全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2011, 46 (3): 331–337, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2011.00331
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收稿日期: 2010-12-07; 接受日期: 2011-02-14
基金项目: 国家科技支撑计划(No.2009BADB8B03-1)
* 通讯作者。E-mail: lugangzh@163.com
萝卜带柄子叶高频再生体系的建立
李海萍, 张鲁刚*, 张静, 茹磊, 刘学成, 孙希禄
西北农林科技大学园艺学院, 杨陵 712100
摘要 以11份萝卜(Raphanus sativus)基因型为材料进行子叶离体培养研究, 筛选出具有较高再生率的基因型进行实验,
考察基因型、外植体类型、激素配比和苗龄等因素对萝卜再生的影响。结果表明: 萝卜离体再生的最佳外植体为全子叶-叶
柄, 最适苗龄为4天, 最适培养基为MS+6 mg·L–16-BA+0.05 mg·L–1NAA, 再生率高达86.95%, 再生系数为1.80。该研究为
进行萝卜遗传转化实验奠定了良好基础。
关键词 离体再生, 萝卜, 6-BA, TDZ
李海萍, 张鲁刚, 张静, 茹磊, 刘学成, 孙希禄 (2011). 萝卜带柄子叶高频再生体系的建立. 植物学报 46, 331–337.
萝卜(Raphanus sativus)又名莱菔、芦菔, 隶属
十字花科萝卜属, 是能形成肥大肉质根的二年生草本
植物。作为一种蔬菜作物, 萝卜目前在我国南北各地
普遍栽培。我国有着丰富的萝卜种质资源, 随着生活
质量的提高, 人们对萝卜品质的要求也日益提高。为
了适应生产发展和社会需求, 迫切需要选育优质、抗
病、丰产的优良新品种。基因工程技术目前已在植物
育种中得到普遍应用, 建立一个高效的离体再生体系
对于利用基因工程技术进行遗传育种及育种亲本的
无性快繁是十分必要的。萝卜为再生顽拗型植物, 再
生频率普遍较低(徐文玲等, 2006), 因此建立萝卜的
高效再生体系已成为限制其基因转化的一个关键因
素。本实验以11个基因型的萝卜品种为试材, 对影响
其再生的若干因素进行研究, 旨在建立对萝卜具有较
广适应性的再生体系, 为利用生物技术进行育种工作
奠定基础。
1 植物材料
本实验所用11份萝卜(Raphanus sativus L.)材料由西
北农林科技大学园艺学院大白菜研究室提供。此11
份萝卜材料包括5份正常生长发育的材料(正常材料)
和6份败蕾材料。正常材料编号为Z1(日喀则1号大萝
卜)、Z2(青皮-6)、Z3(07Lb36-9)、Z4(07Lb39)和Z5
(07Lb53-4); 败蕾材料编号为B1(09L8)、B2(09L12)、
B3(A5-4-23)、B4(13-1)、B5(5-1)和B6(A1-3)。
2 培养基成分和培养条件
2.1 无菌苗的获得
挑选颗粒饱满的萝卜种子, 在超净工作台上用70%乙
醇处理1分钟, 再用6%次氯酸钠溶液处理15分钟, 无
菌水冲洗4–5遍 , 然后接种于1/2MS培养基 (含20
g·L–1蔗糖+7.5 g·L–1琼脂, pH 5.8)上。每个三角瓶中
接种10–15粒种子(图1A)。置于室温25°C、光照时间
为16 h·d–1、光照强度为2 000 lux条件下培养, 获得
无菌苗。
2.2 不定芽诱导
分别切取4–5天的无菌苗外植体(先横切再纵切分开2
片子叶后去除生长点), 接种于改良MS+5 mg·L–1
6-BA+0.2 mg·L–1NAA+0.75%琼脂+30 g·L–1蔗糖培
养基上(徐文玲等, 2006)(图1B)。在室温25°C、光照
时间为16 h·d–1、光照强度为2 000 lux条件下培养
15–20天后统计不定芽再生率及玻璃化情况, 筛选出
再生率较高的基因型。分别切取这些品种的外植体或
选取不同接种方式, 接种至相同成分的分化培养基
上, 筛选出萝卜再生的最佳外植体。然后筛选合适的
激素(6-BA、TDZ及NAA)组合和浓度配比。最后筛选
·技术方法·
332 植物学报 46(3) 2011


