全 文 :植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2011, 46 (6): 642–651, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2011.00642
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收稿日期: 2011-05-04; 接受日期: 2011-07-07
基金项目: 国家高技术研究发展计划(No.2011AA100201)和林业公益性行业科研专项(No.201004004)
* 通讯作者。E-mail: suxh@caf.ac.cn
美洲黑杨材性相关候选基因PdCYTOB的功能鉴定
李少锋, 苏晓华*, 张冰玉, 黄秦军, 褚延广, 丁昌俊
中国林业科学研究院林业研究所, 国家林业局林木培育重点实验室, 北京 100091
摘要 利用RT-PCR技术研究了美洲黑杨(Populus deltoides)材性相关候选基因细胞分裂素结合蛋白(cytokinin binding
protein)基因PdCYTOB的表达谱, 结果显示, 在未成熟木质部、未成熟韧皮部和韧皮部中PdCYTOB基因具有较高水平的表
达量。对导入反义PdCYTOB的山新杨(Populus davidiana × P. bolleana)植株进行Southern杂交和RT-PCR检测, 证实反义
PdCYTOB基因已整合到杨树基因组中并表达。对大田转基因株系及对照植株进行表型观察、组织切片和微纤丝角的测定,
结果表明, 转反义PdCYTOB基因植株的高度明显增加, 木质部、韧皮部变宽, 微纤丝角明显变小, 初步表明转基因杨树在
造纸性能上有所改良。这些研究结果对于阐明PdCYTOB在美洲黑杨木材形成中的分子作用机制具有重要的理论意义。
关键词 PdCYTOB, 美洲黑杨, 材性调控
李少锋, 苏晓华, 张冰玉, 黄秦军, 褚延广, 丁昌俊 (2011). 美洲黑杨材性相关候选基因PdCYTOB的功能鉴定. 植物学报
46, 642–651.
美 洲 黑 杨 (Populus deltoides) 属 于 杨 柳 科
(Salicaceae)杨属 (Populus)黑杨派 (Sect Aigeiros),
自然分布于北美洲的北纬30°–50°地区, 主要分布在
密西西比河及其支流河谷冲积平原。1972年美洲黑杨
首次被引入我国, 其无性系I-63、I-69经引种实验, 目
前在北纬29°–37°的广大平原均有广泛栽培。美洲黑
杨具有速生、丰产、抗病、适应性强和材质优良等优
点, 为杨树基因工程提供了丰富的基因资源。近年来
从美洲黑杨中分离了FT2、PdPI等花发育相关基因,
POMT-7、psbD、psbC、psbE-F-L-J、NADP-ME、
5.8S rDNA gene、PdLOX1和PdLOX2等来源于美洲
黑杨的基因虽已被克隆, 但其功能还有待鉴定和注释
(Doorsselaere et al., 1991; DOvidio, 1992; Naithani
et al., 1997; Reddy et al., 1998; Cheng et al., 2006;
Hsu et al., 2006; Zhang et al., 2008; Kim et al.,
2008)。
目前已有报道通过转基因技术获得材性改良的
杨树。如Lee等(2009)的研究证明, RNA干扰(RNAi)
技术抑制PoGT47C的表达后, 转基因银白杨×欧洲山
杨杂交杨(Populus alba × P. tremula)植株次生细胞
壁厚度明显减小, 葡糖醛酸木聚糖的合成受阻, 导管
外观变形, 纤维素含量下降。Biemelt等(2004)通过组
织化学方法发现, 在杨树中过量表达细胞分裂素合成
基因 ISOPENTENYL、TRANSFERASE(IPT), 抑制
了木质化和木质部形成。Wei等(2008)将CCoAOMT
基因反义转化欧洲山杨 ×银白杨杂种 (Populus
tremula × P. alba), 获得的转基因再生植株中木质素
含量降低了13%, S/G比值略有增加, 乙醇提取物含
量减少。Gray-Mitsumune等(2008)将PttEXPA1基因
导入欧洲山杨×颤杨杂交杨(Populus tremula × P.
