全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2015, 50 (5): 652–664, www.chinbullbotany.com
doi: 10.11983/CBB15016
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收稿日期: 2015-02-12; 接受日期: 2015-06-23
基金项目: 国家自然科学基金(No.31370697, No.31372026)、河南省高校科技创新团队支持计划(No.14IRTSTHN014)、河南省高校
科技创新人才支持计划(No.13HASTIT004)和河南科技大学创新团队资助(No.2015TTD003)
* 通讯作者。E-mail: hxg382@126.com
SSR分子标记在牡丹亲缘关系研究中的应用与研究进展
郭琪1, 3, 郭大龙2, 3, 郭丽丽1, 3, 张琳1, 3, 侯小改1, 3*
1河南科技大学农学院, 洛阳 471003; 2河南科技大学林学院, 洛阳 471003
3河南省油用牡丹工程技术研究中心, 洛阳 471003
摘要 SSR标记具有操作简便、共显性和重复性好等特点。该文总结了通过生物信息学技术、磁珠富集法及二代测序技术
开发牡丹(Paeonia suffruticosa) SSR标记引物的方法, 并根据现有研究结果解析了牡丹基因组中SSR位点频率及分布, 详
细阐述了SSR标记在牡丹种质资源的遗传多样性、亲缘关系和遗传关系等方面的应用概况, 旨在为今后牡丹SSR标记的研
究与应用提供参考。
关键词 牡丹, SSR, 分子标记, 遗传多样性, 亲缘关系
郭琪, 郭大龙, 郭丽丽, 张琳, 侯小改 (2015). SSR分子标记在牡丹亲缘关系研究中的应用与研究进展. 植物学报 50, 652–
664.
牡丹(Paeonia suffruticosa)隶属芍药科芍药属,
为多年生木本落叶灌木, 是我国的传统名花, 其栽培
历史悠久(1 600年) (洪德元和潘开玉, 1999)。中国是
牡丹栽培的起源和发展中心, 牡丹在亚洲的许多国
家、美国、欧洲和澳大利亚也广泛种植(Cheng, 2007),
并已成为世界常见的著名观赏花卉。随着牡丹育种的
不断发展, 科研工作者利用各种分子标记对芍药属种
间及栽培品种间的遗传关系进行了研究, 如陈向明等
(2001)利用随机扩增多态性DNA (random amplified
polymorphic DNA, RAPD)对7种花色系的35个牡丹
栽培品种进行了分析; Hou等(2006)利用扩增片段长
度多态性(amplified fragment length polymorphism,
AFLP)对30份牡丹栽培品种进行了多态性检测; Guo
等 (2009)采用相关序列扩增多态性 (sequence rel-
ated amplified polymorphism, SRAP)对16个具有不
同花色的牡丹栽培品种间的遗传关系进行了研究。但
是他们的研究结果并不完全一致, 这可能是由于在研
究过程中使用了不同的实验材料以及所选择的样本
数量和分子标记的种类不尽相同所致。
研究者运用不同的分子标记技术对不同植物材
料的遗传多样性、品种鉴定及亲缘关系等进行了深入
广泛的研究(Agarwal et al., 2008)。SSR是基于PCR
的分子标记技术, 该标记通过特异性引物的设计对保
守区域进行扩增, 因重复单位的数目不同而产生多态
性, 如蒋晓英等(2013)利用36对SSR引物对39份杂
交水稻(Oryza sativa)样品进行了遗传多样性鉴定;
王玉民等 (2014)用SSR标记分析了40个玉米 (Zea
mays)品种的遗传多样性和亲缘关系。与SSR分子标
记技术相比, AFLP分子标记具有多态性高、结果可靠
且稳定等特点, 如王东升等(2013)利用AFLP分子标
记对分布于山东省内5个样地的51个野核桃(Juglans
cathayensis)单株的遗传多样性进行了分析, 但该
标记操作复杂且成本较高(Patzak, 2001); RAPD分子
标记虽然成本较低, 但其重复性较差(魏霜等, 2014),
如张杨等(2014)利用该标记方法解析了金钗石斛(Den-
drobium nobile)、铁皮石斛(D. officinale)和齿瓣石斛
(D. devonianum) 3种石斛属植物的种间关系。ISSR
分子标记具有操作简便和多态性丰富等优点, 如董海
燕等 (2014)利用 ISSR分子标记技术对红花檵木
(Loropetalum chinense var. rubrum) 41个品种的遗
传多样性进行了分析, 但因该标记只有显性的特点,
故不能鉴定纯合子和杂合子(Vijayan, 2007)。SRAP
分子标记是一种新型的分子标记技术, 具有操作简便
和共显性等优点, 如张冬菊等(2014)用该方法对56个
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郭琪等: SSR 分子标记在牡丹亲缘关系研究中的应用与研究进展 653