图1 萝卜材料Z3离体再生培养各阶段的生长状况
(A) 接种2天后发芽的萝卜种子; (B) 4天苗龄的外植体; (C) 6-BA与NAA组合诱导产生的不定芽; (D) TDZ与NAA组合诱导产生的不
定芽; (E) 通过绿色愈伤诱导产生的丛生芽; (F) 1/2MS+NAA诱导产生的不定根

Figure 1 The growth status of each stage in the regeneration culture process of the radish species Z3
(A) The radish seeds germinated two days after inoculation; (B) The explants with the seedling age of 4 days; (C) The adventi-
tious buds induced with 6-BA and NAA combination; (D) The adventitious buds induced with TDZ and NAA combination; (E) The
multiple shoots induced from the green calli; (F) The adventitious roots induced on 1/2MS medium+NAA


得出诱导萝卜不定芽再生的最适苗龄。
不定芽再生率=(形成再生芽的外植体数/接种的
外植体总数) ×100%
不定芽再生系数=再生不定芽数/再生外植体数
2.3 不定芽生根及植株移栽
将2–3 cm长的丛生不定芽切割成含有1–2个不定芽
的小块, 分别接入附加有不同浓度NAA和IBA的改良
1/2MS基本培养基上进行生根实验。对NAA和IBA的
生根效果进行对比或者二者配合使用, 筛选出最佳的
生根激素组合及最适浓度。
再生苗移栽至大田之前, 首先将三角瓶上的封口
膜去掉, 降低湿度并增加光照, 使苗的生长环境接近
于田间, 进行炼苗培养。2–3天后将苗移栽于营养钵
中, 置于炼苗室缓苗培养15天左右, 再移栽到大田,
30天后统计成活率。
3 结果与讨论
3.1 基因型对萝卜再生的影响
切取4天苗龄的带柄子叶接种在改良MS+5 mg·L–1
6-BA+0.2 mg·L–1NAA+0.75%琼脂+30 g·L–1蔗糖培
养基上, 2周后不定芽开始由子叶柄的基部长出。不同
基因型其不定芽分化率存在较大差异。由表1可以看
出, 供试的11个基因型萝卜品种中, 以萝卜败蕾材料
B2的不定芽再生率最高, 为64.33%; 再生率最低的
是萝卜败蕾材料B5, 只有1.73%。萝卜正常材料中Z3
的不定芽再生率较高, 为35.36%。通过基因型筛选实

李海萍等: 萝卜带柄子叶高频再生体系的建立 333
表1 不同基因型对萝卜子叶不定芽再生的影响
Table 1 Effect of different genotypes on adventitious shoot
regeneration from cotyledons of radish
Variety No. Germination
rate (%)
Regeneration
rate (%)
Regeneration
coefficient
B1 97 43.24b 1.29cd
B2 94 64.33a 1.62b
B3 14 25.00d 1.00d
B4 67 19.45de 1.23cd
B5 46 1.73h 1.00d
B6 23 15.39ef 1.13d
Z1 11 10.00fg 1.00d
Z2 97 5.41gh 1.00d
Z3 80 35.36c 1.51dc
Z4 95 22.98d 1.45bc
Z5 90 14.82ef 2.00a
同一列数据后不同小写字母表示差异达到显著水平(P<0.05)。
Different lowercase letters in the same column indicated the
significant difference at P<0.05.


