全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2011, 46 (5): 569–574, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2011.00569
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收稿日期: 2011-05-09; 接受日期: 2011-07-07
基金项目: 黑龙江省留学基金(No.LC08C20)和黑龙江省教育厅海外学人科研资助项目(No.1154h04)
* 通讯作者。E-mail: daidiche@yahoo.com.cn
月季愈伤组织的诱导及植株再生
陈雪, 张金柱, 潘兵兵, 桑成瑾, 马雪, 杨涛, 车代弟*
东北农业大学园艺学院, 哈尔滨 150030
摘要 以可在黑龙江地区露地越冬的5个现代月季(Rosa chinensis)品种为实验材料, 分别以其无菌苗的叶片和茎段为外植
体, 研究了愈伤组织诱导及植株再生方法。实验结果表明: 5个寒地月季品种的叶片和茎段均可诱导出愈伤组织, 2,4-D诱导
愈伤组织的效果较好, 高浓度的细胞分裂素不适合用于月季叶片和茎段愈伤组织的诱导; TDZ在月季愈伤组织分化培养过
程中具有重要作用, 光照培养可促进月季愈伤组织的分化, 愈伤组织的分化能力随着继代次数的增加呈下降趋势。该实验
成功地从2004-8和2004-9(2个月季品种)愈伤组织中诱导出再生植株, 其愈伤组织的分化率分别为45%和38%。
关键词 愈伤组织诱导, 植株再生, 月季
陈雪, 张金柱, 潘兵兵, 桑成瑾, 马雪, 杨涛, 车代弟 (2011). 月季愈伤组织的诱导及植株再生. 植物学报 46, 569–574.
寒地月季(Rosa chinensis)是能够在黑龙江地区
露地越冬的稀有月季品种, 具有极高的商业价值和广
阔的应用前景。建立高效的植株再生体系是对其进行
遗传性状改良的基础。目前, 国外以月季叶片、茎段、
根和花丝等为外植体, 通过直接或间接的器官发生途
径及体细胞胚发生途径再生植株已获得成功(Nor-
iega and Sondahl, 1991; Arene et al., 1993; Hsia
and Korban, 1996; Dohm et al., 2001)。国内的研究
则主要集中在以茎尖或带芽茎节为外植体进行离体
快繁(李青等, 1999; 李海燕等, 2004), 对愈伤组织诱
导和植株再生研究成功的报道相对较少, 并且因受基
因型的限制, 再生率普遍较低(任桂芳等, 2004; 高丽
萍等, 2005)。
本研究选取5个寒地月季品种为实验材料, 通过
愈伤组织诱导再生植株, 以期建立高效的再生体系,
为进一步开展寒地月季育种研究与应用奠定基础。
1 植物材料
抗寒月季(Rosa chinensis Jacq.)品种2004-5、2004-6、
2004-7、2004-8和2004-9的无菌苗由东北农业大学
寒地园林植物实验室培育。
2 培养基成分及培养条件
2.1 培养基成分
2.1.1 愈伤组织的诱导
分别以5个月季品种无菌苗的小叶和茎段为外植体,
将小叶切割成0.5 cm×0.5 cm左右的小块, 茎段切割
成长2–3 cm的小段, 接种到愈伤组织诱导培养基中。
基本培养基为MS, 添加不同的生长调节剂(表1), 附
加3%的蔗糖和0.7%的琼脂, pH值调至5.8。

2.1.2 愈伤组织的继代培养
将愈伤组织接种在相同的新培养基中, 待其生长到一
定量后, 观察愈伤组织的结构和形态。

2.1.3 愈伤组织的分化培养
将能够在继代培养基上正常生长的愈伤组织切成
1 cm×1 cm左右的小块, 接种到愈伤组织分化培养基
中。基本培养基为MS和1/2MS, 分化培养基的激素组
成采用4因素3水平的正交实验设计方案(表2), 并对
每个组合进行3次重复实验, 附加3%的蔗糖和0.7%
的琼脂, pH值调至5.8。每次实验均接种100块愈伤组
织, 培养30天后观察愈伤组织的分化情况并统计其

·技术方法·
570 植物学报 46(5) 2011
表1 愈伤组织诱导的实验设计
Table 1 Design of experiment of callus induction
Plant growth regulator
Treatments 2,4-D
(mg·L–1)
6-BA
(mg·L–1)
NAA
(mg·L–1)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
0.5
1.0
2.0
5.0
0
0
0
0
2.0
2.0
2.0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0.5
1.0
2.0
0.5
1.0
2.0
0
0
0
0
0.5
1.0
2.0
5.0
0
0
0
2.0
2.0
2.0



