全 文 ：植物学报Chinese Bulletin of Botany 2009, 44 (1): 52-58, w w w .chinbullbotany.com
收稿日期: 2008-06-22; 接受日期: 2008-06-26
基金项目: 国家自然科学基金(No. 30625002和No. 30628012)
†共同第一作者。
* 通讯作者。E-mail: qulj@pku.edu.cn
.研究论文.
拟南芥 MeIAA抗性突变体的筛选和初步图位克隆分析
侯仙慧 1 †, 丁茂予 1 †, 刘赛男 1 , 李林川 1 , 瞿礼嘉 1, 2 *
1北京大学生命科学学院, 北京大学 -耶鲁大学植物分子遗传和农业生物技术联合研究中心, 蛋白质工程和植物基因工程国家重点实验
室, 北京 100871; 2国家植物基因研究中心(北京) , 北京 100101
摘要 生长素是最重要的植物激素之一, 参与了植物生长发育的各个方面。植物体内游离的IAA是生长素的主要活性形式,
在IAA甲基转移酶1(IAMT1)的作用下, IAA可以转变为IAA甲酯 (MeIAA)。MeIAA本身没有活性, 在植物体内的MeIAA酯解酶作
用下可以重新转变为IAA。 MeIAA是非极性分子, 能够在植物体内自由扩散。利用MeIAA的这种特殊性质筛选突变体, 可以分
离到MeIAA代谢途径或者IAA途径中新的成分。我们对拟南芥种子进行EMS诱变, 通过观察黑暗下下胚轴的生长情况, 筛选
MeIAA的抗性突变体。我们成功分离到了8株可能的抗性突变体, 并对其中的一个Methyl -IAA resistant 1 (mir1) 突变体进行
了深入分析。MeIAA抗性突变体的筛选将为进一步了解MeIAA的代谢、IAA稳态调控和响应机理提供新的材料。
关键词 生长素, 图位克隆, MeIAA, 抗性突变体
侯仙慧 , 丁茂予 , 刘赛男 , 李林川 , 瞿礼嘉 (2009). 拟南芥 MeIA A抗性突变体的筛选和初步图位克隆分析. 植物学报 44, 52-58.
生长素(auxin)是由荷兰科学家 F. W. Went通过燕
麦胚芽鞘弯曲实验法 (Avena curvature test) 首次分离
出来的(Went, 1926)。随后人们提取并鉴定得到了第 1
种生长素—— 吲哚 -3-乙酸(IAA)。大量的实验表明 IAA
在高等植物中广泛存在 , 是植物体内主要的生长素
(Teale et al., 2006)。IAA 调控植物体内生长发育的许
多过程, 如促进侧根形成、维管组织分化、胚胎发育、
顶端优势及植物向性反应等(Woodward and Bartel,
2005a)。 生长素在体内主要通过色氨酸依赖途径进行生
物合成, 可以与糖、氨基酸、肽以及醇形成缀合物进
行贮存或运输, 也可以通过氧化失去激素活性 (Ljung et
al., 2001)。 生长素是一种极性分子, 是目前发现的唯一
需要极性运输的激素, PIN蛋白家族是主要的生长素输
出载体, 而 AUX1蛋白是生长素输入载体, PIN和AUX1
蛋白在细胞膜上具有不对称分布, 受到囊泡运输的调控
(Leyser, 2003; Hobbie, 2006)。 生长素信号转导主要
是由 SCFTI R1 介导的蛋白泛素降解途径, 高浓度的 IAA
促进其受体 TIR1和转录抑制因子 AUX/IAA家族蛋白的
结合而使AUX/IAA家族蛋白泛素化降解, 从而解除了对
转录因子ARF家族蛋白的转录抑制, 进而激活或者抑制
下游基因的表达 (Woodward and Bartel, 2005b; Tan
et al. , 2007)。
本实验室发现拟南芥 IAA carboxyl methylt ran-
sferase1(IAMT1)基因的一个功能获得性突变体iamt1-D
具有叶片上卷表型 (Qin et al. , 2005)。 当通过RNAi降
低 I A M T 1 的表达时, 转基因植株叶片下卷。而且,
IAMT1的表达在叶片发育过程中受到严格的时空调控。
叶片卷曲程度和 IAMT1表达水平相关表明, 生长素的稳
态调控对于扁平叶片的形成起重要作用 (Qi n et a l. ,
2005)。 在体外, IAMT1蛋白能够把 IAA转化为 IAA甲