验, 再生率较高的基因型为: B2>B1>Z3>Z4。对Z3和
B2进行后续实验。
3.2 外植体类型对萝卜再生的影响
以萝卜品种Z3和B2为材料进行外植体类型和接种方
式的筛选, 结果表明, 不同外植体类型和接种方式对
萝卜再生有较大影响。由表2可以看出, 2个材料呈现
相同的变化趋势, 均以全子叶-叶柄竖直插入时的再
生率为最高, 分别达到了59.26%和49.00%, 半子叶-
叶柄和无子叶-叶柄竖直插入时其次, 且二者之间无
显著差异。以子叶为外植体时基本没有再生。下胚轴
接种后大多向上卷曲, 基部产生少量绿色愈伤组织,
但只有极少部分产生再生芽, 再生系数为1.0。综合比
较得出全子叶-叶柄为萝卜再生的最佳外植体。
3.3 不同激素配比对萝卜再生的影响
3.3.1 6-BA和NAA组合对萝卜再生的影响
对材料Z3做激素配比筛选实验。结果表明, 此材料再
生能力较好, 并且玻璃化率也很低(基本在5%以内),
各处理中生根现象均很少见, 适合进行遗传转化研
究。由表3可知, 随着6-BA/NAA比值的增大, 不定芽
再生率呈现增加的趋势 , 再生系数也逐渐增大。
6-BA/NAA比值在60–120之间时不定芽再生率较高,
二者比值为120(即6 mg·L–16-BA和0.05 mg·L–1 NAA)
时再生率最高, 达到86.95%(图1C), 并且其玻璃化
率也很低, 只有1.35%。所以此组合比较适合诱导再
生芽。另外, 从结果也可看出, 当6-BA浓度固定为5
mg·L–1和6 mg·L–1时, 随着NAA浓度的增大, 玻璃化
率均呈现增加的趋势。

3.3.2 TDZ和NAA组合对萝卜再生的影响
对萝卜材料Z3进行TDZ和NAA组合实验。从表4可以
看出, 当NAA浓度为同一个水平时, 随着TDZ浓度从
0.1–3.0 mg·L–1逐渐增大, 再生率明显呈现先升高后
降低的趋势, 并且均在TDZ浓度为0.5 mg·L–1时达到
最大。当TDZ浓度为0.5 mg·L–1, NAA浓度为0.02
mg·L–1时再生率最高, 达到63.64%, 再生系数为


表2 外植体类型对萝卜不定芽再生的影响
Table 2 Effect of the type of explants on adventitious shoot regeneration of radish
Regeneration rate (%) Regeneration coefficient Treatment
No.
Explant types Inoculation methods
Z3 B2 Z3 B2
1 Half cotyledon with petiole Vertical insert 24.00b 33.22b 1.33a 1.52a
2 Entire cotyledon with petiole Vertical insert 59.26a 49.00a 1.22ab 1.29ab
3 Petiole Vertical insert 30.00b 31.56b 1.25ab 1.15ab
4 Cotyledon Put flatly with the front side 4.55d 0.00c 1.00b 0.00c
5 Cotyledon Put flatly with the reverse side 0.00e 0.00c 0.00c 0.00c
6 Hypocotyl Put flatly 17.86c 5.36c 1.00b 1.00bc
基本培养基为MS+5 mg·L–16-BA+0.2 mg·L–1NAA+0.75%琼脂+30 g·L–1蔗糖; 同一列数据后不同小写字母表示差异达到显著水平(P<0.05)。
The basic medium is MS+5 mg·L–16-BA+0.2 mg·L–1NAA+0.75%agar+30 g·L–1sucrose; The different lowercase letters in the same column
indicated the significant difference at P<0.05.