表2 愈伤组织分化培养基激素组成的正交实验设计方案
Table 2 The orthogonal experiments design of hormone
compositions for callus differentiation media
Factor
6-BA
(mg·L–1)
2,4-D
(mg·L–1)
TDZ
(mg·L–1)
GA3
(mg·L–1)
Test 1 0 0 8.0 0
Test 2 0 0.2 9.0 0.1
Test 3 0 1.0 10.0 0.5
Test 4 0.1 0 9.0 0.5
Test 5 0.1 0.2 10.0 0
Test 6 0.1 1.0 8.0 0.1
Test 7 0.5 0 10.0 0.1
Test 8 0.5 0.2 8.0 0.5
Test 9 0.5 1.0 9.0 0


分化率。

2.1.4 再生植株的生根与移栽
将再生幼苗接种到附加不同浓度NAA(0.05、0.1和0.2
mg·L–1)的1/2MS培养基上进行壮苗生根。
2.2 培养条件
愈伤组织在黑暗条件下培养7天后进行光照培养, 光
照强度为50 μmol·m–2·s–1, 光周期为16小时/8小时,
培养温度(25±2)°C。每次实验均采用100个外植体,
并对每个组合进行3次重复实验。培养30天后统计愈
伤组织的诱导率。愈伤组织分化的培养条件分别为黑
暗和光照, 光照培养条件和培养温度同愈伤组织诱
导。
3 结果与讨论
3.1 基因型、外植体和激素对愈伤组织诱导的影响
愈伤组织诱导的结果见表3。从表3可以看出, 5个寒地
月季品种在附加不同生长调节剂的培养基中均可诱
导出愈伤组织, 但愈伤组织的诱导率与基因型紧密相
关, 不同品种间的诱导率差异很大。此外, 不同外植
体诱导愈伤组织的能力也存在很大差异, 在以附加生
长素类物质为主的培养基中, 叶片诱导愈伤组织的能
力大于茎段。附加生长素NAA或2,4-D的培养基均能
够诱导出愈伤组织, 但无论从诱导率还是从所诱导愈
伤组织的质量上看, 附加2,4-D的培养基诱导愈伤组
织的效果要优于附加NAA的培养基, 由附加NAA的
培养基诱导出的愈伤组织在继代过程中会严重褐化,
不适合进行下一步实验(图1A, B)。生长素与细胞分裂
素配合使用, 当细胞分裂素浓度较低时, 有时会形成
质量较高的愈伤组织, 适合进行下一步培养; 但当细
胞分裂素浓度较高时, 愈伤组织诱导率和生长量均明
显下降, 且其结构非常致密(图1C), 说明高浓度的
细胞分裂素不适合用于月季叶片和茎段愈伤组织的
诱导。
根据愈伤组织的诱导率及其继代培养的能力, 确
定5种寒地月季品种愈伤组织诱导的最适培养基。适
合2004-5、2004-6和2004-8叶片诱导愈伤组织的培
养基为MS+3.0 mg·L–12,4-D; 适合2004-7和2004-9
叶片诱导愈伤组织的培养基为MS+2.0 mg·L–12,4-D;
适合2004-5和2004-7茎段诱导愈伤组织的培养基为
MS+3.0 mg·L–12,4-D; 适合2004-6、2004-8和
2004-9茎段诱导愈伤组织的培养基为MS+2.0 mg·L–1
2,4-D+0.5 mg·L–16-BA。
3.2 愈伤组织的分化
表4显示了各月季品种愈伤组织的分化情况。从表4
可以看出, 2004-5茎段愈伤组织及2004-7的叶片和茎
段愈伤组织在分化培养基中均可诱导出胚性愈伤组
织, 但胚性愈伤组织在进一步培养中未形成再生植株
(图1D); 2004-8在分化培养基中能够诱导出不定芽和
陈雪等: 月季愈伤组织的诱导及植株再生 571
表3 不同培养基对5个月季品种2种外植体愈伤组织诱导的影响
Table 3 Effects of different media on callus induction from different explants of five rose cultivars
Ratio of callus induction (%)
2004-5 2004-6 2004-7 2004-8 2004-9
No. Media components