切花菊品种的遗传多样性进行了研究, 以及Uzun等
(2010)对杏的一些栽培品种的遗传研究, 但该标记只
对基因的编码区进行特异性扩增。谭祖猛等(2008)综
述了这些常见的分子标记技术在油菜(Brassica cam-
pestris)杂种优势上的应用研究, 提出靶位区域扩增
多态性(TRAP)分子标记技术可以提高预测杂种优势
的准确性, 但该方法基于已知的cDNA或EST序列信
息, 因此操作复杂且对技术要求较高。而SSR标记广
泛存在于真核生物的整个基因组中, 具有操作简便、
共显性、扩增产物稳定、多态性高、易于分离条带及
结果分析等优点, 已成为植物遗传图谱构建、基因型
分析和遗传多样性研究的一个较好的选择(Akkak et
al., 2009; Akritidis et al., 2009; Yu et al., 2013)。不
同的分子标记技术在牡丹上的应用研究已有很多, 几
种常用的分子标记状况如表1所示。此外, 基于SSR
标记技术的优势, 在牡丹中已开发的SSR标记也有
很多 (Wang et al., 2009; Homolka et al., 2010;
Zhang et al., 2011; Hou et al., 2011a, 2011b; Gai et
al., 2012; Zhang et al., 2012; Gao et al., 2013; Wu
et al., 2014), 这为利用SSR分子标记技术进行牡丹
遗传多样性、亲缘关系以及分子标记辅助育种等研究
奠定了良好的基础。本文重点综述牡丹SSR分子标记
的开发应用及研究情况, 旨在为SSR标记在牡丹中
的应用提供参考。
1 SSR分子标记的特点
微卫星(microsatellite)又称简单序列重复(simple se-
quence repeats, SSR), 是指在真核生物整个基因组
中存在序列较短且重复出现的核苷酸序列, 最早由
Tautz (1989)发现。SSR两端的序列往往是相对保守
的单拷贝序列, 由于重复序列数目或重复程度不同而
呈现出多态性, 因此可根据侧翼序列设计1对引物,
利用PCR技术扩增, 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增
产物, 获得多态性序列后分析结果。
在真核生物基因组中, 存在大量的微卫星序列。
并且在植物中, 已经证明微卫星标记是一种信息量大
且具有特异性位点的分子标记(Condit and Hubbell,
1991)。在单子叶植物中, 每隔64.6 kb含有1个短串联
重复序列(short tandem repeats, STR), 在双子叶植
物中则是每隔21.2 kb含有1个序列STR (Wang et al.,
表1 牡丹微卫星长度分布
Table 1 The length distribution of microsatellites from Paeo-
nia suffruticosa
Base types Numbers Percentage (%)
Mononucleotide 4 604 1.90
Dinucleotide 187 934 77.80
Trinucleotide 28 429 11.77
Tetranucleotide 19 087 7.90
Pentanucleotide 164 0.07
Hexanucleotide 1 333 0.55


1994; Provan et al., 1996; Smulders et al., 1997)。
该标记的重要性和特殊性在于其有以下几方面优点。
(1) 密切相关物种的微卫星DNA所在区域的生物基
因组相对保守, SSR引物可通用, 说明SSR侧翼序列
具保守性; (2) 在植物的非编码区, 改变重复序列的重
复次数不影响植物的生长发育, 品种间位点变异广泛,
多态性高; (3) SSR位点的等位基因数目较多, 杂合程
度较高, 多态性信息含量较大; (4) 共显性, 呈孟德尔
式遗传, 可鉴别出杂合子和纯合子, 对个体鉴定具有
特殊意义, 同时还可以很好地鉴定杂交后代的差异性
状来源; (5) 对DNA质量要求不高, 并且仅需微量的
DNA组织就能通过PCR技术进行分析; (6) 常使用聚
丙烯酰胺凝胶电泳检测单拷贝差异, 遗传信息量大。
2 牡丹SSR标记开发
由于牡丹的基因组非常大, 约为16 G (Gao et al.,
2013), 而SSR标记开发的数量有限, 目前还达不到
覆盖全基因组的水平。因此, 在牡丹中开发更为有效
的SSR标记非常重要。下面将分类介绍两种不同手段
开发牡丹SSR引物的方法。
2.1 基于生物信息学技术开发的SSR标记
根据原始序列鉴定SSR分子标记, SSRs可以分为基
因组SSRs和表达序列标签(expressed sequence tag
-simple sequence repeats, EST-SSRs)。传统方法开
发基因组SSRs分子标记不仅耗时长而且成本高, 并
且涉及基因组文库的构建和测序 (Eujayl et al.,
2004)。相反, EST-SSRs比非编码序列更为保守, 且
在较低成本下可以迅速开发。因此, 与基因组SSR标
记相比, EST-SSRs标记在相关物种中能够表现出更
654 植物学报 50(5) 2015

高水平的通用性(Wu et al., 2014)。同时, EST序列的
获得也相对容易, 可直接从生物信息公共数据库中下
载, 得到相关序列后, 去除载体序列, 降低EST序列
并进行拼接, 从而得到新的EST序列。再对其进行
SSR搜索(韩明利等, 2011)。
Hou等(2011b)从GenBank数据库(http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/dbEST/index.html)检索到2 204条牡丹
序列, 并用DNASTAR (http://www.dnastar.com; DN-
ASTAR Inc., Madison, Wisconsin, USA)组装成非冗
余的一致序列, 用软件MISA对存在SSRs标记的序列
进行进一步筛选, 对901条包含SSRs标记的序列进
行鉴定, 从SSR侧翼区域成功设计了29对引物, 其中
10对引物在45个牡丹栽培品种的PCR产物中具有一
定的多态性。Wu等(2014)从3 783条序列中鉴定出4
373个EST-SSR标记, 设计了788对引物, 其中有149
对引物在凤丹(P. ostii cv. ‘Feng Dan’)和红乔(P. suf-
fruticosa cv. ‘Hong Qiao’)两个品种的杂交后代中显示
出多态性。Homolka等(2010)从来自NCBI dbEST数据
库的2 024条牡丹ESTs序列中, 筛选出726条含有各
种重复的序列片段, 有473条包含SSR的unigenes,
得到了598个微卫星片段, 设计了25对引物, 但只有
5对引物在18个牡丹品种中显示出多态性。
鉴于目前牡丹在GenBank、EMBL和DDBJ等公
共数据库中的序列有限, 限制了该方法在牡丹研究中
的应用。随着GenBank数据库中牡丹序列的增加, 牡
丹SSR分子标记的开发将更容易。
2.2 基于实验手段开发SSR引物
2.2.1 磁珠富集法
该方法的基本原理是用限制性内切酶酶切基因组总
DNA, 将得到的DNA片段与带有生物素标记的微卫
星探针杂交, 利用生物素与链霉亲和素亲和性强的特
性, 完成重复序列目标片段的富集, 通过克隆和测
序, 从而得到含有SSR的重复序列。Yu等(2013)用限
制性内切酶RsaI和XmnΙ将基因组DNA双酶切成约
500 bp大小的片段, 然后用(AG)12、(AT)12、(CG)12、
(GT)12、(ACG)12、(ACT)12、(CCA)8、(AACT)8、(AAGT)8
和(AGAT)8微卫星探针, 再通过阳性克隆和DNA测序
共设计出48对牡丹SSR引物, 其中12对在48个牡丹
栽培品种中显示出多态性; Wang等(2009)用相同的
方法, 共设计了45对用于微卫星位点片段的扩增引
物, 其中有14对在20个牡丹栽培品种中显示出多态
性。这种方法的缺点是更适用于已有序列发布的物种,
并且有时所设计的EST-SSR引物会跨越内含子而无
法扩增出目的片段。
Zane等 (2002)提出了一种节约成本和时间的
快速分离微卫星的FIASCO (fast isolation by AFLP
of sequences containing repeats)方法, 该方法基
于磁珠表面链霉亲和素能够与探针上生物素之间强
且稳定的共价结合的原理 , 使用磁珠(streptavidin
magnesphere paramagnetic particles)和生物素标
记的微卫星探针来富集基因中的微卫星位点(郭大
龙, 2007b)。这实质上与Hakki和Akkaya (2000)的方
法类似。Hou等(2011a)用FIASCO方法对洛阳红(P.
suffruticosa cv. ‘Luoyang Hong’)进行了微卫星位点
分离。方法是用链霉亲和素磁珠与(GA)15(Bio-(GA)15)
和(AC)15(Bio-(AC)15)生物素标记探针进行富集, 使
用合适引物的聚合酶链式反应(PCR)对回收的DNA
进行扩增 , 将扩增的产物进行纯化 , 连接到pMD-
18T载体上, 再转移到大肠杆菌DH5α感受态细胞进
行阳性克隆及测序, 并对微卫星富集区的侧翼进行
特异性引物设计。通过该方法, 他们设计了26对引
物, 并且这26对引物在40个牡丹栽培品种中均表现
出高度多态性。Homolka等 (2010)使用Refseth等
(1997)开发的SSR富集方法开发牡丹SSR引物。方
法是将接头引物Sau 3A (A: 5′-TTCCATAACCCCA-
ATCTTCT-3′和B: 5′-TATCCTAATCTTTTTTTCTC-
TTTCC-3′)链接到大小为0.9–1.7 kb的DNA片段两
端, 用5′生物素标记的寡核苷酸与(AG)10、(CA)10和
(TA)10探针杂交, 用链霉亲和素磁珠捕获SSR片段,
并经热变性的生物素标记的寡核苷酸释放, 分离的
片段用寡核苷酸进行扩增, 再通过阳性克隆和测序,
设计了26对SSR引物, 其中有8对在32个牡丹品种
显示出多态性。

