全 文 ：　林业科技开发　2009年第 23卷第 6期 87　
随着热压压力的增加 ,杨木细胞会被压溃 ,堵塞
导管 ,因此会影响浸渍其中的竹炭 /TiO2复合体的光
催化活性。结合正交试验所得出的最佳工艺中热压
压力的选值 ,确定热压压力为 1.2MPa,浸渍压力为
1.6MPa。
由图 1可知 ,当涂胶量为 250 g/m2时 ,胶合强度
达到最大 ,而且 ,通过方差分析 ,涂胶量对胶合强度的
影响不显著 ,从降低甲醛释放量和降低原材料的成本
考虑 ,结合方差分析中所得最佳工艺中涂胶量的选
值 ,涂胶量200g/m2也能满足胶合强度指标的要求。
3　结　论
竹炭 /TiO2复合体改性杨木单板压制的胶合板
是一种新型人造板材 ,本研究采用正交试验法对这种
新材料的胶合强度进行了研究 ,有关结论如下:
(1)热压压力和浸渍压力对胶合强度的影响分
别在0.1水平和 0.05水平显著;而涂胶量对胶合强度
的影响不显著。
(2)压制木基纳米复合材料的最佳工艺条件是:
热压压力为 1.2MPa, 涂胶量 250 g/m2 , 浸渍压力
1.6MPa。
(3)选用杨木素板和经竹炭 /TiO2复合体浸渍处
理的杨木单板按照上述最佳工艺参数运用相同的组
坯方式 ,平行压制成 3层胶合板。结果显示:杨木素
板压制的胶合板的胶合强度平均值为 1.129MPa,经
竹炭 /TiO2复合体浸渍处理的杨木单板压制的胶合
板的胶合强度平均值为 0.903Pa,仍然超过国家标准
(GB/T9846.3-2004)规定的0.7 MPa的最低要求 。
参考文献
[ 1]于文吉 , 关丽丽 , 吴大为.科技进步与创新是我国人造板工业可
持续发展的重要保障 [ J] .中国人造板 , 2009(4):1-5.
[ 2]周雄志 , 雷得定.环保 、成本与功能:论我国人造板企业发展的技
术路径 [ J] .2007, 21(2):44-46.
[ 3] HoffmanMR, MartinST, ChoiW, etal.Environmentalapplications
ofsemiconductorphotocatalysis[ J] .ChemRev, 1995, 95:69-96.
[ 4]封跃鹏 , 张太生.室内污染概述 [ J] .环境监测管理与技术 , 2002
(3):17-20.
[ 5]朱明华.室内装修空气污染的危害及防治措施 [ J] .能源环境保
护 , 2006(8):20-26.
[ 6]徐慧娟.光催化剂 TiO2 的发展与应用 [ J].廊坊师范学院学报 ,
2009, 9(1):77-82.
(责任编辑　葛华忠)
高效毛细管电泳技术检测加杨芽生长素
范文 ,李媛 ,陈媛梅＊
(北京林业大学理学院 ,北京 100083)
摘　要:建立了高效毛细管电泳技术检测加杨芽中生长素含量的方法。对加杨芽生长素的提取 、分离 、纯化的方
法进行了探索和优化 ,测得加杨芽生长素含量为 81 ng/g, 回收率为70.52%。
关键词:加杨芽;高效毛细管电泳;分离纯化;生长素
DeterminationofAuxinintheBudofPopuluscanadensisbyHighPerformanceCapilaryElectrophore-
sis∥FANWen, LIYuan, CHENYuan-mei
Abstract:AmethodtodetectthecontentoftheauxininPopuluscanadensisbudwasestablishedbyhighperformancecapil-
laryelectrophoresis(HPCE)inthisstudy.Basedontheoptimizationofextraction, separationandpurificationoftheauxin
inthebud, thecontentoftheauxinwasdeterminedas81 ng/gwitha70.52% ofrecovery.