Blade Stem
section
Blade Stem
section
Blade Stem
section
Blade Stem
section
Blade Stem
section
1 MS+0.5 mg·L–12,4-D 22.0 6.0 26.0 4.0 25.0 8.0 40.0 10.0 36.0 4.0
2 MS+2.0 mg·L–12,4-D 88.0 60.0 96.0 76.0 100.0 76.0 86.0 47.0 100.0 76.0
3 MS+3.0 mg·L–12,4-D 100.0 80.0 100.0 68.0 100.0 87.0 100.0 76.0 100.0 74.0
4 MS+5.0 mg·L–12,4-D 92.0 74.0 93.0 57.0 88.0 82.0 90.0 53.0 89.0 68.0
5 MS+0.5 mg·L–1NAA 55.0 0 45.0 0 42.0 0 36.0 0 25.0 0
6 MS+2.0 mg·L–1NAA 67.0 44.0 68.0 34.0 57.0 34.0 66.0 9.0 40.0 16.0
7 MS+3.0 mg·L–1NAA 66.0 56.0 75.0 56.0 58.0 47.0 60.0 13.0 56.0 39.0
8 MS+5.0 mg·L–1NAA 43.0 50.0 57.0 58.0 32.0 64.0 44.0 22.0 58.0 43.0
9 MS+2.0 mg·L–12,4-D+
0.5 mg·L–16-BA
85.0 66.0 94.0 67.0 100.0 78.0 90.0 84.0 100.0 83.0
10 MS+2.0 mg·L–12,4-D+
1.0 mg·L–16-BA
68.0 47.0 83.0 60.0 87.0 69.0 73.0 60.0 84.0 67.0
11 MS+2.0 mg·L–12,4-D+
2.0 mg·L–16-BA
30.0 36.0 52.0 33.0 63.0 41.0 35.0 37.0 72.0 42.0
12 MS+2.0 mg·L–1NAA+
0.5 mg·L–16-BA
62.0 46.0 67.0 45.0 50.0 35.0 63.0 13.0 38.0 23.0
13 MS+2.0 mg·L–1NAA+
1.0 mg·L–16-BA
49.0 33.0 48.0 28.0 34.0 24.0 43.0 7.0 33.0 14.0
14 MS+2.0 mg·L–1NAA+
2.0 mg·L–16-BA
19.0 20.0 21.0 15.0 10.0 8.0 22.0 0 16.0 6.0


表4 各月季品种愈伤组织的分化情况
Table 4 Callus differentiation of rose cultivars
Varieties Explants Media components Callus differentia-
tion state
Ratio of callus
differentiation
(%)
2004-5 Stem section
callus
MS+0.5 mg·L–16-BA+0.2 mg·L–12,4-D+8.0 mg·L–1TDZ+
0.5 mg·L–1GA3
Sexual embryo
callus
42.0
Blade callus MS+0.2 mg·L–12,4-D+9.0 mg·L–1TDZ+0.1 mg·L–1GA3 Sexual embryo
callus
25.0 2004-7
Stem section
callus
MS+0.5 mg·L–16-BA+1.0 mg·L–12,4-D+9.0 mg·L–1TDZ Sexual embryo
callus
14.0
Blade callus 1/2MS+0.5 mg·L–16-BA+10.0 mg·L–1TDZ+0.1 mg·L–1
GA3
In vitro shoot 18.0
Blade callus MS+0.2 mg·L–12,4-D+9.0 mg·L–1TDZ+0.1 mg·L–1GA3 Embryo thallose 20.0
2004-8
Stem section
callus
MS+8.0 mg·L–1TDZ In vitro shoot 48.0
Blade callus MS+0.1 mg·L–16-BA+9.0 mg·L–1TDZ+0.5 mg·L–1GA3 In vitro shoot 35.0 2004-9
Stem section
callus
MS+0.2 mg·L–12,4-D+9.0 mg·L–1TDZ+0.1 mg·L–1GA3 Sexual embryo
callus
16.0