2.2.2 二代测序技术
二代测序技术(next-generation sequencing, NGS)
(Schuster, 2008)的出现和发展大大加快了生物学研
究的进程, 并广泛用于基因组和转录组测序及植物
基因组深度测序(Pazos-Navarro et al., 2011; Mal-
ausa et al., 2011)。NGS能产生大量的序列读长
(reads), 序列的产生、组装和分析需要不同的实验
郭琪等: SSR 分子标记在牡丹亲缘关系研究中的应用与研究进展 655

手段, 如文库构建和生物信息学技术等。NGS已经
成功用于分子标记的识别, 包括SSRs和单核苷酸
多态性 (SNPs), 目前该技术在白梨 (Pyrus bret-
schneideri) (Wu et al., 2013)、甜瓜(Cucumis melo)
(Garcia-Mas et al., 2012)、美洲花柏 (Chamae-
cyparis lawsoniana) (Jennings et al., 2011)、黄扁柏
(Callitropsis nootkatensis) (Jennings et al., 2011)
和薇甘菊(Mikania micrantha) (Yan et al., 2011)等
众多植物的基因组测序中已得到应用。而在牡丹
SSR研究中, 应用最多的NGS有两种方法: 一是使
用罗氏454测序(Roche 454 GS FLX), 该技术基于
乳液PCR和焦磷酸测序(Wall et al., 2009)。目前
Gao等 (2013)用454-GS-FLX高通量钛焦磷酸测序
开发SSR标记, 得到了675 221个牡丹片段, 其中
包含SSR序列数为237 134, 鉴定的SSR序列数为
164 043的片段存放在NCBI公共数据库 (登录号 :
SRA098186)中。该方法是将得到的基因组DNA链
接到T4载体两端, 经PCR扩增及生物素标记探针与
链霉亲和素磁珠杂交, 然后将DNA进行罗氏454测
序(Roche 454 GS FLX), 对测序结果进行处理分
析。共设计合成了100对引物, 对23个牡丹品种进行
验证。二是使用Illumina测序, 该测序技术单次运行
产生的短read读段大于1亿条, 每条read长约35–76
bp, 数据产量约为3–6 Gb, 平均费用约为每Mb
$4 (罗纯等, 2015)。Illumina测序是以双链DAN片段
为测序模版。Gilmore等(2013)用Illumina测序开发
微卫星标记, 产生了48 457 692个片段, 包括48 157 663
个编码片段和300 029个非编码片段 , 其中包含
SSRs的序列有11 203条 , 从芍药 (Paeonia lacti-
flora)中得到了1 504对SSR引物, 对4个芍药品种测
试结果显示有384对引物具有多态性, 其中有230对
产生的多态性片段长度范围为72–500 bp, 137对引
物没有产物或者产生的片段长度超过500 bp, 用21
个SSR多态性标记在93个芍药、牡丹及其杂交品种
中进行验证。Wu等(2014)用lllumina对洛阳红的花
蕾进行转录组测序, 共得到59 275条序列。用软件
SSRIT在ESTs数据库中搜索SSRs, 有2 989条序列
含有SSR, 用软件ORF Finder鉴定EST序列中的起
始密码子和终止密码子 , 发现有1 384条序列的
SSR侧翼序列距离过短而不适合引物设计。而在设
计的引物中, 有373对EST-SSR引物能够产生预期
大小的SSR产物 , 对373个SSR标记分析发现有
219个标记(58.7%)在编码区, 147个标记(39.4%)在
非编码区, 其中有42个标记在3′非编码区, 有105个
标记在5′非编码区, 剩余的7个标记则在未知蛋白质
的序列中出现。373对引物在亲本中进行筛选, 发现
有149对(39.4%)表现出多态性, 包括54个二核苷酸
位点, 41个三核苷酸位点, 5个四核苷酸位点, 1个五
核苷酸位点和48个六核苷酸位点。二、三、四、五
和六核苷酸位点的多态性比例分别为 38.8%、
35.0%、31.3%、33.3%和49.0%。
3 牡丹基因组中SSR标记的频率及分布
SSR标记广泛分布于真核生物的基因组中, 包括基
因编码区和非编码区。Wu等(2014)从洛阳红花蕾的
转录组测序结果中得到 59 275条序列 , 其中有
39 987条EST序列, 平均每698 bp出现1个SSRs。
用软件SSRIT从3 787 (6.4%)条序列中得到了4 373
条EST-SSRs序列, 其中有500条(13.2%)序列包含
的SSR标记不止一个 , 平均含1个SSR标记的EST
长度为9.24 kb。在识别的片段中 , 二核苷酸重复
的频率为 46.26%, 最为丰富 , 其次是三核苷酸
(27.30%)、六核苷酸(21.88%)、四核苷酸(3.06%)
和五核苷酸(1.49%)。其中, 在二核苷酸中, 最常见
的片段是AG/CT (41.4%)和GA/TC (39.9%), 其次