Keywords:Populuscanadensisbud;Highperformancecapillaryelectrophoresis;Separationandpurification;Auxin
Author saddress:CollegeofScience, BeijingForestryUniversity, 100083Beijing, China
收稿日期:2009-07-16　　　　修回日期:2009-08-30
第一作者简介:范文(1983-),男 ,硕士 ,研究方向为生物大分子结构
与物理化学研究。通讯作者:陈媛梅 ,女 , 副教授。 E-mail:chym11@
bjfu.edu.cn
　　杨树是杨柳科杨属植物的通称 ,主要分布于北温
带 。杨树分为 5个派:胡杨派 、白杨派 、青杨派 、黑杨
派 、大叶杨派 [ 1] 。加杨(Populuscanadensis)是美洲黑
杨和欧洲黑杨的杂交种 ,属黑杨派。生长素在杨树的
生长发育过程中起着重要的生理作用 ,能够促进次生
韧皮部 、形成层 、维管射线及髓部组织分化 。杨树芽
是生长素类物质较为集中的部位 ,朱永亮等以南方型
美洲黑杨为材料 ,用高效液相色谱结合生物鉴定法 ,
　技术开发
88　 林业科技开发　2009年第 23卷第 6期
分析了不同时间顶芽内激素活性及含量的变化情
况 [ 2] 。陈雪梅等用高效液相色谱和气相色谱法 ,分析
了银白杨 、毛白杨和山杨芽中内源激素的含量[ 3] 。
高效毛细管电泳(highperformancecapilaryelec-
trophoresis, HPCE)是近年来发展起来的一种分离 、分
析技术 ,它是凝胶电泳技术的发展。该技术可分析的
成分小至有机分子 ,大至生物大分子如蛋白质 、核酸
等 ,也可用于一次性分析多种激素。 HPCE分析具有
高效 、快速 、微量 [ 4]等特点。
本文对加杨芽中生长素的提取 、分离和纯化的方
法进行了探索和优化 ,用高效毛细管电泳仪测定了加
杨芽生长素的含量 ,取得了有价值的结果 。
1　材料与方法
1.1　实验仪器
1229型高效毛细管电泳仪及 UV检测器(北京
宾达英创科技有限公司);40 cm长(有效长度 30cm)
的熔融石英毛细管 , 50 μm内径(邯郸市鑫诺光纤色
谱有限公司);AR2140分析天平(美国 Ohaus公司);
Sep-PakC18小柱(美国 Waters公司);(郑州长城科
工贸有限公司);CT-6023型笔式 pH计(深圳市科迪
达有限公司)。
1.2　试剂与材料
试剂:硼砂 、葡萄糖 、乙酸乙酯 、盐酸 、氢氧化钠 、
碳酸氢钠 、不溶性聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、十二烷基
硫酸钠(SDS), 2, 6-二叔丁基 -4-甲基苯酚(BHT),
均为分析纯 。吲哚乙酸 ,甲醇 ,均为优级纯 。
材料:采集自北京林业大学校内 3月未萌动的加
杨芽 ,分别采自梢部 、中部 、基部 ,每个样品采自 3棵
加杨树 。将采集的杨树芽除杂后 ,立即用液氮快速冷
冻 ,并在冰箱内低温储存。
1.3　绘制标准曲线
准确称取吲哚乙酸 (IAA)对照品 10 mg, 置于
100mL容量瓶中 ,用 40%甲醇醋酸混合溶液溶解并
定容 ,摇匀 ,配成浓度为 100 mg/L的标准溶液 ,经微
孔滤膜过滤 。准确吸取 IAA标准溶液 1.00、2.00、
3.00、4.00、 5.00 mL, 分别置于 10 mL容量瓶中 , 用
40%甲醇醋酸混合溶液配成 5种不同浓度的标准溶
液 ,供高效毛细管电泳仪测定 ,得到色谱图(见图 1)。
根据色谱图计算出 HPCE图谱中 IAA的峰面
积 。以 IAA峰面积为纵坐标 , IAA的浓度(mg/L)为
横坐标 ,绘制标准曲线(见图 2)。
1.4　加杨芽的前处理与浸提