tremuloides), 能提高转基因杨树伸展蛋白(expan-
sin)的活性, 使细胞壁扩张, 从而伸长干节间, 增大
叶表皮细胞及扩大叶面积。从具备优良材质特性的美
洲黑杨中分离影响木材性状形成的候选基因, 进而阐
明这些候选基因表达调控的机制, 这方面的研究还较
为薄弱, 国内外尚未见报道。细胞分裂素结合蛋白
(cytokinin binding proteins, CBPs)可能在细胞分裂
素(CTKs)的信号转导、体内运输及代谢中起重要作
用。现有研究结果显示, 大多数CTKs受体可能位于膜
上, 通过与G蛋白偶联的信号转导系统或双组分信号
转导系统完成CTKs信号的跨膜转导 (王震宇等 ,
2000)。不同植物含有不同的CBPs, CBPs的多样性反
·研究报告·
李少锋等: 美洲黑杨材性相关候选基因 PdCYTOB的功能鉴定 643
映了植物体内CTKs作用效应的多样性。Brinegar等
(1985)从玉米 (Zea mays)白色体、大麦 (Hordeum
vulgare)叶绿体分离的细胞分裂素结合蛋白CBP70,
是质体的转录延伸因子, 参与细胞分裂素调节质体的
转录延伸活性, 并调控质体的生物发生。有关细胞分
裂素结合蛋白是否具有影响材性方面的功能研究, 国
内外还未见报道。双链RNA能特异抑制或沉默靶基因
的表达, 产生转基因植株靶基因缺失的表型。RNAi
为植物分子育种或功能基因组学研究提供了新的研
究方法 , 在毛酸浆 (Physalis pubesecens)(He and
Saedler, 2005)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Kim
et al., 2011)、烟草(Nicotiana tabacum)(DeBoer et
al., 2011)和杨树(Li et al., 2011)等植物的转基因研究
中均有应用。
本研究组的前期工作利用成年美洲黑杨主干不
同高度处木材性状(木材密度、微纤丝角大小)存在的
差异, 建立了未成熟木质部的cDNA表达芯片, 筛选
出与木材密度和微纤丝角相关的候选基因PdCYTOB
(Arabidopsis thaliana thaumatin-like cytokinin
binding protein)。PdCYTOB基因的表达量与美洲黑
杨主干不同高度处微纤丝角的相关性比较大, 相关系
数CRw为0.78。随后利用RACE技术分离了PdCY-
TOB基因, 构建了该基因的反义植物表达载体, 并导
入山新杨(Populus davidiana × P. bolleana), 获得
PdCYTOB反义转化的再生植株48株(王大海, 2008),
并于2009年5月将其移栽到玉泉山实验地。本文在上
述研究基础上运用荧光实时定量PCR技术(real time
PCR)分析了PdCYTOB基因在美洲黑杨成年树木不
同组织或器官中的表达谱, 并对转基因山新杨进行分
子检测及材性分析, 为进一步阐明PdCYTOB在影响
材性方面的功能提供了有价值的资料。
1 材料与方法
1.1 实验材料
美洲黑杨(Populus deltoides Marsh.)取材地点为中
国林业科学研究院院内实验地, 取材时间为2009年8
月中旬, 此时树木未成熟木质部活动旺盛。选择树干
生长饱满通直的15年生美洲黑杨成年母树, 用裁纸
刀去除胸径处树皮, 暴露韧皮部、形成层和未成熟木
质部等组织。用裁纸刀刮取未成熟韧皮部、成熟韧皮
部、形成层以内未成熟木质部和木质部组织, 用液氮
速冻后保存于–70°C条件下; 同时取叶片、叶芽和花
芽, 经液氮速冻后于–70°C条件下保存, 用于各组织
部位表达谱的分析。
转反义PdCYTOB基因的山新杨(Populus david-
iana × P. bolleana)试材取自玉泉山实验地。2010年9
月取山新杨再生植株的幼叶, 用于提取基因组DNA,
分别进行PCR和Southern杂交分析。对PCR检测具阳
性信号的再生植株, 从顶部向下截取长度约为5 cm
的茎段 , 去除叶片及叶柄 , 经液氮速冻后保存于
–70°C, 提取总RNA, 用定量PCR法分析基因表达
