挑选经卡那霉素抗性筛选、ＰＣＲ检测为
阳性的含ｐＢＨＧ质粒的农杆菌 ＡＧＬ－ｐＢＨＧ单
菌落，接种至５０ｍＬ含卡那霉素的 ＭＭ（基础培
养基）中 （试 剂 配 制 参 考 文 献 ［９］），２８℃、
１５０ｒ／ｍｉｎ摇瓶培养过夜；同时以 ＡＧＬ－１空菌为
阴性对照；
（２）当农杆菌细胞培养物 ＯＤ６００值达０．５～
０．８时，将菌液转入５０ｍＬ离心管中，６０００　ｇ，
４℃，离心５ｍｉｎ；弃上清，用２０ｍＬ　ＩＭ（诱导培养
基）（试剂配制参考文献［９］）重悬细胞；
（３）将乙酰丁香酮（４－羟基－３，５－二甲氧基苯
乙酮，ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ，Ａｓ）加入细胞悬液中，终浓
食　用　菌　学　报 第２０卷
度为２００μｍｏｌ／Ｌ；于室温振荡培养３～６ｈ，以诱
导ｖｉｒ区表达；
（４）将ＰＤ培养基（２００ｇ去皮马铃薯，２０ｇ葡
萄糖，１０００ｍＬ水，ｐＨ自然）静置培养的Ａｓ２７９６
菌丝（２４℃、避光培养约２０ｄ左右）用无菌镊子
挑取，放置到无菌培养皿里，用无菌手术刀去除
表面比较老的菌丝和菌皮等，将新鲜菌丝切成细
小块（约０．１ｃｍ×０．１ｃｍ，把细块加入经Ａｓ诱导
处理的农杆菌 ＡＧＬ－ｐＢＨＧ细胞悬浮液中（处理
组）和农杆菌 ＡＧＬ－１细胞悬浮液中（对照组）抽
真空至大部分菌丝块沉到瓶底；将细小块重新转
移到培养皿中，用镊子将细小块捏合为豆粒大小
（直径为０．３～０．５ｃｍ）的菌丝组织块（方便转
移）。将这些组织块转移到含有滤纸的共培养平
板上，２１℃培养４ｄ；
（５）潮霉素抗性平板初筛：将组织块转移到
初筛培养基（含３０μｇ／Ｌ的潮霉素）ＭＭＰ［含１％
麦芽膏，０．５％蛋白胨和１０ｍｍｏｌ／Ｌ　３－（Ｎ－吗啡
啉）丙磺酸，ｐＨ　７．０］平板上，２４℃培养２周；
（６）潮霉素抗性平板复筛：切下新生长的菌
丝块移植到复筛培养基（含５０μｇ／Ｌ的潮霉素）
ＭＭＰ平板上，２４℃培养２周；能够正常生长的
即为转化子，接种到常规ＰＤＡ斜面（ＰＤ培养基，
２０．０ｇ琼脂）进行培养和保存，并统计转化效率
（统计方法参考文献［１０］）。
１．３ＰＣＲ验证
　　ＰＣＲ 扩增体系：模板 ＤＮＡ　３０ｎｇ，引物
１３０ｎｇ，引物２３０ｎｇ，ｄＮＴＰｓ　０．１ｍｍｏｌ／Ｌ，ＭｇＣｌ２
２．５ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶１Ｕ，１×ＰＣＲ缓
冲液。扩增条件：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性
３０ｓ，６０℃退火３０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，扩增３５个
循环；７２ ℃延伸１０ｍｉｎ。扩增产物２０μＬ进行
１．５％ 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳。 荧 光 核 酸 染 料
（ＧｅｎｅＦｉｎｄｅｒ）染色并拍照。
２　结果与分析
　　按照上述实验方法对可能的转化子进行初
筛（图１），经含有ｐＢＨＧ 质粒的农杆菌 ＡＧＬ－
ｐＢＨＧ侵染转化的蘑菇菌丝能在含有５０μｇ／Ｌ
潮霉素的抗性平板上良好生长（图 ２），说明
ｐＢＨＧ质粒已经成功转入双孢蘑菇的基因组中，
其上面的潮霉素抗性基因已获得很好的表达。
经统计，本方法转化效率约为８％～１０％。
　　以引物ｇｐｄ－ＦＨ（５’－ＧＡＡＧＡＡＧＣＴＴＴＡＡ－
ＧＡＧＧＴＣＣＧＣ－３’）和 ｈｐｈ－Ｒ （５’－ＧＧＣＧＡＣＣ－
ＴＣＧＴＡＴＴＧＧＧＡＡＴＣ－３’）进行转化子的 ＰＣＲ
扩增，引物 Ｇｐｄ－ｆｈ和ｈｐｈ－Ｒ扩增潮霉素基因和
ＧＰＤ启动子片段，可以看出１０个转化子均可以
扩增出大小约１ｋｂ左右的片段（图３），扩增的
条带大小和预期的相符合，说明ｐＢＨＧ质粒已
经整合到双孢蘑菇的基因组中。
０１
第１期 蔡志欣，等：农杆菌介导的双孢蘑菇菌丝转化技术探讨
泳道１：阴性对照；泳道 ２～１１：１０ 个转化子的扩增图谱；
Ｍ：Ｌａｍｂｄａ　ＤＮＡ／ＥｃｏＲＩ＋ ＨｉｎｄＩＩＩ　Ｍａｒｋｅｒｓ
Ｌａｎｅ　１：ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ；ｌａｎｅｓ　２ｔｏ　１１：ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｏｆ　１０ｐｕｔａｔｉｖｅ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ；Ｌａｎｅ　Ｍ：ｌａｍｂｄａ　ＥｃｏＲＩ＋
ＨｉｎｄＩＩＩ　ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒｓ
图３　转化子的ＰＣＲ验证
Ｆｉｇ．３　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｏｆ　ｐｕｔａｔｉｖｅ
Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ
３　小结
　　本研究中，以液体培养的双孢蘑菇菌丝作为
农杆菌介导转化受体，其培养周期较短，只需要２
周左右，相比获得子实体菌褶的时间大大缩短。
该方法克服了农杆菌常规转化方法操作周期长
的缺点，且转化效率可以满足实验室日常双孢蘑
菇遗传转化的需求。在用液体培养的菌丝转化
的过程中，需把覆盖在表面的老化菌皮去掉，把
幼嫩的菌丝切碎并揉搓成菌丝小团，以保证用于
农杆菌侵染时含有足够的愈伤点和再生点，从而
保证液体菌丝转化效率。
采用液体培养的菌丝为转化受体相比以子
实体菌褶的转化效率低，可能原因为：子实体为
菌丝高度分化的产物，并非菌丝简单的堆叠累
加，其转化效率的不同原因之一为液体菌丝和菌
褶细胞壁结构的不同，在农杆菌侵染过程中农杆
菌需与宿主细胞的细胞壁结合，而这种结合是农
杆菌将外源ＤＮＡ转入宿主细胞的必要条件［１１］。