是AT/TA (11%)、CA/TG (4.4%)、AC/GT (2.9%)和
CG/GC (0.4%)。在三核苷酸序列中 , CCA/TGG
(10.3%)和GAA/TTC (10.3%)最丰富。然而, 在四、
五和六核苷酸序列中没有明显的优势片段。SSR长
度主要分布在12–24 bp之间, 占总SSRs的99.1%, 其
中长度为18 bp的SSR最常见 , 其次是25–66 bp
(0.9%)。Gao等(2013)通过二代测序技术(NGS), 发现
在这些读取片段的核苷酸中, 腺嘌呤最丰富, 其次是
胞嘧啶、胸腺嘧啶和鸟嘌呤。SSR标记重复的长度为
1–4 bp (单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸和四核苷酸),
其中二核苷酸重复序列最丰富, 最常见的片段是(AC)n
和(AG)n, 这也是所有SSRs标记中最主要的片段。在三
核苷酸序列中, A/T重复占主导地位, 其中AAC/GTT重
复序列最丰富, 其次是AAG/CTT重复序列, 而CCG和
ACG重复序列极少见, 这与Sonah等(2011)的研究结
果一致。最常见的五核苷酸和六核苷酸重复序列, 是
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包括二核苷酸CG的AACGT/ACGTT和AAGGAG/
CCTTCT重复序列。五核苷酸重复序列在单核苷酸
至六核苷酸重复中最少 , 这与Wu等的研究结果一
致。目前已报道的关于牡丹基因组中SSR标记频率
分布见表1。由于牡丹基因组很大, 其测序工作尚未
完成 , 根据目前已报道的SSR引物 (表2), 通过实
验, 对已开发的部分引物进行多态性检测, 发现82
对SSR引物具有多态性(表3)。
4 牡丹SSR标记的应用
4.1 遗传多样性研究
牡丹栽培历史悠久, 在其长期的栽培史中, 通过不
断的自然选择和人工培育, 已经形成了数量众多的
牡丹栽培品种 , 从而丰富了牡丹的遗传变异(郭大
龙, 2007a)。由于SSR标记揭示的多态性水平高, 因
此更适宜进行遗传多样性分析。Yu等(2013)用12对
SSR引物在48个牡丹样本中扩增, 共发现了42个等
位基因, 等位基因数目(the numbers of alleles, Na)
变化范围为2–9个, 平均3.5个; 有效等位基因数目
(the effective numbers of alleles, Ne)变化范围为
1.4–4.7个, 平均2.4个。观测杂合度(observed het-
erozygosity, Ho)为0.333–1.000, 平均0.785; 期望杂
合度(expected heterozygosity, He)为0.298–0.795,
平均0.541。多态性信息含量(polymorphism informa-
tion content, PIC)范围为0.257–0.794, 平均为0.468。
Shannon指数范围为0.594–1.771, 平均值为0.906。
此外, 12个微卫星标记中的11个(除了seq4)也在芍
药中有多态性 , 每个位点的等位基因为2–4, 并且
除了seq7外, 所有引物在川赤芍(P. veitchii)中均可
交叉扩增。Wu等(2014)用30对EST-SSR引物对36
个牡丹品种进行多态性评估, 结果表明, 这30对引
物都有多态性 , 并发现254个等位基因 , 等位基因
数目(Na)变化范围为3–12, 平均7.4个; 此外, 观测
杂合度(Ho)范围为0.19–0.81, 平均0.52; 期望杂合
度(He)范围为0.43–0.87, 平均0.74。30个SSR标记
的多态性信息含量(PIC)范围为0.36–0.85, 平均为
0.69。这些结果说明, EST-SSRs位点的多态性信息
量丰富。此外, 有28个SSR标记的PIC值大于0.5。
Shannon指数范围为0.83–2.14, 平均值为1.56, 也
能反应其多态性。Gao等(2013)选择100对SSR引物
对3个牡丹品种的多态性进行验证, 发现24对引物
有很高的多态性, 随后它们被用于23个品种间的多
态性分析。结果表明, 等位基因位点数目为2–5个;
期望杂合度介于0.085 0–0.727 5之间, 观测杂合度
为0–0.841 0。Hou等(2011b)用开发的20个新EST-
SSR标记对两个品种群(洛阳品种群和嵩县品种群)
的45个牡丹品种的多态性进行分析, 发现洛阳品种
群的等位基因数目(Na)范围为2–4个 , 平均2.6个 ,
期望杂合度(He)范围为0.208 7–0.658 1, 平均为
0.410 3; 嵩县品种群的等位基因数目(Na)范围为
1–4个, 平均2.4个, 期望杂合度(He)范围为0.223 9–
0.593 3, 平均为0.404 1。这些结果说明新开发的20
个EST-SSR标记的多态性较好。
4.2 亲缘关系研究
目前, 在牡丹亲缘关系研究中, 应用的分子标记主
要是RAPD (苏雪等, 2006)和AFLP标记(Hou et al.,