量。对PCR和Southern杂交检测均具阳性信号的植株
从顶部每节取材, 制备茎横切面石蜡切片, TBO染色
并观察。同时取转基因和非转基因对照植株的基部茎
段测定微纤丝角。
1.2 实验方法
1.2.1 转基因山新杨植株的PCR检测和Southern杂
交分析
根据pBI121载体上的NPTII序列设计引物, 对遗传转
化后的再生植株进行PCR检测。引物序列为: NPTII
Primer1, 5-ATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCC-
T-3; NPTII Primer2, 5-GAAGAACTCGTCAAGAA-
GGCGATAGAAG-3。转基因植株的DNA提取采用
CTAB法(王关林和方宏筠, 2002)。
取10 μg转基因山新杨基因组总DNA用XbaI、
EcoRI分别酶切, 以Biotin标记的NPTII序列为探针,
按照 North2SouthTM Biotin Random Prime Kit
(Thermo, 美国 )和North2South Chemiluminescent
Hybridization and Detection Kit (Thermo, 美国)说明
书进行Southern杂交。
1.2.2 美洲黑杨PdCYTOB基因的时空表达分析
从美洲黑杨未成熟韧皮部、成熟韧皮部、未成熟木质
部、木质部组织、叶片、叶芽和花芽中提取总RNA。
总 RNA的提取采用奥莱博生物技术有限公司
(Autolabtech, 中国)生产的植物总RNA提取试剂盒
(Cat#: AL-BRE-004-100), 具体操作过程参照其说明
书。总RNA提取后, 用RNase-free DNase(Promega,
上海)处理15分钟, 酚/氯仿抽提去除DNase, 70%乙
醇沉淀回收RNA。采用TAE琼脂糖凝胶电泳检测RNA
644 植物学报 46(6) 2011
质量, 并利用MM-LV反转录试剂盒(Promega, 美国)
进行cDNA的反转录。具体操作步骤: (1) 以提取的总
RNA为模板 , 2–6 µL RNA样品 , 加入2 µL CDS
PrimerIIA Oligo(dT)15–30, 加水补足至总体积10 µL,
混合并短暂离心; (2) 72°C温育2分钟, 立即置于冰上
2分钟, 并短暂离心, 用PCR仪72°C温育2.5分钟; (3)
加入下列成分 : 4 µL 5×first-strand buffer、2 µL
DTT(20 mmol·L–1)、2 µL dNTP mix(10 mmol·L–1 of
each dNTP)和2 µL reverse transcriptase; (4) 轻轻
混匀并短暂离心, 42°C温育1.5小时; (5) 将离心管放
于冰上终止反应, –20°C条件下保存; (6) 加90 µL
ddH2O混匀, 取1 µL作为模板, 用于PCR反应。
利用引物设计软件Primer Premier 5.0设计荧光
实时定量PCR引物, 根据PdCYTOB基因的编码区序
列, 设计1对能够扩增200 bp左右片段的引物。RT-
PCR引物序列如下: PdCYTOB RTF, 5-GCCGCTT-
TGGCACAGATTAC-3; PdCYTOB RTR, 5-CGC-
TTTGGCACAGATTACCC-3。以逆转录合成的第1
链cDNA为模板, 经94°C预变性3分钟后采用94°C 30
秒, 60°C 30秒, 72°C 1分钟的反应条件进行35个循环
扩增, 并于72°C延伸7分钟后置于4°C冰箱中备用。以
微管蛋白基因tubulin作为参照物, 引物序列为TUAF:
5-CTGCCCGTTGCTCTGATGATTCA-3; TUAR: 5-
CCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCT-3。
定量PCR反应按照SYBR Premix Ex TaqTM
(TaKaRa, 日本)试剂盒所附说明书提供的方法进行:
在PCR 8连管中依次加入10 µL SYBR Premix Ex
TaqTM、0.4 µL PCR Forward primer、0.4 µL PCR