胚状体, 2004-9在分化培养基中能够诱导出不定芽和
胚性愈伤组织(图1E–H), 不定芽和胚状体在继代培
养中逐渐形成再生植株(图1I); 2004-6的愈伤组织在
分化培养基中未发生分化, 在继代培养过程中不断褐
化死亡(图1J)。
本研究发现 , 较高浓度的TDZ与不同浓度的
572 植物学报 46(5) 2011
2,4-D、6-BA和GA3组合的愈伤组织分化培养基可使
4个月季品种的愈伤组织发生分化 , 其中2004-8与
2004-9还获得了再生植株, 说明TDZ在月季愈伤组
织分化培养过程中具有重要作用。实验过程中还发现,
单独使用TDZ时, 仅有2004-8茎段愈伤组织发生分
化, 其它的分化尚需要几种激素的组合使用, 但激素
的种类和浓度与基因型和外植体紧密相关, 不同的基
因型和外植体其愈伤组织分化培养基存在明显差异
(表4)。
黑暗条件下, 各月季品种的愈伤组织均未发生分
化。愈伤组织均是在光照条件下发生分化。黑暗条件
下, 愈伤组织在分化培养基中可以继续生长, 但颜色
呈白色或灰白色 , 分化能力差或不具分化能力(图
1K)。光照条件下, 愈伤组织呈绿色或者黄绿色(图1L,
M), 这种形态的愈伤组织大多具胚性, 在进一步培养
过程中可诱导出胚状体或不定芽。
对各月季品种未分化的愈伤组织进行继代培养,
随着继代次数的增加, 愈伤组织的分化能力逐渐下
降, 愈伤组织的颜色和形态也不断恶化。其中, 2004-9
的部分愈伤组织退化并呈淡红色, 且结构变得疏松;
2004-8的部分愈伤组织在继代过程中产生水滴状的
透明分泌物, 且愈伤组织的结构变得致密(图1N, O)。
当继代次数超过5次后, 多数愈伤组织基本丧失分化
能力, 且大量褐化死亡。
3.3 再生植株的生根与移栽
2个月季品种2004-8和2004-9再生苗(图1P)的最适生
根培养基为: 1/2MS+0.05 mg·L–1NAA(图1Q), 生根
率均在80%以上; 且无菌苗通过驯化炼苗(图1R), 露
地移栽后成活率均高于88%。
3.4 讨论
本研究结果表明, 不同基因型、外植体类型及培
养基之间的交互作用对月季愈伤组织的形成和分化
均具显著影响, 这与Kintzios等(1999)、Li等(2002)和
任桂芳等(2004)已报道的研究结果相似。在愈伤组织
诱导过程中, 单独使用生长素类物质或与细胞分裂素
组合使用均可以诱导出愈伤组织, 但较高浓度的细胞
分裂素阻碍愈伤组织的诱导。本实验比较了2种生长
素类物质(2,4-D和NAA)对月季愈伤组织诱导的影响,
结果发现2,4-D的效果远远优于NAA, 这与Kintzios等
(1999)的研究结果不同, 但与Li等(2002)的研究结果
一致, 这可能与实验材料的基因型不同有关。在月季
植株再生研究中, Rout等(1991)、Kintzios等(2000)和
Li等(2002)利用6-BA、TDZ、NAA和2,4-D等植物生
长调节剂配比和不同培养条件的组合, 通过愈伤组织
发生、体细胞胚胎发生和器官直接发生等途径获得了
再生芽。本研究利用TDZ、2,4-D、6-BA和GA3 四种
植物生长调节剂, 诱导5个寒地月季品种愈伤组织分

_______________________________________________________________________________________________

→
图1 5个月季品种愈伤组织的诱导及植株再生
(A) 附加2,4-D的培养基诱导出的愈伤组织; (B) 附加NAA的培养基诱导出的愈伤组织继代中褐化; (C) 结构致密的愈伤组织; (D) 胚
性愈伤组织; (E) 2004-8茎段愈伤组织分化出的不定芽; (F) 2004-8叶片愈伤组织分化出的胚状体; (G) 2004-8叶片愈伤组织分化出
的不定芽; (H) 2004-9叶片愈伤组织分化出的不定芽; (I) 愈伤组织分化出的再生植株; (J) 2004-6愈伤组织在分化培养中褐化; (K)
黑暗条件下愈伤组织的形态; (L) 光照条件下愈伤组织的形态; (M) 光照条件下的愈伤组织细胞(Bar=600 µm); (N) 愈伤组织退化并
呈淡红色; (O) 愈伤组织产生的水滴状分泌物; (P) 再生植株的快速繁殖; (Q) 再生植株的生根培养; (R) 再生植株的驯化