酯 (MeIAA)。Li 等通过研究 auxin resistant 1 (aux1)
突变体对MeIAA、IAA和NAA的不同响应, 发现MeIAA
与其它 IAA 缀合物一样, 也是没有活性的。但是由于
MeIAA 是非极性的, 所以其进入细胞同NAA 一样不需
要载体协助 (Li et al. , 2008a)。MeIAA 的运动性暗示
它与 IAA糖、氨基酸缀合物不同, 不是作为贮存或者降
53侯仙慧等: 拟南芥 MeIAA抗性突变体的筛选和初步图位克隆分析
解的形式, 而是通过微调 IAA的分布, 从而影响植物发
育过程, 如叶片的形态等 (Li et al. , 2008a)。Yang等
研究表明MeIAA进入细胞后, 通过细胞内的一个或几个
可能的酯解酶酯解后重新转变为 IAA 起作用(Yang et
al., 2008)。他们鉴定了拟南芥AtMES17基因, 其编码
一个MeIAA酯解酶, 在体外该蛋白能够将MeIAA 转变
为 IAA。AtMES17的缺失突变体表现出对MeIAA的显
著抗性, 而过量表达 A t ME S 1 7 的转基因植株则对
MeIAA具有更强的敏感性, 同时这两种株系对 IAA的响
应正常 (Yang et al. , 2008)。
利用激素突变体来研究激素代谢及其分子机制已有
不少成功的范例, 突变体分析不仅可以对某一复杂生物
学过程提出合理的假设, 而且可更进一步精确找出研究
生理和发育问题的新方法。由于在黑暗下M eIA A 比
IAA具有更强的下胚轴抑制能力, 利用MeIAA筛选生长
素抗性突变体将更加简单易行。本实验通过筛选经
EMS诱变产生的拟南芥突变体种子, 外源施加一定浓度
的MeIAA, 在黑暗下观察下胚轴生长, 筛选对MeIAA具
有抗性的突变体, 并做进一步的遗传和基因定位分析, 为
深入了解 IAA的甲基化过程在 IAA信号转导和稳态调控
中的作用提供新的方法。
1 材料与方法
1.1 植物材料和培养条件
本研究中所用的拟南芥(Arabidopsis thaliana)除用于图
位克隆的为Landsberg (Ler) 野生型外, 其余的都为Co-
lumbia (Col-0) 背景。处理方法和培养条件见 Li 等论
文 (Li et al., 2008b)。
1.2 EM S诱变
将 2.5 g拟南芥种子均分在 2个 50 mL的 Falcon试管
中, 加入 40 mL去离子水室温过夜。向每个试管中加
入 120 mL EMS (Sigma), 使 EMS终浓度为 0.3%。在
通风橱内翻转摇匀 15个小时。再用 40 mL去离子水漂
洗种子6次以上, 最后将种子用0.1% 琼脂均匀悬浮, 铺
在约 20个培养箱中。单箱收获得到 M2代种子, 编号,
室温保存。
1.3 M eIAA抗性突变体的筛选
将表面消毒后的种子点播在含有 2.5 mmol.L-1 MeIAA
(Sigma)的MS 培养基上, 用锡箔纸包裹避光。4°C春
化 2天, 然后放入22°C培养箱中培养 4天, 挑取下胚轴
长度远远超过平均值的小苗(图1), 转移到MS培养基上,
恢复培养 5天, 再转移到土中。一个月后单收种子, 在
MeIAA 培养基上鉴定该抗性是否可以遗传。
1.4 突变体温度转移实验
将种子表面消毒后, 铺在MS 培养基上, 4°C春化 2天,
然后转到 22°C, 水平萌发 3天。转移大约 20棵小苗到
新的MS 平板上, 共转移 2块。将其中一块仍然放在
22°C条件下, 另一块转至 29°C, 垂直培养 3天。比较
2个生长条件下的植株下胚轴长度, 并统计。
1.5 图位克隆
图位克隆(map-based cloning)参考 Lukowitz 等(2000)
描述的方法。实验中所用Mark er 均来自拟南芥网站
(www.arabidopsis .org)。
2 结果与分析
2.1 Me IAA抗性突变体筛选条件的确定
在进行大规模突变体筛选之前, 我们首先比较了 IAA和
MeIAA对黑暗下生长的拟南芥幼苗的下胚轴抑制程度。
在 0.1-25 mmol.L-1浓度范围内, 随着激素浓度的升高,
IAA和MeIAA对下胚轴的抑制程度都增强, 但是MeIAA
的抑制能力更强, 两者在 2.5-10 mmol.L-1范围内差异