Reverse primer、0.4 µL ROX Reference dye II、2 µL
cDNA和6.8 µL灭菌蒸馏水, 终体积为20 µL, 轻微离
心, 收集到管底。PCR反应在ABI 7500 Real-time
PCR仪上按照下列程序进行: 95°C 10秒; 95°C 5秒,
59°C 34秒, 40个循环。PCR反应结束后, 制作熔解曲
线检查是否有非特异扩增, 然后应用ABI sequence
detection system分析软件分析定量PCR结果。
1.2.3 转基因山新杨植株的荧光实时定量PCR分析
转基因山新杨单株的RNA提取按照1.2.2节所描述的
方法进行, 利用MM-LV反转录试剂盒(Promega, 美
国)进行cDNA的反转录。PdCYTOB基因和内参基因
的引物序列与1.2.2节所列出的一致。定量PCR检测
同样按照SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa, 日本)试
剂盒所附说明书提供的方法进行。
1.2.4 转基因山新杨植株的解剖结构分析和微纤丝
角测定
采用石蜡切片技术(赵树堂, 2006)进行茎横切面解剖
并制作切片, 以观察韧皮部、形成层和木质部的细胞
层数、数目变化及次生生长情况。微纤丝角的测定采
用偏光显微镜法, 将20 µm厚的弦切面切片, 经脱木
素、染色和固定处理, 使用偏光显微镜测量2–3个切
片, 随机测量25根纤维的微纤丝角, 取平均值。得出
的样品微纤丝角数据采用SPSS软件进行差异显著性
分析。
2 结果与讨论
2.1 美洲黑杨PdCYTOB基因的结构特征分析
将本课题组前期分离获得的PdCYTOB序列(NCBI注
册号为DQ450358.1)提交到NCBI网站 (http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html), 进行Blast比对分
析。结果表明, PdCYTOB与毛果杨(Populus tricho-
carpa)PtCYTOB(GenBank No.XM_002313409.1)、
蓖麻 (Ricinus communis)RcCYTOB(GenBank No.
XM_002531318.1)、柠檬(Citrus jambhiri) CjCYTOB
(GenBank No.AB467316.1)、爱玉子 (Ficus awk-
eotsang)FaCYTOB(GenBank No.DQ277013.1)、甘
蓝(Brassica oleracea)BoCYTOB(GenBank No.AF3-
55805.1)和拟南芥AtCYTOB(GenBank No.AF355-
806.2)基因的同源性分别为97%、79%、78%、73%、
73%和73%; PdCYTOB蛋白与这些CYTOB蛋白的同
源性分别达到94%、81%、78%、78%、74%和73%。
据此, 我们进一步构建了多种植物CYTOB蛋白的序
列比对图(图1)和进化树(图2)。通过NCBI检索并结合
蛋白序列比对的初步结果表明, 该基因是美洲黑杨中
首次克隆的CYTOB蛋白基因, 命名为PdCYTOB, 其
编码区长度为744 bp, 可编码长度为247个氨基酸残
基的蛋白质。
2.2 PdCYTOB基因在美洲黑杨成年树木不同组
织部位的表达谱分析
对美洲黑杨未成熟韧皮部、成熟韧皮部、未成熟木质
李少锋等: 美洲黑杨材性相关候选基因 PdCYTOB的功能鉴定 645
图1 PdCYTOB与其它植物CYTOB蛋白质的一级结构比较
Figure 1 Comparison of the primary structure of PdCYTOB with CYTOB protein from different organisms
图2 植物CYTOB蛋白的系统进化分析
标尺代表氨基酸序列的一致性水平。
Figure 2 Phylogenetic analysis of CYTOB protein in plants
The rule represents the homology level of amino acid se-
quences.