334 植物学报 46(3) 2011
表3 6-BA与NAA组合对萝卜子叶不定芽再生的影响
Table 3 Effect of the combination of 6-BA and NAA on adventitious shoot regeneration from cotyledons of radish
Treatment
No.
6-BA concentration
(mg·L–1)
NAA concentration
(mg·L–1)
6-BA/NAA Regeneration
rate (%)
Regeneration
coefficient
Vitrification rate
(%)
1 4 0.05 80 71.05b 1.53ab 4.76c
2 4 0.10 40 75.29b 1.34b 11.31b
3 4 0.20 20 57.22de 1.44b 4.76c
4 5 0.05 100 71.57b 1.61ab 0.00f
5 5 0.10 50 59.36cd 1.55ab 3.13d
6 5 0.20 25 51.90e 1.59ab 12.50a
7 6 0.05 120 86.95a 1.80a 1.35e
8 6 0.10 60 64.54c 1.62ab 2.94d
9 6 0.20 30 55.77de 1.54ab 3.13d
基本培养基为MS+0.75%琼脂+30 g·L–1蔗糖; 同一列数据后不同小写字母表示差异达到显著水平(P<0.05)。
The basic medium is MS+0.75%agar+30 g·L–1sucrose; The different lowercase letters in the same column indicated the significant dif-
ference at P<0.05.


表4 TDZ与NAA组合对萝卜子叶不定芽再生的影响
Table 4 Effect of the combination of TDZ and NAA on adventitious shoot regeneration from cotyledons of radish
Treatment No. TDZ concentration
(mg·L–1)
NAA concentration
(mg·L–1)
TDZ/NAA Regeneration rate
(%)
Regeneration
coefficient
1 0.1 0.02 5 24.00ghi 1.17b
2 0.5 0.02 25 63.64a 1.29ab
3 1.0 0.02 50 45.83b 1.36ab
4 2.0 0.02 100 36.00d 1.22b
5 3.0 0.02 150 26.92fg 1.57a
6 0.1 0.05 2 20.83i 1.20ab
7 0.5 0.05 10 41.67c 1.30ab
8 1.0 0.05 20 32.00e 1.25ab
9 2.0 0.05 40 26.92fg 1.29ab
10 3.0 0.05 60 23.08hi 1.33ab
11 0.1 0.10 1 25.00gh 1.33ab
12 0.5 0.10 5 44.00bc 1.36ab
13 1.0 0.10 10 29.17ef 1.14b
14 2.0 0.10 20 24.00ghi 1.17b
15 3.0 0.10 30 15.38j 1.25ab
基本培养基为MS+0.75%琼脂+30 g·L–1蔗糖; 同一列数据后不同小写字母表示差异达到显著水平(P<0.05)。
The basic medium is MS+0.75%agar+30 g·L–1sucrose; The different lowercase letters in the same column indicated the significant dif-
ference at P<0.05.

1.29(图1D)。其它14个处理的再生率都比较低, 不足
50%。进一步将上述结果与6-BA和NAA组合实验(表
3)进行对比, 发现TDZ对萝卜材料Z3的再生促进效果
不及6-BA好, 整体再生率都比较低, 再生系数也不
高。
3.4 苗龄对萝卜再生的影响
切取材料Z3、B2不同苗龄的外植体接种至添加激素
的分化培养基上, 15天后统计再生情况。从表5可知,
不同苗龄对萝卜再生有较大影响, 2个品种都呈现相
同的变化趋势: 二者均以种子接种后4天时切取外植
体为最佳苗龄, 再生率分别达到80.77%和62.96%;
之后随着苗龄的逐渐延长, 再生率都呈明显下降的趋
势。当苗龄延长至第9天时, 二者再生率分别降低至
6.67%和15.00%。此时子叶较大, 已经现出第1片真
叶, 并且叶柄很长(约8–10 mm), 外植体的再生能力

李海萍等: 萝卜带柄子叶高频再生体系的建立 335
表5 苗龄对萝卜子叶不定芽再生的影响
Table 5 Effect of the seedling age on adventitious shoot
regeneration from cotyledons of radish
Regeneration rate (%) Regeneration coefficient Seedling
age (d) Z3 B2 Z3 B2
4 80.77a 62.96a 1.62a 1.41b
5 56.67b 37.93b 1.71a 1.45b
6 38.46c 29.63c 1.40ab 1.50b
7 27.27d 22.22d 1.56ab 1.50b
8 13.33e 17.24e 1.25bc 1.40b
9 6.67f 15.00e 1.00c 2.00a
基本培养基为MS+6 mg·L–16-BA+0.05 mg·L–1NAA+0.75%琼脂
+30 g·L–1蔗糖; 同一列数据后不同小写字母表示差异达到显著水
平(P<0.05)。
The basic medium is MS+6 mg·L–16-BA+0.05 mg·L–1 NAA+0.75%
agar+30 g·L–1sucrose; The different lowercase letters in the same
column indicated the significant difference at P<0.05.