最为显著(图 1A)。在 2.5 mmol.L-1 MeIAA 浓度下, 拟
南芥幼苗下胚轴长约为 MS 培养基上的 10%。在大于
2.5 mmol.L-1的浓度下, MeIAA对下胚轴的抑制程度随
浓度变化很小(图 1A )。综合上述两种现象, 我们选取
2.5 mmol.L-1的MeIAA处理经EMS诱变的M1代种子
进行筛选。
野生型幼苗在 2.5 mmol.L-1 MeIAA 培养基上暗培
54 植物学报 44(1) 2009
养3天后, 下胚轴和主根生长几乎完全被抑制, 顶端钩消
失(图 1B )。将下胚轴长至少为野生型 2倍以上的幼苗
定义为候选MeIAA 抗性突变体(candidate MeIAA re-
s is tant mutants)。通过这种方法, 总共得到了约 150
个候选突变体单株。然后将候选突变体转移到培养箱
中, 单株收种子后, 重新在 2.5 mmol.L-1 MeIAA培养基
上暗处理 3天, 验证其对 MeIAA 抗性表型是否可以遗
传。最终共得到 8株MeIAA 抗性突变体, 其中mir1、
mir2、mir3和mir4如图 1B 所示。mir1、mir2和mir3
的下胚轴和主根对MeIAA具有很强的抗性, 而mir4仅
在下胚轴对MeIAA 具有中度抗性(图 1B)。
2.2 部分Me IAA抗性突变体对IAA也具有抗性
由于MeIAA是 IAA的非活性形式, 需要在体内的酯解酶
作用下重新转变为 IAA起作用 (Li et al., 2008a; Yang
et al., 2008)。那么, MeIAA 抗性突变体绝大部分都应
表现出对 IAA 的抗性。和预期相一致, mir1、mir2和
m i r 3 等在光下对 I A A 也表现出了一定程度的抗性
(图 2A)。有趣的是, mir4在光下并没有显示出对 IAA的
抗性(数据未显示), 推测它与 mir1、mir2及mir3等具
有不同的抗性机制。
拟南芥幼苗从正常温度(22°C)转移到高温下(29°C)
生长时, 下胚轴会比正常条件下显著伸长 (Gray et al.,
1998)。进一步研究发现该现象主要是由于下胚轴中生
长素的含量提高造成的, 而且该现象是生长素特异的反
应。当突变体生长素稳态调控或信号通路出现缺陷时,
其下胚轴不能伸长 (Gray et al. , 1998)。 将野生型拟南
芥和MeIAA抗性突变体同时在22°C和29°C下培养, 在
29°C下, WT的下胚轴长度是 22°C下的 2倍左右, 而
mir1、mir2和mir3的下胚轴没有明显的伸长(图2B), 暗
示其体内生长素途径出现缺陷。然而, mir4的下胚轴能
够正常响应高温变化, 进一步暗示其抗性机制和其它突
变体不同。
2.3 mir1突变体的表型和遗传学分析
挑取mir1突变体作进一步表型分析。在 2.5 mmol.L-1
图 1 MeIA A抗性突变体的获得
(A) 黑暗下 IA A和MeIA A对拟南芥幼苗下胚轴抑制曲线; (B) MeIA A抗性突变体
Figur e 1 Isolation of candidate MeIAA res istant mutants
(A) Inhibitory curvature of hypocotyls by IA A and MeIAA in the dark; (B) MeIA A resistant mutants, mir1, mir2, mir3 and mi r4
55侯仙慧等: 拟南芥 MeIAA抗性突变体的筛选和初步图位克隆分析
图 2 MeIA A抗性突变体生长素相关表型分析
(A) MeIA A抗性突变体同样具有对 IA A的抗性; (B) MeIA A突变体下胚轴在不同温度下的伸长情况
Figur e 2 Aux in related phenotypes of MeIAA res istant mutants
(A) MeIAA res is tant mutants also show res is tance to IAA ; (B) Hypocotyl elongation of MeIAA res is tant mutants at diff erent
temperatures
MeIAA培养基上黑暗下处理 3天后, mir1突变体的下胚