部、木质部、叶片、叶芽和花芽组织的总RNA进行定
量RT-PCR分析。结果表明, PdCYTOB基因在美洲黑
杨各组织中的表达模式不同: 在未成熟木质部中的表
达量最高, 在未成熟韧皮部、叶芽、韧皮部、花芽、
木质部、叶片中表达量依次降低(图3)。由于取材时间
为8月, 树木生长发育处于旺盛阶段, PdCYTOB基因
较特异地在未成熟木质部和未成熟韧皮部中表达, 表
明PdCYTOB参与了木质部的物质形成, 在木材形成
中可能起重要调控作用。
2.3 转反义PdCYTOB基因山新杨的PCR检测和
Southern杂交检验
用NPTII基因的特异引物对转基因山新杨再生植株和
非转基因对照植株的基因组DNA进行PCR扩增。结果
表明, 在所检测的抗卡那霉素的48株山新杨中, 13株
扩增出约0.7 kb的DNA片段, 其大小与以pBI121-
PdCYTOB质粒为模板的扩增片段相同, 从而可以初
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图3 PdCYTOB基因在美洲黑杨中的组织表达谱分析
1: 未成熟韧皮部; 2: 未成熟木质部; 3: 叶芽; 4: 花芽; 5: 韧皮
部; 6: 木质部; 7: 叶片
Figure 3 Tissue expression pattern of PdCYTOB gene in
Populus deltoides
1: Immature phloem; 2: Immature xylem; 3: Leaf bud; 4: Flo-
ral bud; 5: Mature phloem; 6: Mature xylem; 7: Leaf
步推断这些植株为反义PdCYTOB基因的阳性转化植
株(图4A)。
对转PdCYTOB基因山新杨和对照植株基因组
DNA进行XbaI/EcoRI双酶切 , 以biotin标记的NPTII
序列为探针进行Southern杂交。结果显示(图4B), 转
基因株系中均出现1条明显的杂交条带, 其大小约为
600 bp, 而对照植株无杂交条带, 说明PdCYTOB基
因已整合到转基因株系的基因组中。
2.4 荧光实时定量PCR检测
提取转基因杨树和对照植株的RNA并反转录, 以第1
链cDNA为模板, 微管蛋白基因tubulin作为参照物,
进行定量PCR分析。结果显示(图5), PdCYTOB的表达
在转基因植株个体之间差异明显, 与对照未转基因植
株相比, 反义PdCYTOB转化株系CtB1、CtB2、CtB3、
CtB4、CtB5和CtB6中PdCYTOB的表达水平分别下降
了98.62%、87.12%、89.61%、79.76%、57.49%和
90.39%, 说明PdCYTOB反义导入后, 在mRNA水平
上有效地改变了转基因植株体内该基因的表达量。
图4 反义PdCYTOB转基因杨树的分子鉴定
(A) 转基因杨树的PCR检测 M: DNA分子量标准(DL-2000
marker); 1–13: 转反义PdCYTOB株系; +: 阳性对照(以质粒
pBI121-antisense PdCYTOB为模板的PCR); –: 阴性对照(非
转基因植株); (B) 转基因杨树的Southern杂交检测 CK–: 阴性
对照 (非转基因植株 ); CtB1、CtB2、CtB4、CtB5: 转反义
PdCYTOB株系
Figure 4 Molecular analysis of antisense PdCYTOB trans-
genic poplar
(A) PCR analysis of transgenic poplar M: DL-2000 marker;
1–13: Antisense PdCYTOB transgenic plants; +: The positive
control (plasmid pBI121-antisense PdCYTOB); –: The nega-
tive control (Non-transgenic plant); (B) Southern blotting
assay of transgenic poplar CK–: The negative control
(Non-transgenic plant); CtB1, CtB2, CtB4, CtB5: Antisense
PdCYTOB transgenic plants
2.5 转基因山新杨的表型和解剖结构分析
将转基因山新杨移栽到温室, 重新扦插, 然后移栽到
大田, 对扦插后幼苗阶段的植株表型进行观察后发现
(表1), CtB1株系的各植株与其对照株的株高差异不
明显(sig=0.096), 而CtB2(sig=0.020)、CtB4(sig=
0.040)和CtB5(sig=0.030)株系的各植株与其对照株
的株高均差异明显; CtB1、CtB2和CtB4各株系的植株
与其对照植株的地径均无显著差异, sig数值分别为
0.104、0.211和0.342, 仅CtB5株系的各植株地径与
李少锋等: 美洲黑杨材性相关候选基因 PdCYTOB的功能鉴定 647
图5 反义PdCYTOB转基因杨树植株的real-time PCR检测
CtB1–CtB6: 转基因植株; CK–: 非转基因对照植株
Figure 5 Real-time PCR analysis of antisense PdCYTOB