表2 牡丹SSR标记的开发近况
Table 2 The recent development of SSR markers in Paeonia suffruticosa
Author Total number
of sequences
examined
Number of SSR-
containing
sequences
Total number
of identified
SSRs
Total number of
primers
designed
Year of
publication
Journal of
publication
Jing Wu 59 275 4 373 3 787 2 989 2014 Mol Breed
Zhimin Gao 675 221 237 134 164 043 100 2013 BMC Genomics
Haiping Yu – – – 48 2013 Sci Hortic
Barbara Gilmore 48 457 692 11 203 – 1 504 2013 J Am Soc Hortic Sci
Xiaogai Hou 2 204 901 – 29 2011 Am J Bot
Xiaogai Hou – 362 24 24 2011 Biol Plant
Andreas Homolka 96 56 41 26 2010 Am J Bot
Jingxiu Wang 240 58 – 45 2009 Conserv Genet

郭琪等: SSR 分子标记在牡丹亲缘关系研究中的应用与研究进展 657

表3 82对牡丹SSR引物信息
Table 3 The information of 82 pair SSR primers in Paeonia suffruticosa
Primer
name
Primer sequence
(5′–3′)
Expected
size (bp)
Repeat
motif
Annealing
temperature (°C)
GenBank acces-
sion number
PS001 F: AAACACCCAAGCAAATCG 475 (CT)6 54 GBGY01000001
R: AATGAAACGCCGTCCTCT
PS005 F: GAGACCACCGAGTCACAG 480 (GA)9 53 GBGY01000005
R: TCAGAGCATGTCCGAAAC
PS007 F: GACTTCGATAGCCTTGGG 203 (CT)8 55 GBGY01000007
R: ATCTCAGCCGTTGTTTGG
PS021 F: AGATGGGAAGTTAAGGTGA 382 (GA)6 54.5 GBGY01000021
R: GTATGTTGGTAAATGGGTTT
PS026 F: TTCCCTCCATTCTAACAC 187 (AG)6 56 GBGY01000026
R: ACCCTAGCCTCTGACATT
PS041 F: GCACCGATAACTTCCAAAC 488 (TC)7 57 GBGY01000041
R: GCAGGCGATGCTACAAAC
PS043 F: TCTCGCATTCATCCTACAT 243 (CT)7 53 GBGY01000043
R: TTGCCATAATTCTTCTACCT
PS047 F: AGACGACGAGCAAAGATAT 126 (TC)8 54 GBGY01000047
R: AAAGGGCAAGATTGGAAAT
PS052 F: CAAATCTGCTAATTAAAGAC 235 (CT)7 53 GBGY01000052
R: GATAGAAGGGAAAGGAAG
PS053 F: ATTGCCAGATTTGTTCAG 407 (AG)7 55.5 GBGY01000053
R: CACCACTATTATTCCCTTG
PS054 F: GAAGGATCTGAGAAGCATA 123 (GA)6 54 GBGY01000054
R: AGTGAAGGAGACAACCCA
PS057 F: CATCGTCAATTTACTCATC 212 (TC)6 56 GBGY01000057
R: TAACATCCAAAGCAACTC
PS068 F: CTTTGGCATTCTCATTCA 174 (TC)7 55 GBGY01000068
R: GGTGGTATTGGGCTTCTT
PS074 F: TGCCTTGCTCCTCCTTGT 236 (CT)7 54 GBGY01000074
R: CGGTTAGCCATGAATCCC
PS076 F: ATGCCACCTTTTCCTAAT 258 (TC)8 52 GBGY01000076
R: TTCTTGTTCCCCTTGTTTC
PS094 F: GCTGCTTGCTTACTCATC 363 (AGC)6 55 GBGY01000095
R: TTCTTGTACTCTGCCTCC
PS095 F: TCCCAAGACCTCAAACAAC 394 (CCA)5 56 GBGY01000096
R: CCATCAATACGAGCCAAC
PS099 F: GGGTCCAACAACCAAACT 330 (TGG)5 54 GBGY01000100
R: GGTCAGCAAGAGCCAAAG
PS105 F: GTCACCGTCGTCTTCATC 196 (CCA)5 54.5 GBGY01000106
R: CTGGACCATATTTCGTTGTATG
PS111 F: GCAGATCATGGCGACAAAAC 372 (CAA)5 52 GBGY01000111
R: TGCTGAGGCGAAAGAACAG
PS119 F: GCAAAGACAACAGCCTCG 289 (CAG)6 53 GBGY01000119
R: CTCACCATCCAATCCCAC
PS121 F: CTGTACCGAACCTGCTTG 365 (TCA)5 55 GBGY01000123
R: TGTGGTGAGGCTAAATCC
PS125 F: GCCCTAACCCTATCCCTA 452 (TCA)7 53 GBGY01000128
R: AAACCCACCAAGACAAAC
PS134 F: CATCAACTTCGGCTAACA 387 (CAC)5 54.4 GBGY01000134
R: CAAACCTACCCAGTCCTAC
PS147 F: TCTGGCAAATACCGTGAA 480 (TTC)5 56 GBGY01000150
R: AGCGGAGAAGGATAAATAAG