轴和主根表现出显著的抗性(图 3A)。有趣的是, mir1突
变体在MS 培养基上黑暗下培养 3天后, 下胚轴比野生
型短, 顶端钩消失(图 3B)。在光下, mir1突变体的子叶
稍微上卷(图 3C) , 侧根数目显著少于野生型(图 3D)。
mir1突变体成株表现出叶柄短, 叶片上卷(图 3E), 而且
植株矮化, 分枝数多于野生型, 但花和角果正常(图 3F)。
为了研究mir1突变的分子本质, 我们对mir1突变体
进行了深入的遗传学分析。首先将mir1和 Col-0进行
回交, F1代幼苗在MeIAA培养基上出现了抗性和感性的
分离, 而且分离比例约为 1:1 (表 1), 暗示该突变是由一
个显性单基因控制的。同样的结果也出现在mir1和Ler
杂交的 F1代中(表 1)。单收mir1和 Ler杂交的 F1代种
子, 点播后观察 F2代的分离比, 发现抗性和感性植株的
分离比约为 3:1(表1), 进一步暗示mir1突变是由显性单
基因突变所致。
2.4 mir1突变体的初步图位克隆
我们利用图位克隆方法对mir1突变进行基因定位。提
取突变体和Ler杂交F2代中的野生型表型苗的DNA, 利
用 TAIR网站上的引物(marker)信息, 进行初定位(first -
pass cloning)。经过初定位, 发现mir1突变与第 1条
染色体上端Marker nga63具有明显连锁, 重组率约为
15%; 在 nga63两端分别设计引物进一步定位, 发现突
变位点可能处于更靠近染色体顶端的 2 个 M a r k e r
NF21B7和 NT1G11之间。这一位置具有已知的 4个
表 1 mir1突变体遗传学分析
Table 1 Genetic segregation of MeIA A resistance in mi r1
No. of plants
Cross Resis tant Sensitive Total X20. 95
mir1 × Col-0 (F1) 22 26 48 －
mir1 × Ler (F1) 32 30 62 －
mir1 × Ler (F2) 278 98 376 0.23 (3:1)
56 植物学报 44(1) 2009
图 3 mir1表型分析
(A) 黑暗下在含有 2.5 mmol.L-1 MeIA A的培养基上生长 3天的野
生型和mir1的表型;
(B) 黑暗下在MS培养基上生长 3天的野生型和mir1的表型;
(C) 光下在MS培养基上生长 7天的野生型和mir1的表型;
(D) 2周大小的野生型和mi r1的侧根表型;
(E) 4周大小的野生型和mi r1的叶片表型;
(F) 6周大小的野生型和mi r1的整体植株表型
Bar = 5 mm
Figur e 3 Phenotypes of mi r1
(A) WT and mi r1 grew on 2.5 mmol.L-1 MeIA A for 3 d in the
dark;
(B) WT and mir1 grew on MS for 3 d in the dark;
(C) WT and mir1 grew on MS for 7 d in the light;
(D) Lateral root phenotypes of WT and mir1 of tw o w eeks old;
(E) Leaf phenotypes of WT and mi r1 of four w eeks old;
(F) Whole plant phenotypes of WT and mi r1 of six w eeks old
Bar = 5 mm
图 4 mir1在第 1条染色体上端的初定位信息
图中由上至下依次标明所用Marker的名称, 染色体序号, 各Marker距该染色体最上端的物理距离, 各Marker 对应位置发生重组的植株
数目及相应所检测染色体的数目, 最下方线段表示推测的突变位点所在位置。
Figur e 4 Primary mapping for mir1 on Chromosome I
The supposed mapping posit ion of mir1 is based on the recombinant No. of each marker on the Chromosome I.