transgenic poplar
CtB1–CtB6: Transgenic plants with antisense PdCYTOB;
CK–: Non-transgenic plant
其对照株差异明显(sig=0.042)。
根据PCR初筛和real-time PCR检测结果, 选取
CtB1植株及其对照植株, 从顶部每节取材进行茎横
切面的切片观察(图6)。综合观察到的解剖特征发现
(表2), 在第25节, 反义转化植株木质部、韧皮部的层
数和宽度与对照相比表现出明显差异, 对照植株木质
部区域有90–95层细胞, 而PdCYTOB反义转化植株
CtB1的木质部区域明显变宽, 达到98–103层细胞;
与对照相比CtB1植株木质部和韧皮部的宽度分别提
高了19.58%和17.93%。在第35节, CtB1植株木质部
和韧皮部的层数也比野生型植株明显增多, 野生型植
株木质部区域有116–120层细胞, 而CtB1植株的木
质部区域达到121–128层细胞; CtB1的韧皮部宽度与
对照相比略有增大, 增幅为6.09%, 其木质部宽度相
比对照稍有增加(表2)。
2.6 转基因山新杨的微纤丝角测定
对PdCYTOB反义转化株系及其对照植株的微纤丝角
进行测定, 发现两者差异明显。与各自的对照株相比,
CtB1的 3个单株的微纤丝角平均值分别下降了
24.35%、16.31%和19.80%(sig=0.001); CtB4的3个
单株分别下降了5.14%、4.86%和6.35%(sig=0.001);
表1 反义PdCYTOB转基因杨树植株的株高和地径汇总表(实
验地)
Table 1 Summary table of plant height and stem base of
antisense PdCYTOB transgenic poplar plants (experimental
field)
Class Height (cm) Stem base (mm)
CtB1 control 22.8±0.17 3.11±0.14
CtB1-1 26.7±0.12 3.31±0.09
CtB1-2 25.1±0.11 3.55±0.11
CtB1-3 23.2±0.10 3.17±0.08
CtB2 control 38.5±0.11 3.55±0.13
CtB2-1 39.5±0.09 3.52±0.08
CtB2-2 41.3±0.14 3.77±0.09
CtB2-3 40.9±0.12 3.69±0.07
CtB4 control 33.0±0.09 3.47±0.11
CtB4-1 38.9±0.07 4.01±0.10
CtB4-2 34.5±0.12 3.41±0.09
CtB4-3 37.1±0.08 3.57±0.11
CtB5 control 23.8±0.13 2.21±0.08
CtB5-1 27.8±0.11 2.58±0.14
CtB5-2 29.7±0.09 3.07±0.12
CtB5-3 25.6±0.10 2.52±0.08
CtB1 control、CtB2 control、CtB4 control、CtB5 control: 转
基因株系CtB1、CtB2、CtB4、CtB5的对照植株; CtB1-1、
CtB1-2、CtB1-3: 转基因株系CtB1的3个单株; CtB2-1、CtB2-2、
CtB2-3: 转基因株系CtB2的3个单株; CtB4-1、CtB4-2、CtB4-3:
转基因株系CtB4的3个单株; CtB5-1、CtB5-2、CtB5-3: 转基因
株系CtB5的3个单株。
CtB1 control, CtB2 control, CtB4 control, CtB5 control: The
control plant of different transgenic poplar lines CtB1, CtB2,
CtB4, CtB5; CtB1-1, CtB1-2, CtB1-3: Three individual plants
of transgenic poplar line CtB1; CtB2-1, CtB2-2, CtB2-3: Three
individual plants of transgenic poplar line CtB2; CtB4-1,
CtB4-2, CtB4-3: Three individual plants of transgenic poplar
line CtB4; CtB5-1, CtB5-2, CtB5-3: Three individual plants of
transgenic poplar line CtB5
CtB5的3个单株分别下降了8%、14.77%和12.08%
(sig=0.005)(表3)。3个反义PdCYTOB转基因株系的
微纤丝角相比各自对照均变小, 且差异明显, 表明转
基因植株的纤维弹性模量和强度增强, 木材强度大,
纵向收缩小, 利用该原料制出理想纸品的潜力较大。
2.7 讨论
迄今为止已从柠檬、花椰菜(Brassica oleracea)和拟
南芥等中分离到CYTOB的同源基因, 然而从林木中
分离该基因并分析其功能尚未见报道。在本课题组的
前期研究中, 运用RACE技术首次从美洲黑杨雌株中
648 植物学报 46(6) 2011