很弱, 不再适合有效诱导再生芽。
3.5 讨论
萝卜的再生能力较弱(熊秋芳等, 2006), 其再生能力
在不同基因型间差异较大(Matsubara and Hegazi,
1990; Pua et al., 1996; Takahata et al., 1996)。本实
验中11份萝卜材料各个基因型间再生率差异较大,
B2再生率最高(64.33%), B5再生率最低(1.73%), 二
者相差62.6%。这与崔群香等 (1999)和范爱丽等
(2009)认为基因型是决定再生频率的关键因素这一
研究结果相符。本研究进一步系统分析了各个因素对
萝卜再生的影响, 为萝卜正常材料Z3建立了高频再
生体系, 再生率高达86.95%, 再生系数为1.80, 为萝
卜转基因研究奠定了良好的基础。本研究在实验过程
中将萝卜材料分成2种类型: 正常材料和败蕾材料。
观察发现, 败蕾材料在离体再生过程中玻璃化现象比
较严重, 通过缩短继代培养时间和有效控制培养环境
条件可以在一定程度上降低其玻璃化率, 但是仍然影
响再生植株的获得, 所以关于有效降低败蕾萝卜材料
玻璃化率的问题还需要进一步研究解决。
萝卜离体培养出芽可以通过愈伤组织和直接出
芽2种途径, 采用组培快繁的方法可以高效快速地繁
殖亲本材料和珍贵种质资源(武剑等, 2003a)。龙雯虹
等(2006)通过实验研究发现: 诱导萝卜愈伤组织最适
合的外植体类型为子叶; 不同生长素的诱导效果不
同; 子叶和下胚轴为外植体诱导愈伤组织的最适培养
基一致, 但其结果只是愈伤组织诱导率达到50%以
上, 并且没有报道获得再生植株。申龙斌等(2010)用
单独的激素配比均不能够诱导出海马齿(Sesuvium
portulacastrum)愈伤组织, 只有在生长素与分裂素组
合使用时才能够有效诱导出愈伤组织。本研究通过各
种方法获得了大量的再生植株, 观察发现所选萝卜材
料大都是通过外植体基部先膨大产生少量绿色愈伤
组织后再长出丛生芽的。如果是叶柄基部直接诱导出
芽则一般只长1–2个芽, 而通过绿色愈伤组织诱导则
能产生2–5个丛生芽(图1E)。研究还发现, 接种后1周
左右如果不能产生绿色愈伤组织或者产生大量的白
色愈伤都不能有效诱导产生再生芽, 关于绿色愈伤组
织的有效诱导及产生机制有待进一步研究。
萝卜组培苗诱导的关键是诱导芽的分化和增殖。
诱导生芽的培养基一般是在MS培养基中添加6-BA、
NAA、IBA或AgNO3。诱导过程中不同基因型、添加
激素的种类与浓度对诱导效果影响很大。TDZ是人工
合成的苯基脲衍生物, 具有生长素和细胞分裂素双重
作用, 近年来已被广泛应用于植物组织培养的形态发
生中(徐晓峰和黄学林, 2003)。研究认为TDZ是一种
高效的生物调节剂, 在较低的浓度下才能发挥高活
性, 较高的浓度反而起到抑制作用。有研究者认为
TDZ与6-BA相比具有更高的活性 (Huetteman and
Preece, 1993; Guo et al., 2005)。但是本研究结果表
明 , TDZ对于萝卜材料Z3的再生促进效果并不及
6-BA好, 整体再生率都比较低, 再生系数也不高, 说
明对于此材料TDZ并不能有效促进其再生。TDZ对于
其它萝卜材料的效果是否相同还有待进一步验证。
外植体类型的选择是影响再生诱导效果的关键
因素之一。前人对萝卜再生的研究大多以子叶和下胚
轴为外植体, 所得结果也不尽相同。武剑等(2003b)
和徐文玲等(2006)的研究均表明带柄子叶为萝卜再
生的最佳外植体 , 此类型的最高再生率分别达到
20.61%和32.3%。龙雯虹等(2006)认为, 子叶诱导愈
伤组织的效果比下胚轴好, 是萝卜组织培养的较佳外
植体。然而此研究只是在诱导愈伤的水平上进行比较,
并没有报道进一步诱导产生不定芽和再生植株的情
况。黄翠等 (2010)对水杉 (Metasequoia glyptostr-
oboides)再生的研究发现, 种胚诱导愈伤组织的效果
最好, 诱导率达到100%。王辉等(2009)研究认为诱导
萝卜不定芽的外植体以带下胚轴的茎段为好。本实验
336 植物学报 46(3) 2011
在前人研究的基础上分析了子叶-叶柄、子叶和下胚
轴对萝卜2个材料再生的影响, 并且将子叶-叶柄细分
为全子叶-叶柄、半子叶-叶柄和无子叶-叶柄3种类型,
全部采用竖直插入接种方式; 将子叶细分为正面向上
和反面向上2种类型, 平放接种; 下胚轴平放接种。结
果表明, 全子叶-叶柄为最佳外植体, 其再生率明显
高于其它类型。这一结果与武剑等(2003b)和徐文玲
等(2006)的研究结果基本一致。
IBA和NAA作为具有生长素活性的植物生长调节
剂, 在植物的生根过程中起着很大的作用(胥宇建等,
2010)。IBA一般用于木本类材料的生根, NAA则用于
草本类材料的生根。本研究比较了NAA与IBA二者的
生根效果 , 发现当生长素浓度较低时生根率较高 ,
NAA比IBA更有利于萝卜再生苗生根, 而且主根粗壮,
须根明显, 根系比较发达(图1F), 移栽后容易成活。
这与武剑等(2003b)报道的NAA对萝卜再生苗生根比
IAA有效这一研究结果基本一致。
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Cell Rep 16, 163–166.