658 植物学报 50(5) 2015

表3 (续) Table 3 (continued)
Primer
name
Primer sequence
(5′–3′)
Expected
size (bp)
Repeat
motif
Annealing
temperature (°C)
GenBank acces-
sion number
PS148 F: CTCCACCCGTATCACTCATC 353 (TGG)5 57.5 GBGY01000151
R: CGTCTCCTCCATCAACCT
PS153 F: ATGTCCAAACTGGCAATA 260 (CT)10 55 GBGY01000156
R: CCCTCCCTCAACACTTAC
PS157 F: CTCCCTGAACTCCCTACC 322 (AG)6 54 GBGY01000160
R: CTTTCTAAACAGCCAACG
PS160 F: TAGAAGTGGAGGCATCAG 125 (CT)7 54 GBGY01000162
R: GAGAAGTTTTGGGTGTCA
PS167 F: TTGTTGGTCGGCATCTCA 317 (AG)8 57 GBGY01000169
R: GGGAATGGTCTCGTAGCG
PS173 F: TCTTCCGCCATTACTGAT 120 (GA)6 54 GBGY01000175
R: CCTACCTTCGCTAAAACC
PS177 F: GAGAAAGGCAAGCGAGTC 441 (GA)6 55 GBGY01000179
R: TCCATTGTTTGTGGGTGT
PS179 F: GTGATGGTCTGATGGAGGA 234 (GA)6 56 GBGY01000181
R: AGAAAGCGGAGGAGTGGAG
PS180 F: CCCCGAAATGGAGGAGTC 188 (CT)6 56 GBGY01000182
R: AGGGCAGTAGCAGAAGAAAGTC
PS186 F: GAGGTGACGGATGGAGTT 356 (GT)8 55 GBGY01000188
R: CCTAAAGAAGGTTGTGGC
PS198 F: TATGCCTTTGGAGTTTGG 277 (TC)7 54.5 GBGY01000200
R: TTCGTGGCTTGTTCTGT
PS202 F: GTGGTGGTCCATCTTGAAG 163 (TC)7 54 GBGY01000204
R: TTGCTTGAGCGAGTGTTATC
PS203 F: AGTTTTGGGATTCCGTAC 179 (TA)8 56 GBGY01000205
R: CAGTGGGATTTTATTTGC
PS219 F: TGACATTGGCATTCCTTG 211 (GAA)6 54.5 GBGY01000221
R: CAGACCCTACCCTCTTG
PS227 F: GGGATACTGGGATAGGAC 173 (TTC)6 53 GBGY01000229
R: ACTTGGGAATTACTGACG
PS228 F: TGAGGCGTGGTAGAGGTT 121 (TCT)5 54 GBGY01000230
R: TCAAGGAGGTGAGGGAGT
PS240 F: AGTAGAATACGAAGAGGCATC 251 (GAA)6 55 GBGY01000242
R: CAAGACCGTGAACAAATATC
PS273 F: CCCTCAGATGGGATGGAA 314 (GCCGCT)4 53 GBGY01000274
R: CGGTGGTGGTACAACGAAC
PS296 F: CTCTTTCGCTGCCACAAC 419 (GAAGCA)4 56 GBGY01000296
R: CTCTGCTCTTCCCGTCTT
PS308 F: ACTACTCTATTGCGAAACC 189 (TC)7 54.5 GBGY01000308
R: GTCTTATGGCGGCTATGT
PS309 F: AAGCAAAGCCGTGGAGAT 257 (CT)6 55 GBGY01000309
R: GTGCGTGAAAAGGAGACAGAAC
PS318 F: ATCTACTCCCTATCCGTCAC 369 (CCACA)4 54 GBGY01000318
R: CCCACAGCTACCTCCTTG
PS321 F: TGCTACCAGCTCCTCCAT 249 (ATCA)5 53 GBGY01000321
R: ACCATCTCCACCATTTCG
PS357 F: CACAAGGGTCAGCAGTTT 231 (ATC)5 53.5 GBGY01000355
R: CATTGGTAGGCGGTCTTT
PS363 F: TTCAACCACATCTCCCTC 457 (TTG)7 54 GBGY01000361
R: CTACCACCATAAGTGTAAGAG
PS364 F: GGAGCAAACCCTAAGCAC 205 (CTT)5 53.5 GBGY01000362

郭琪等: SSR 分子标记在牡丹亲缘关系研究中的应用与研究进展 659

表3 (续) Table 3 (continued)
Primer
name
Primer sequence
(5′–3′)
Expected
size (bp)
Repeat
motif
Annealing
temperature (°C)
GenBank acces-
sion number
R: ATAGCGAGGACCGTGAAT
PS365 F: AACCAAACTAACCCTAAATG 350 (CCA)7 54 GBGY01000363
R: GAGTGGATGTGGGAGACG
PS371 F: CATTGAGCCACCCATAGA 219 (CAC)5 55 GBGY01000369
R: GCAACAATCCTGGTAGTGA
21A F: CAACTTTGCCAACTTCGTCCACTTC 295 (TTC)12 55 –
R: CCCGTCATGAACAAGAAGAAGGAAA
26A F: TGGGCCCTACAAGTGATGATATTCC 245 (TTG)7 54 –
R: ATGGAATCCAGGTTTGTGAATGTGA
42A F: GTTTGGTTGTCATCAAGGTTGTCGA 345 (TG)18 56 –
R: ATCAACAAGATTACTCCTACGCCCC
45A F: TCAAAGCCAAATGGATACGGTCGCG 200 (AC)13 57 –
R: TTCTTGTTTTCGTTCCTCGCCCCCT
49A F: TCTGGGTGATAGGTGGAGCTGGTGC 314 (TGC)5 55 –
R: GGAAGACGCCCACAATGAAATCACA
51A F: TATTGGACCCAGTCGATGATGTTTG 259 (CA)8 54.5 –
R: GTGTGTGTCGTGCGTTGTGTTAGTG
55A F: ATCCCAGTCCCGCCTTGCTGCTATC 285 (CT)8 56 –
R: TTCACAACACACGCACACACGCACA
56A F: CAGGTGGCATTTTTGGCTTCTCTCT 388 (AC)15 55 –
R: TTGGCCCAATCACATGTAATCCCTC
59A F: TACAACACTTCTCGCCTAACGCACC 270 (AC)18 56 –
R: AGACATGGTGCAAGTATGGGAGACG
63A F: CACCGCATATCTCCAACCTCACCTC 277 (TC)9(AC)17 54 –
R: TTGGGTAGAGATAGGAGGTTGGGGC
65A F: CATACCTCCATCATGATGCTGCTGT 355 (TGG)5 57 –
R: ATGAAGGCTCAGTAAGAACCTCGGA
73A F: CCATCTCAGGGTCAGGGTTCTCGTA 375 (CAG)5 55 –
R: TAGAGTGTACCTTCACCCCCATCGG
77A F: AACAGCTCAGGACCATGTGGAAAGT 363 (GA)13 56 –
R: AATGTATGCGATATCTGACTGCCGA
87A F: TGTAATCGATCGAGTTTCTTGGGTC 188 (TG)15 54 –
R: CCTAACACTCCACCACTAAGTCGCT
91A F: TCAGCCCCTAGCATAGAAGAATCCA 384 (GT)9ttgta(TG)16 57 –
R: TCTCACTACCACCTACGCGATGTTC
93A F: CCTTCTTCTCCTTCGATAGCCACCC 432 (TG)10 55 –
R: CACGCACTACAACCCAGCCTACACT
99A F: AAAGGCTGCAAGTCGTATCCTCTCA 406 (TG)14 57 –
R: AGGCAGTACATCAGGCAGAGGAGGT
Seq4 F: AACTGCTGAGGGCATAGAG 233 (TGG)6 55 KC121549
R: CATGATGTTGAGCCACCC
ACG9797 F: GGTCGCTGGGTGTTC 192 (ACG)8 54 FE529797
R: GTTGGAGTTGGAGAGGTTG
C-8918 F: AAGAAGGGGAGGAGGAG 201 (AAG)5(AGG)4 53 FE528918
R: GCGAGAAGAAAAGGCAAAAT
PSESP2 F: GACGGAGAGAAAGAGAGCATA 403 (GAA)5 54 FE528847
R: GACAAAGACTGACACAGCGAT
PSESP7 F: GGCTAATCTTGTTGCTCAG 174 (A)29 55 FE527983
R: AACCCCTCTTTCTCCTCA
PAC28 F: CTGCAGGTCGACGATTAC 247 (AC)17 54.5 GQ480169
R: AGTCCTGAGTAACATTGCCT