图6 反义PdCYTOB转基因杨树及其对照植株的茎横切面解剖结构
(A) 非转基因对照植株(第25节); (B) PdCYTOB反义转化植株(第25节); (C) 对照植株(第35节); (D) PdCYTOB反义转化植株(第35节)
Figure 6 The transverse anatomy structure of stem of the wild-type and transgenic poplar with antisense PdCYTOB
(A) Non-transgenic poplar (the 25th node); (B) Transgenic poplar with antisense PdCYTOB (the 25th node); (C) Non-transgenic
poplar (the 35th node); (D) Transgenic poplar with antisense PdCYTOB (the 35th node)
表2 反义PdCYTOB转基因杨树及其对照植株的茎横切面解剖特征汇总
Table 2 Summary of transverse anatomy characteristics of stem of the wild-type and transgenic poplar with antisense PdCY-
TOB
Phloem Cambium Xylem
Number of walls Width (µm) Number of walls Width (µm) Number of walls Width (µm)
Control (the 25th node) 30–33 470.23 4–6 30.07 90–95 1 630.38
CtB1 (the 25th node) 36–39 562.32 5–6 35.36 98–103 1 922.67
Control (the 35th node) 28–31 480.85 4–6 30.35 116–120 2 291.12
CtB1 (the 35th node) 33–37 510.08 5–6 33.78 121–128 2 305.69
Control: 非转基因杨树植株; CtB1: 反义PdCYTOB转基因株系
Control: Untransformed poplar plant; CtB1: Transgenic poplar line with antisense PdCYTOB
分离了CYTOB的同源基因PdCYTOB, 表明CYTOB
基因广泛存在于高等植物中(王大海, 2008)。第1个被
鉴定的细胞分裂素结合蛋白是Fox和Erion(1975)在
小麦(Triticum aestivum)胚中发现的细胞分裂素结合
因子(CBF-1)。该蛋白质是由3个分子量为54 kDa的相
同亚基构成的三聚体, 3个亚基相互作用形成1个细胞
分裂素(CTKs)结合位点(Fox and Erion, 1975)。植物
体内CTKs的作用效应具有多样性, 且其作用机制尚
不清楚。Kulaeva等(1990)研究发现, 分别用BA和反
式玉米素的特异性抗体从大麦中分离的30 kDa和67
kDa的CBPs均能促进大麦RNA的合成, 表明CTKs能
够促进RNA和蛋白质的合成。这些研究结果表明, 细
胞分裂素结合蛋白参与调控植物发育, 但其是否具有
材性方面的功能还需要进一步研究。
李少锋等: 美洲黑杨材性相关候选基因 PdCYTOB的功能鉴定 649
表3 反义PdCYTOB转基因杨树及其对照植株的微纤丝角平
均值、变异幅度及变异系数
Table 3 Average value, range and standard deviation of
microfibrillar angle in the wild-type and transgenic poplar with
antisense PdCYTOB
Sample Average
value (°)
Standard
deviation
Range(°)
CtB1 control 16.92 2.77 13–23
CtB1-1 12.80 1.12 11–15
CtB1-2 14.16 1.60 11–18
CtB1-3 13.57 1.35 11–17
CtB4 control 14.80 1.22 12–17
CtB4-1 14.04 1.17 12–16
CtB4-2 14.08 1.38 11–16
CtB4-3 13.86 1.29 11–15
CtB5 control 13.00 1.00 11–15
CtB5-1 11.96 1.10 9–14
CtB5-2 11.08 1.08 9–13
CtB5-3 11.43 1.21 10–14
CtB1 control、CtB4 control、CtB5 control、CtB1-1、CtB1-2、
CtB1-3、CtB4-1、CtB4-2、CtB4-3、CtB5-1、CtB5-2和CtB5-3
同表1。
CtB1 control, CtB4 control, CtB5 control, CtB1-1, CtB1-2,
CtB1-3, CtB4-1, CtB4-2, CtB4-3, CtB5-1, CtB5-2 and CtB5-3
see Table 1.