准确称取加杨芽 2.0 g(精确到 0.1 mg),将样品
与 2, 6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT,一种抗氧化剂)
5 mg一起冰冻研磨 ,加入预冷的体积分数为 80%甲醇
20 mL,在 4℃下浸提16h,在此过程中不断搅拌 。然
后 ,在4 ℃下高速离心10min,倒出上清液 ,再加入甲
醇 20mL浸提 , 在相同条件离心 ,重复 2次 , 合并上
清液。
1.5　提取液的分离与纯化
经反复试验摸索 ,得到下列最佳方案:
(1)减压浓缩:将甲醇上清液在旋转浓缩器中在
40℃减压浓缩得水溶液 ,过滤去除油状物质 。
(2)石油醚去酯:取滤液 ,采用黄华宏等人 [ 5]的
方法用石油醚萃取 。
(3)PVP去酚:采用吴伯千等人 [ 6]的方法 ,将萃
取后的样品溶液用不溶性聚乙烯吡咯烷酮(PVP)去
酚 ,得样品溶液。
(4)萃取:采用郑冰等人 [ 7] 的方法 ,将上述样品
溶液用乙酸乙酯萃取。用 0.1 mol/L醋酸溶液溶解干
物质 ,将溶液过滤膜。
(5)过柱:采用史作安 [ 8] 的方法 ,将上述滤液过
Sep-ParkC18柱洗脱 ,收集甲醇醋酸混合溶液洗脱液 。
(6)超滤离心:取以上洗脱液 ,加 40%甲醇醋酸
混合溶液 7 mL放入超滤离心管 ,在 4℃下 高速离心
60 min,取下管超滤离心液7 mL,过滤膜 ,得到待测溶
液 ,供高效毛细管电泳仪测定。
1.6　电泳缓冲体系的制备
选用由 50mM葡萄糖 、 20%乙醇 、10mM硼砂 、
2.5 mMSDS组成 pH8.5的缓冲体系 ,使激素组分在
最短时间内获基线分离 [ 7] 。
1.7　高效毛细管电泳仪的条件选择
1.7.1　电泳电压的选择
理论和实验均表明 ,效率与电压间存在极大值 。
极大电压也是最佳工作电压 。在实际分离中 ,如果所
用的毛细管很细或缓冲液的电导很低 ,则极大电压可
能会超出仪器控制范围 ,此时没有最佳电压 ,可选用
仪器允许的最大输出电压。本文参考郑冰等人 [ 7]的
方法 ,选用 22kV。
1.7.2　检测波长的选择
选择高灵敏度的检测波长可以提高分析的准确
度 ,同时也可以降低最小检测量 [ 5] 。本文选用 214
nm紫外检测波长测定生长素 IAA[ 7] 。
1.8　测定方法
依次采用 1 mol/LNaOH、去离子水 、缓冲溶液冲
洗 2 ～ 3 min。然后选用自动压力进样 , 压力为
技术开发　
　林业科技开发　2009年第 23卷第 6期 89　
3.45kPa,进样时间为 10 s,分离电压为 22 kV。采用
柱上紫外检测 ,检测波长为 214nm。每次测定在 15
min内完成。
按照以上操作步骤 ,依次进样 IAA标准样品溶
液 、待测样品溶液 ,得到高效毛细管电泳图(HPCE)
谱(见图 1、图 3)。
1.9　精密度试验
取 5份标准样品 IAA溶液 5mL,分别置于 5个
10 mL容量瓶中 ,用40%甲醇醋酸混合溶液溶解并定
容 。用高效毛细管电泳仪分别对各 IAA溶液进行测
定 ,结果见表 1。
1.10　重复性试验
准确称取2.00g加杨芽 5份 ,经过前处理 、浸提 、
分离和纯化后 ,用高效毛细管电泳仪分别对各样品溶
液进行测定 [ 9] ,结果见表 2。
1.11　加样回收试验
准确称取含 有 IAA的加杨芽 5份 ,每份 2.00 g,
再分别加入一定量的 IAA标准样品。经过前处理 、
浸提 、分离和纯化后 ,用高效毛细管电泳仪测定 IAA
的含量 ,计算回收率 [ 10] ,结果见表 3。
2　结果与分析
2.1　IAA标准样品电泳图
由 IAA标准品的 HPCE图谱(见图 1)可知 , IAA
标准品吸收峰与其他物质吸收峰分离效果较好 , IAA
标准品的保留时间为 5.892 min。
图 1　IAA标准品 HPCE图谱
2.2　IAA标准曲线