致谢：感谢美国Ｓｙｌｖａｎ公司 Ｍａｒｋ　Ｐ．Ｗａｃｈ博士赠
送ｐＢＨＧ质粒及农杆菌菌株ＡＧＬ－１。
参考文献
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ｂｉｓｐｏｒｕｓ：Ｔｈｅ　ｎｅｘｔ　ｆｒｏｎｔｉｅｒ［Ｃ］．Ｆｉｆｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
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Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，２００５，１２（ｓｕｐｐｌ）：１７４－１８４．
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代表大会暨全国第七届菌物学学术讨论会，２００８，
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［１０］ＲＯＭＡＩＮＥ　ＣＰ，ＣＨＥＮ　Ｘ，ＳＣＨＬＡＧＮＨＡＵＦＥＲ
Ｃ．Ｆｒｕｉｔｉｎｇ　ｂｏｄｙ　ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ａｇａｒｉｃｕｓ
ｂｉｓｐｏｒｕｓ　 ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ　 ｃｒｏｐ　 ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　 ａｎｄ
‘ｐｈａｒｍｉｎｉｎｇ’ ［Ｊ］． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ
Ｍｕｓｈｒｏｏｍ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４，１６（１）：１１７－１２４．
［１１］ＴＺＦＩＲＡ　Ｔ，ＣＩＴＯＶＳＫＹ　Ｖ．Ｔｈｅ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－
ｐｌａｎｔ　ｃｅｌ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｔａｋｉｎｇ　ｂｉｏｌｏｇｙ　ｌｅｓｓｏｎｓ　ｆｒｏｍ　ａ
ｂｕｇ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００３，１３３（３）：９４３－９４７．
１１
食　用　菌　学　报 第２０卷
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ
Ａｇａｒｉｃｕｓ　ｂｉｓｐｏｒｕｓ　Ｕｓｉｎｇ　Ｍｙｃｅｌｉａ　Ｇｒｏｗｎ
ｉｎ　Ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ　Ｃｕｌｔｕｒｅ
ＣＡＩ　Ｚｈｉｘｉｎ，ＣＨＥＮ　Ｍｅｉｙｕａｎ，ＬＩＡＯ　Ｊｉａｎｈｕａ，ＬＩ　Ｈｏｎｇｒｏｎｇ，ＧＵＯ　Ｚｈｏｎｇｊｉｅ，
ＣＡＩ　Ｄａｎｆｅｎｇ，ＷＡＮＧ　Ｚｅｓｈｅｎｇ＊
（Ｅｄｉｂｌｅ　Ｆｕｎｇｉ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｆｕｊｉａｎ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉａｎ　３５００１４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｇａｒｉｃｕｓ　ｂｉｓｐｏｒｕｓ　ｕｓｉｎｇ　ｍｙｃｅｌｉｕｍ　ｇｒｏｗｎ　ｉｎ　ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ
ｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｙｉｅｌｄｅｄ　ａ　ｔｏｔａｌ　ｏｆ　１７ｐｕｔａｔｉｖｅ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ　ｗｅｒｅ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　ｅｘｏｇｅｎｏｕｓｌｙ　ｉｎｓｅｒｔｅｄ　ｇｅｎｅ．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｗａｓ　８％－１０％，
ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｌｏｗｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ａｃｈｉｅｖｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｇｉｌ　ｔｉｓｓｕｅ　ｂｕｔ　ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ　ｈｉｇｈ　ｅｎｏｕｇｈ　ｔｏ　ｓａｔｉｓｆｙ　ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ
ａｎ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ　ｐｅｒｉｏｄ　ｗａｓ　ｓｈｏｒｔｅｒ　ｕｓｉｎｇ　ｍｙｃｅｌｉａ　ｇｒｏｗｎ　ｉｎ
ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ａｇａｒｉｃｕｓ　ｂｉｓｐｏｒｕｓ；ｆｕｎｇａｌ　ｍｙｃｅｌｉｕｍ；ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
［本文编辑］　马丹丹
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