660 植物学报 50(5) 2015

表3 (续) Table 3 (continued)
Primer
name
Primer sequence
(5′–3′)
Expected
size (bp)
Repeat
motif
Annealing
temperature (°C)
GenBank acces-
sion number
PC1 F: CTACCCACGACCCTTTTGAG 243 (AG)7 56 GQ480171
R: AGCACTCTCACAACTTTCATAC
Pde106 F: TGGATTCTTATTTGTTTTGAG 86–358 (AG)19 53 –
R: ACACCGTGTAGCAGATGATGA
Pdel29b F: CTGCCATTTCTTGCCTTCTTTGT 253–308 (TGG)6 55 –
R: TCTACCCTGCCAACAGCACATAC
AT8051F F: GGTATCAATCCGTGTGC 99–612 (AT)5 54.5 –
R: GCGAAAATTTAGATGAGTGT
P05 F: TCGCCCAACCTGTCGTGGAGAT 129–437 (AG)9 54 –
R: TTGAATAGAGCGGAATGGAAAA
Pae12 F: AAAGCTTTTGCACAACACACA 97–155 (TA)6 53 –
R: ATAGCGCGAAAATTGAGGTG


2006), 应用SSR标记的研究报道较少。Zhang等
(2012)利用EST-SSR研究了48个牡丹栽培种和8个
牡丹野生种间的亲缘关系, 发现来源相同的栽培品
种的亲缘关系较近, 紫斑牡丹(P. rockii)与西北牡丹
群的亲缘关系较近。Yuan等(2010)从牡丹3个野生
种, 即紫斑牡丹、延安牡丹(P. yananensis)和稷山
牡丹(P. jishanensis)的159个样本个体中检测到152
个等位基因, 其中有14个SSR标记位点。在检测到
的等位基因中, 有36个(26.97%)为3个野生种所共有,
21个(13.81%)为稷山牡丹特有, 3个(1.97%)是延安牡
丹特有, 71个(56.71%)为紫斑牡丹特有。之后, 分别对
55个延安牡丹、68个稷山牡丹和123个紫斑牡丹的等
位基因位点进行检测, 发现在延安牡丹的55个等位基
因中, 42个(76.36%)与稷山牡丹共享, 46个(83.64%)
与紫斑牡丹共享。因此, 延安牡丹的基因组是来自稷
山牡丹和紫斑牡丹。同时, 共享等位基因的分布也表
明, 稷山牡丹和紫斑牡丹在物种特异性的遗传成分中
占有相当大的比重, 而延安牡丹所占的物种特异性的
遗传成分比例很低, 同时主坐标分析结果表明, JWM
个体是与YWM个体的基因混合体, 并且RGQ群体在
遗传和空间上比紫斑牡丹的任何群体都更接近延安
牡丹。同时, Yuan等(2010)还结合叶绿体基因片段
分析, 证明了延安牡丹是以稷山牡丹为母本、紫斑
牡丹为父本的杂交后代。
4.3 种质资源的遗传多样性研究
牡丹具有极高的观赏和药用价值, 其花大、形美、
色艳且香浓, 为众人所喜爱。在长期的驯化栽培和
自然选择下, 牡丹形成了众多的栽培品种。同时, 牡
丹组(Section Moutan D.C.) (包括革质花盘亚组(Sub-
section Vaginatae)和肉质花盘亚组 (Subsection
Delavayanae))野生种为我国所特有。由于牡丹分类
地位的不断更新以及新品种的不断开发, 使其种质
资源遗传多样性研究更加困难。因此, 众多学者开
始致力于其遗传关系的研究, 常用系统发生树(phy-
logenetic tree)对牡丹种质资源遗传多样性进行分
析。
Wu等(2014)将开发的30对EST-SSR引物用于
56个牡丹种质资源遗传关系的调查, 进一步说明了
EST-SSR标记开发的有效性。在NJ树状图中, 紫斑
牡丹及其栽培品种群与四川牡丹紧密相关 , 这与
Zhao等(2008)的研究结果一致; 凤丹与日本品种群
的栽培品种有更多的遗传相似性, 这与日本栽培品
种起源于中国, 尤其是来自中原牡丹品种群的结论
相一致。在系统发生树的几个分支中存在一些不一
致的分支, 这可能是受研究样品数量限制的结果。
Gao等(2013)对23个品种进行聚类分析, 结果表明,
紫斑牡丹和凤丹是所有21个品种的祖先 ; P. suf-
fruticosa cv. ‘Yao Huang’、 P. suffruticosa cv. ‘Dou
Lv’、P. suffruticosa cv. ‘Shui Jing Bai’和P. suf-
fruticosa cv. ‘Liu Li Guan Zhu’与中原品种群聚在一
起, 说明它们的遗传关系密切; 来自日本的P. suf-
fruticosa cv. ‘Taiyoh’、P. suffruticosa cv. ‘Shima
Nisshiki’和P. suffruticosa cv. ‘Gun Pou Den’ 与中
原品种群聚在一起, 说明这3个日本牡丹品种来自
中国的中原牡丹品种群; P. suffruticosa cv. ‘Huai
郭琪等: SSR 分子标记在牡丹亲缘关系研究中的应用与研究进展 661