根据图 1绘制的 IAA标准曲线如图 2所示 。根
据图 2的标准曲线 ,用最小二乘法作线性回归 , 得
IAA的回归方程为:y=44.52x+2.8, R2 =0.998 1。
结果表明在 10 ～ 50mg/L的范围内 , HPCE图谱中
IAA峰面积与 IAA浓度呈良好的线性关系。
2.3　电泳图
从图 3可以看出 ,加杨芽经分离纯化后所得待测
溶液的电泳图谱较为理想。图谱中 IAA吸收峰与其
他物质吸收峰分离显著 , IAA吸收峰的周围杂峰消
失 ,样品 IAA保留时间为 5.874 min。
可见 ,经过石油醚去脂 、 PVP吸附 、萃取 、C18柱
层析等方法后 ,采用超滤离心 ,能够非常有效分离纯
化加杨芽中的 IAA。原因如下:
从前期研究 [ 11]得出加杨芽中含有大量的粗脂肪
类 、酚类 、黄酮类 、蛋白质等物质 。
脂类易溶于石油醚而不溶于水 ,当用石油醚的水
溶液萃取时 ,脂类物质大量溶于石油醚相而被除去。
PVP是一种大分子聚合物 ,其分子结构中的 N
原子和 O原子上含有孤对电子 ,能够与酚类物质上
的多羟基氢形成氢键 ,因此 PVP吸附酚类物质 ,从而
除去酚类物质 [ 12] 。
C18柱是非极性吸附柱 ,在醋酸溶液过柱时 ,极性
大的黄酮类物质 ,还有部分水溶性的氨基酸 、单糖和
苷类物质随水流出 [ 13] 。经过 17%甲醇醋酸混合溶液
洗脱时 ,极性较大的黄酮类物质被洗脱除去 ,最后通
过 40%甲醇醋酸混合溶液洗脱下吸附在 C18柱上的极
性较小的 IAA分子 ,对于极性更小的黄酮类物质则
仍被吸附在柱上未被洗脱。可见 C18柱层析后 ,除去
了大量黄酮类物质 。
超滤离心管分离除去了加杨芽中分子量大于
3 000以上的干扰物质 ,例如大量的大分子蛋白质 、核
酸类 、多糖类等。
另外 ,比较图 1和图 3可知 ,虽然 IAA标准品与
样品峰保留时间基本一致 ,但略有不同 。原因可能是
　技术开发
90　 林业科技开发　2009年第 23卷第 6期
仪器误差造成的 ,这是因为电压的稳定和操作人员的
熟练程度都影响实验的准确性 。
2.4　样品含量计算
样品中 IAA含量用标准曲线法计算。根据样品
图谱(见图 3),用微积分计算得到 IAA峰面积 ,代入
上述标准曲线方程得加杨芽 IAA浓度 A,再利用下列
公式计算出样品 IAA含量为 81ng/g。
加杨芽 IAA含量 =A×1000×7
1000×2
式中:A为加杨芽 IAA浓度。
2.5　精密度试验结果
将标准样品峰面积代入以上公式 ,实验结果见表
1。 IAA的相对标准偏差 RSD为 0.82%,可见仪器精
密度良好。
表 1　IAA精密度试验结果(n=5)
实验次数 峰面积 /mAu·s RSD/%
1 2 249
2 2 286
3 2 241 0.82
4 2 259
5 2 275
2.6　重复性实验结果
重复性实验结果见表 2。计算得芦丁峰面积相
对标准偏差 RSD为 1.68%,说明所选定的方法重复
性良好 。
表 2　IAA重复性试验结果(n=5)
实验次数 峰面积 /mAu·s RSD/%
1 1 041
2 1 075
3 1 062 1.68
4 1 030
5 1 047
2.7　回收率实验结果
加样回收试验结果见表 3。
表 3　加样回收率测定结果(n=5)
样品号 样品中 IAA含量 /ng·g-1
标准品 IAA加
入量 /ng·g-1
测定量
/ng·g-1
回收率
/%
平均回收率
/%
RSD
/%
1 81 50 93.9 71.7
2 81 100 123.8 68.4
3 81 150 160.1 69.3 70.52 2.32
4 81 200 204.0 72.6
5 81 250 233.7 70.6
由表 3可以看出 ,平均回收率为 70.52%, RSD=
2.32%(n=5),说明所选定的提取 、分离和纯化的方