57侯仙慧等: 拟南芥 MeIAA抗性突变体的筛选和初步图位克隆分析
Aux/ IA A 基因, 分别是 I AA 3、I AA 10、I AA 12 和
I A A 17。我们将通过进一步精细定位和测序确定突
变位点。
3 讨论
对于大规模的筛选工作, 筛选方法是突变体筛选成败的
关键。越是专一的筛选条件, 就越有机会直接获得所期
待的突变体。常用的方法有正筛选和负筛选。正筛选
是设计一定的培养基或培养条件, 使得野生型不可以生
长但突变体能生长; 而负筛选是野生型可以生长但突变
体不能生长。正筛选通常得到的是抗性突变体, 而负筛
选通常得到超敏感突变体。本研究中我们通过正筛选
方法成功得到了MeIAA 抗性突变体。该方法的 2个关
键点是M eIA A 的浓度和筛选指标的确定。通过绘制
MeIAA和 IAA 黑暗下对野生型幼苗下胚轴的抑制曲线,
我们确定了 2.5 mmol.L-1是MeIAA和 IAA 在区分度和
对下胚轴的抑制程度上最佳的选择浓度。下胚轴长短
这一筛选指标, 简单易行, 为我们大规模筛选突变体带来
很大方便, 能够满足饱和筛选的条件。
MeIAA是在 IAA羧甲基转移酶1 (IAMT1)的作用下
由 IAA甲酯化生成(Qin et al., 2005), 是非极性的 IAA
缀合物, 能够在体内自由扩散。同时, MeIAA是一种非
活性的 IAA形式, 需要通过体内1个或多个MeIAA酯解
酶的作用重新转变为 IAA (Yang et al. , 2008)。这两
个性质导致MeIAA 具有不同于 IAA 以及 IAA 的其它缀
合物的化学特性(Li et al., 2008a), 所以用MeIAA来筛
选抗性突变体具有比 IAA更大的优势。首先, MeIAA可
以自由扩散, 所以筛选中能够排除部分生长素极性运输
的影响, 得到的突变体可能仅与生长素的信号相关。另
一方面, 在黑暗下, Me IAA 对下胚轴的抑制程度强于
IAA, 在 IAA筛选中的弱抗性突变体可能在MeIAA上表
型更加明显, 所以通过MeIAA筛选能够得到原来很难分
离到的生长素信号突变体。此外, Me IAA 代谢相关基
因的突变也有可能通过这种方法得到。
在分离到的 8个突变体中, mir1、mir2和mir3对
MeIAA和 IAA都表现出抗性, 暗示这3个突变体应该是
普通的生长素抗性突变体。mir1突变体具有明显的生
长素相关发育缺陷, 如顶端钩消失、侧根少、叶片上
卷表型。图位克隆分析表明, mir1突变定位在第 1条染
色体上端的NT1G11 Marker附近。而在这个Marker
附近集中了 IAA3、IAA10、IAA12和 IAA 17 4个典
型的Aux/IAA基因 (Leyser et al., 1996; Tian and Reed,
1999; Hamann et al., 2002)。 根据mir1的叶片表型
和这些基因的已有报道相比较, 推测mir1可能是 IAA3
的突变。进一步的测序和遗传学鉴定工作正在进行
中。而mir4突变体具有对MeIAA 特异抗性, 而且这种
抗性只特异地出现在下胚轴, 暗示该突变可能是MeIAA
特异突变, 为我们揭示MeIAA代谢和活性调控提供了良
好的材料。
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Ge ne Rese arch Center (Bei jin g), Bei jin g 1 001 01, Chi na
Abs tr act A uxin is one of the most impor tant plant hormones in that it regulates almos t all aspects of plant grow th and
development. In plants , f ree indole-3-acetic acid ( IAA) is the major ac tive auxin and can be converted to methyl-IAA (MeIAA) w ith
the activity of an IAA carboxyl methyltransferase 1 (IAMT1). How ever , MeIAA is also an inactive form of IAA and can be conver ted
to IA A catalyzed by several es terases. MeIA A is a non-polar IAA form and can dif fuse betw een cells, so MeIAA is suitable f or
sc reening new components in MeIA A metabolism or IAA biology . Here, w e screened ethyl-methane-sulphonate (EMS)-mutagens is
seedlings on MeIAA medium in the dark, w ith longer hypocoty ls used as a criterion. We isolated 8 putative MeIAA -res istant mutants
and car ried out further exper iments on one mutant, mi r1. These new mutants w ill help shed light on MeIA A metabolism and the
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* Author for correspondence. E-mail: qulj@pku.edu.cn
(责任编辑: 刘慧君)
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