我们的研究发现, PdCYTOB基因在美洲黑杨未
成熟木质部、未成熟韧皮部和韧皮部中的表达水平均
较高, 在未成熟木质部中的表达量尤其高。这可能是
由于8月份美洲黑杨木材发育旺盛, 形成层向外分化
形成未成熟木质部和未成熟韧皮部组织的活动持续
进行所导致。PdCYTOB基因在未成熟木质部、未成
熟韧皮部有较高水平的表达, 表明该基因很可能是美
洲黑杨木材形成和发育过程中的关键基因。
为了深入研究PdCYTOB基因在木质部、韧皮部
分化和木材形态建成中的具体功能, 本研究在获得转
反义PdCYTOB基因的山新杨植株的基础上 , 通过
PCR检测、Southern杂交和荧光实时定量PCR分析,
证明PdCYTOB已整合到受体杨树的基因组中, 获得
了6个目标基因表达被抑制的反义PdCYTOB转化株
系。与对照相比, PdCYTOB在这些植株中的表达量分
别下降了57.49%–98.62%, 说明反义RNA技术能有
效降低转基因植株中目标基因的表达。对转基因杨树
的组织切片研究发现, PdCYTOB反义转化有可能促
使转基因植株茎杆加粗, 推测PdCYTOB可能作为负
调控因子参与木材形成和发育的分子调控。微纤丝角
是木材次生壁S2层中微纤丝排列方向与细胞轴向之
间的夹角, 是细胞壁的基本性质之一, 也是评估木材
材质和纸张强度的重要指标(张冬梅等, 2007)。转反
义PdCYTOB杨树植株的微纤丝角变小, 与对照相比
降低了4.86%–24.35%, 可为造纸工业提供高强度、
高模量纤维原材。进一步的材性报道将会在后续跟踪
进行。反义PdCYTOB转基因杨树的分子检测和材性
分析为全面深入地了解PdCYTOB基因在木材形成和
发育过程中的功能和分子作用机制提供了理论依据,
同时为CYTOB基因的功能提供了新注释。
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李少锋等: 美洲黑杨材性相关候选基因 PdCYTOB的功能鉴定 651
Functional Identification of Wood-property Candidate Gene
PdCYTOB in Populus deltoides
Shaofeng Li, Xiaohua Su*, Bingyu Zhang, Qinjun Huang, Yanguang Chu, Changjun Ding
Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation, State Forestry Administration, Research Institute of Forestry, Chinese
Academy of Forestry, Beijing 100091, China
Abstract We used quantitative real-time RT-PCR to investigate the tissue expression patterns of cytokinin binding-
protein PdCYTOB, which is related to the wood properties of Populus deltoides. PdCYTOB was expressed predominantly
in immature xylem, immature phloem and the phloem zone of the stem of P. deltoides. Southern blot and RT-PCR were
used to detect antisense PdCYTOB-transgenic Populus davidiana × P. bolleana plants. The antisense PdCYTOB gene
was integrated into the genome of the poplar and expressed. Phenotype, anatomical studies and microfibrillar angle
analysis revealed the plant height of transgenic poplar higher than that of untransformed lines, as well as xylem and the
phloem zone of plants with antisense PdCYTOB wider than those of untransformed lines. In addition, the microfibrillar
angle of transgenic plants was decreased in the test field. Thus, pulping and papermaking properties might be improved in
antisense-PdCYTOB transformed lines. Our study sheds light on the molecular mechanism of PdCYTOB in wood forma-
tion in P. deltoides.
Key words PdCYTOB, Populus deltoides, wood property
Li SF, Su XH, Zhang BY, Huang QJ, Chu YG, Ding CJ (2011). Functional identification of wood-property candidate
gene PdCYTOB in Populus deltoides. Chin Bull Bot 46, 642–651.
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* Author for correspondence. E-mail: suxh@caf.ac.cn
(责任编辑: 刘慧君)