李海萍等: 萝卜带柄子叶高频再生体系的建立 337
Establishment of High-frequency Regeneration System from
Cotyledons with Petiole in Radish
Haiping Li, Lugang Zhang*, Jing Zhang, Lei Ru, Xuecheng Liu, Xilu Sun
College of Horticulture, Northwest Agriculture and Forestry University, Yangling 712100, China
Abstract We studied in vitro culture regeneration from cotyledons of 11 genotypes of radish. Those genotypes, which
have a high rate of regeneration, were used as the test materials for subsequent experiments of explant type, hormone
ratio, and seedling age. The regenerated plantlets, which generated roots well, were transplanted into the field. The entire
cotyledon with a petiole is the optimal regeneration explant. Four days of seedling age is suitable to induce adventitious
shoots. The maximum frequency of shoot regeneration was 86.95% obtained from cotyledons of Z3 in the medium Mur-
ishige and Skoog + 6 mg·L–1 6-BA + 0.05 mg·L–1 NAA, and the regeneration coefficient reached 1.80. These results set
the basis for radish genetic transformation.
Key words in vitro regeneration, radish, 6-BA, TDZ
Li HP, Zhang LG, Zhang J, Ru L, Liu XC, Sun XL (2011). Establishment of high-frequency regeneration system from
cotyledons with petiole in radish. Chin Bull Bot 46, 331–337.
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* Author for correspondence. E-mail: lugangzh@163.com
(责任编辑: 刘慧君)