Figure 1 Callus induction and plant regeneration of five rose cultivars
(A) The callus on medium additional 2,4-D; (B) The browning of callus on medium additional NAA; (C) The callus of tight struc-
ture; (D) Embryogenic callus; (E) Adventitious buds induced from callus of 2004-8 stems; (F) The embryoid induced from callus
of 2004-8 leaves; (G) Adventitious buds induced from callus of 2004-8 leaves; (H) Adventitious buds induced from callus of
2004-9 leaves; (I) Regenerated plants induced from callus; (J) The browning of 2004-6 callus under differentiation culture; (K)
The appearance of callus under dark culture; (L) The appearance of callus under light culture; (M) The cells of callus under light
culture(Bar=600 µm); (N) Callus degenerate into pink; (O) The drop-shaped secretions produced from callus; (P) The rapid
propagation of regenerative plants; (Q) The root training of regeneration plant; (R) The domestication of regeneration plant


574 植物学报 46(5) 2011
愈伤组织的褐化及其机理分析有待进一步研究。
参考文献
高莉萍, 包满珠 (2005). 月季萨蔓莎愈伤组织的诱导及植株
再生. 园艺学报 32, 534–536.
黄翠, 景丹龙, 王玉兵, 范深厚, 陈发菊 (2010). 水杉愈伤组
织诱导及植株再生. 植物学报 45, 604–608.
李海燕, 胡国富, 胡宝忠 (2004). 月季组培快繁技术的研究.
东北农业大学学报 35, 84–88.
李青, 苏雪痕, 李湛东 (1999). 藤本月季组织培养快繁研究.
北京林业大学学报 21(6), 17–21.
林娅, 郑玉梅, 刘青林 (2006). 影响月季愈伤组织诱导和分
化的因素. 分子植物育种 4, 223–227.
任桂芳, 王建红, 冯慧, 李毅, 李燕, 施雪波 (2004). 现代月
季(Rosa hybrida)叶片植株再生体系的建立. 园艺学报 31,
533–536.
Arene L, Pellegrino C, Gudin S (1993). A comparison of
the somaclonal variation level of Rosa hybrida L. cv
‘Meirutral’ plants regenerated from callus or direct
induction from different vegetative and embryonic tissues.
Euphytica 71, 83–90.
Dohm A, Ludwig C, Nehring K, Debener T (2001). Somatic
embryogenesis in roses. Acta Hortic 547, 341–346.
Hsia C, Korban SS (1996). Organogenesis and somatic
embryogenesis in callus cultures of Rosa hybrida and
Rosa chinensis ‘Minima’. Plant Cell Tissue Organ Cult 44,
1–6.
Kintzios S, Drossopoulos JB, Lymperopoulos C ( 2000).
Effects of vitamins and inorganic micronutrients on callus
growth and somatic embryogenesis from young mature
leaves of rose. J Plant Nutr 23, 1407–1420.
Kintzios S, Manos C, Makri O (1999). Somatic embryo-
genesis from mature leaves of rose (Rosa sp.). Plant Cell
Rep 18, 467–472.
Li XO, Krasnyanski SF, Korban SS (2002). Somatic em-
bryogenesis, secondary somatic embryogenesis, and shoot
organogenesis in Rosa. J Plant Physiol 159, 313–319.
Noriega C, Sondahl MR (1991). Somatic embryogenesis in
hybrid tea roses. Biotechnology 9, 991–993.
Rout GR, Debata BK, Das P (1991). Somatic embryogene-
sis in callus cultures of Rosa hybrida L. cv ‘Landora’. Plant
Cell Tissue Organ Cult 27, 65–69.

Callus Induction and Plant Regeneration of Rose
Xue Chen, Jinzhu Zhang, Bingbing Pan, Chengjin Sang, Xue Ma, Tao Yang, Daidi Che*
Horticulture College of Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China
Abstract We used the leaves and stems of aseptic seedlings of 5 rose cultivars that can successfully live outside
through the winter in Heilongjiang Province as explants to investigate callus induction and plant regeneration. The leaves
and stems of the 5 rose cultivars could induce callus; media containing 2,4-D could induce callus better; and a high con-
centration of cytokinin was not suitable for callus induction. TDZ played an important role in callus differentiation; culture
under light conditions was effective for callus differentiation; and callus differentiation decreased with increasing number
of subcultures. Plant regeneration could be successfully induced from the callus of 2004-8 and 2004-9 in experimentation,
and the callus differentiation rate of the 2 varieties was 45% and 38%, respectively.
Key words callus induction, plant regeneration, rose
Chen X, Zhang JZ, Pan BB, Sang CJ, Ma X, Yang T, Che DD (2011). Callus induction and plant regeneration of rose.
Chin Bull Bot 46, 569–574.
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* Author for correspondence. E-mail: daidiche@yahoo.com.cn
(责任编辑: 孙冬花)