Nian’、P. suffruticosa cv. ‘Ju Yuan Shao Nv’和P.
suffruticosa cv. ‘Xin Xing’与西北品种群聚在一起,
反映了它们的密切关系, 并且在聚类分析图上形成
了另一个分支。
Yu等(2013)为了解牡丹野生种与栽培品种间的
遗传关系 , 基于SSR标记构建了NJ树。结果表明,
芍药组(Section Paeon D.C.)的P. suffruticosa cv.
‘Tao Hua Fei Xue’、P. suffruticosa cv. ‘Fen Yu Nv’、
P. suffruticosa cv. ‘Qiao Ling’和P. suffruticosa cv.
‘Da Fu Gui’先形成一个独立的分支, 之后与川赤芍
聚集在一起, 在聚类图中形成一个外围组。牡丹组
品种主要聚集在两个分支中。在分支1中, 9个西北
品种群的品种和紫斑牡丹品种分布在一个亚支, 说
明紫斑牡丹是西北品种群的祖先, 这与先前的研究
结果相一致, 并且它们有相同的形态学特征, 如在
花瓣的基部都有清晰的黑紫色或紫红色斑点(周志
钦等, 2003; Cheng, 2007)。在分支A中, P. suff-
ruticosa cv. ‘Hong Zhuang Su Guo’、P. suffruticosa
cv. ‘Hong Lou Cang Jiao’、P. suffruticosa cv. ‘Qing
Xin Bai’、P. suffruticosa cv. ‘Gao Yuan Sheng Huo’
和P. suffruticosa cv. ‘Lan Zhang Cai Wei’ 5个重瓣
或半重瓣花形的品种聚集在一起。同时, 所有单瓣
花型品种, 如P. suffruticosa cv. ‘Ye Guang Bei’、P.
suffruticosa cv. ‘Bing Xin Fen He’、P. suffruticosa
cv. ‘Han Hai Bin Xin’和P. suffruticosa cv. ‘Ming
Mou’与紫斑牡丹品种聚集在分支B中。牡丹花的原
始形式是单瓣花, 但可能由于栽培条件不同, 导致
雌蕊瓣化形成了半重瓣或重瓣花形, 说明花的形态
与遗传信息存在一些关系, 这与Hou等(2006)的研
究结果一致。分支2是由中原牡丹品种群的品种组
成, P. suffruticosa cv. ‘Er Qiao’和P. suffruticosa cv.
‘Luo Yang Hong’聚在一起, 清晰地说明了二者的起
源。在聚类分析图中, 相似系数较高的栽培品种聚
在一起, 说明它们的亲缘关系较近。
5 结语
牡丹不仅具有很高的观赏价值, 而且在药用和籽油
开发中也具广阔的应用前景。但由于其栽培历史悠
久, 遗传背景复杂, 野生种与栽培品种及栽培品种
间的亲缘关系尚不十分清楚。对于牡丹亲缘关系、
栽培品种的起源和分子标记辅助育种等问题都需进
一步研究。而SSR标记具有分布广泛、多态性丰富、
突变率高、重复性好、共显性和操作简便等优点, 已
被广泛应用于各种花卉、农作物及林木等的遗传研
究。但是, 目前SSR标记在牡丹中的应用较少, 主要
是由于SSR标记数量不足, 因此大量开发牡丹SSR
标记势在必行。
随着测序技术和计算机科学的发展, 将会在公
共数据库中搜索到越来越多的牡丹序列, SSR识别
软件也将会识别到更多适宜标记的序列, 从而更加
准确且快速地进行牡丹遗传多样性的评价、遗传图
谱的构建、数量性状位点的检测、重要性状基因和
分子标记间的连锁, 以及最终促进分子标记的辅助
育种。
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664 植物学报 50(5) 2015

Application of Simple Sequence Repeat Molecular Markers in the
Study of Tree Peony
Qi Guo1, 3, Dalong Guo2, 3, Lili Guo1, 3, Lin Zhang1, 3, Xiaogai Hou1, 3*
1College of Agriculture, Henan University of Science & Technology, Luoyang 471003, China; 2College of Forestry, Henan
University of Science & Technology, Luoyang 471003, China; 3Henan Engineering Technology Research
Center of Paeonia suffruticosa For Oil, Luoyang 471003, China
Abstract Simple sequence repeat (SSR) markers have the characteristics of simple operation, codominance and reli-
able reproduciblity in phylogenetic studies. This paper summarizes the techniques for developing peony SSR marker
primers: bioinformatics technology, magnetic beads enrichment and next-generation sequencing. Furthermore, we sum-
marize the current findings of the frequency and distribution of SSR loci in peony genome. We hope our summary on the
application of SSR markers on tree peony will provide useful references to people who are working on the species.
Key words Paeonia suffruticosa, simple sequence repeat, molecular marker, genetic diversity, genetic relationship
Guo Q, Guo DL, Guo LL, Zhang L, Hou XG (2015). Application of simple sequence repeat molecular markers in the
study of tree peony. Chin Bull Bot 50, 652–664.
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* Author for correspondence. E-mail: hxg382@126.com
(责任编辑: 孙冬花)