法对高效毛细管电泳仪测定加杨芽 IAA基本适用 ,
但回收率略偏低 。可能原因是:(1)提纯步骤较多 ,
样品中 IAA可能有部分氧化分解;(2)由于 IAA在有
机相和水相溶液中都有溶解性 ,在萃取过程当中 IAA
可能损失;(3)C18柱吸附 IAA能力很强 ,洗脱液可能没
有完全把 IAA洗脱下来 。
3　结　论
本文探索出适用于 HPCE测定生长素 IAA的分
离纯化工艺 ,确定了 HPCE测定 IAA合适的缓冲体
系和仪器条件 ,测定了 IAA的含量 。
用本文确定的方法测出加杨芽生长素的含量为
81 ng/g,精密度试验 RSD为 0.82%,重复性试验 RSD
为 1.68%, 加样平均回收率为 70.52%、 RSD为
2.32%。表明所用仪器精密度良好 ,方法重现性良
好 ,结果基本稳定 、准确 。
因此 ,本文的分离 、提纯方法和高效毛细管电泳
仪的测定条件 ,适用于加杨芽生长素 IAA的分离 、提
取和测定 。
参考文献
[ 1]徐纬英.杨树 [ M] .哈尔滨:黑龙江人民出版社 , 1998:33.
[ 2]朱永亮 , 吴贯明.杨树芽休眠及其解除过程中内源激素的动态分
析 [ J] .南京林业大学学报 , 1990, 3(1):7-15.
[ 3]陈雪梅 ,高红兵 , 王沙生 , 等.三种杨树扦插生根期内源激素水平
的比较研究 [ J] .林业科技 , 1994, 30(1):1-7.
[ 4]齐莉 ,王雅芳 ,朱韵芳 ,等.新型高效毛细管电泳仪的研究 [ J].仪
器仪表学报 , 1995, 16(4):408-413.
[ 5]黄华宏 ,童再康 ,廖望仪 ,等.香榧雌花芽部分内源激素的 HPLC分
析及动态变化 [ J] .浙江林学院学报, 2005, 22:390-395.
[ 6]吴伯千 ,沈生荣 ,潘根生 ,等.茶树内源激素 IAA和 ABA提取方法
研究 [ J] .浙江农业大学学报 , 1992, 18(1):95-98.
[ 7]郑冰 ,杨海新.高效毛细管电泳定量分析植物激素 [ J] .分析化学 ,
1999, 27(1):704-707.
[ 8]史作安.甜樱桃休眠花芽内源激素的高效液相色谱测定 [ J] .落叶
果树 , 2004, 36(1):1-3.
[ 9]潘细贵 ,汪洋 ,雷湘, 等.高效毛细管电泳法测定消炎抗菌片中没
食子酸含量 [ J] .中国医院药学 , 2006, 26(4):424-426.
[ 10]肖玉秀 ,梅洁 ,程伟 ,等.高效毛细管电泳法测定测定盐酸芦氟沙
星制剂的含量 [ J] .药物分析, 2005, 25(10):1253-1257.
[ 11]范文 ,伊爱芹 ,陈媛梅.杨树芽和芽胶中化学成分的分析 [ J].林
业科技开发 , 2009, 23(1):32-35.
[ 12] Gui-YingXu, LiZhang, Yan-lianYang, Xi-RongHuang.Fluorescence
propertyonsolutionsofzwiterionicsurfactanttetradecylbetaineinthe
presenceofmacromolecules.SpectrochimicaActaPartA[J] .Molecular
andBiomolecularSpectroscopy, 2000, 11(56):2431-2437.
[ 13] MónicaCeciliaVargasMamani, FelixGuilermoReyesReyes, Sus-
anneRath.Multiresiduedeterminationoftetracyclines, sulphona-
midesandchloramphenicolinbovinemilkusingHPLC-DAD.Food
Chemistry, 2008, 11(3):545.
(责任编辑　葛华忠)
技术开发