全 文 ：第 !" 卷第 #$ 期
!$$" 年 #$ 月
生 态 学 报
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基金项目：国家自然科学基金资助项目（5$5"#$67）；中国科学院知识创新工程重要方向资助项目（89&:!;<=;5$>）；土壤与农业可持续发展国
家重点实验室基金资助项目（$77#!!）
收稿日期：!$$6;$>;#7；修订日期：!$$";$?;!>
作者简介：钟文辉（#@67 A），男，江西瑞金人，博士，教授，主要从事环境微生物及环境生物技术研究2 (;BCD1：EF0GHIJGFKDL GMGK2 JNK2 3G
!通讯作者 &0OOJPQ0GNDGH CK4F0O：(;BCD1：E33CDL DPPCP2 C32 3G
/)0.1-",). ,"’2：’FJ QO0MJ34 ICP RDGCG3DC11S PKQQ0O4JN TS 4FJ .C4D0GC1 .C4KOC1 -3DJG3J U0KGNC4D0G 0R &FDGC（.02 5$5"#$67），4FJ 8G0I1JNHJ ,GG0VC4D0G
WO0HOCB 0R &FDGJPJ %3CNJBS 0R -3DJG3JP （.02 89&:!;<=;5$>）CGN 4FJ 0QJG RKGN 0R 4FJ -4C4J 8JS *CT0OC40OS 0R -0D1 CGN -KP4CDGCT1J %HOD3K14KOJ （.02
$77#!!）
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3G
用 9:3;<==>研究长期施用无机肥对种稻
红壤微生物群落多样性的影响
钟文辉#，!，蔡祖聪#，!，尹力初?，张Z 鹤!
（#2土壤与农业可持续发展国家重点实验室（中国科学院南京土壤研究所），南京Z !#$$$>；
!2 南京师范大学化学与环境科学学院，南京Z !#$$@"；?2 湖南农业大学资源环境学院，长沙Z 5#$#!>）
摘要：以中国科学院红壤生态试验站的发育于第四纪红粘土的种稻红壤为研究对象，采用 W&[;Y++( 方法研究了长期施用无
机肥对土壤微生物群落多样性的影响。在种植双季稻、连续 #?C施用不同无机肥后，土壤中细菌、古菌、放线菌和真菌的群落结
构发生了较大的变化。未种植水稻的土壤与种稻土壤间四类微生物 --\ OY.% Y++(带谱相似性只有 ??] A 66]。施磷肥的
处理 .W、W8、.W8之间微生物群落结构相似性较高，5 类微生物的 --\ OY.% Y++( 带谱相似性高达 "7] A >#]。施氮钾肥
（.8）、不施肥（&8）处理与施磷肥处理间土壤微生物群落结构的差异较大，其四类微生物的 --\ OY.% Y++( 带谱相似性分别
为 6@] A""]、77] A""]。研究的目的是深入地了解土壤中微生物群落的多样性，为科学施肥、合理利用土壤、保护微生物
多样性和实现农业生态系统的可持续发展提供科学依据。
关键词：种稻红壤；微生物多样性；细菌；放线菌；真菌；古菌；W&[;Y++(
文章编号：#$$$;$@??（!$$"）#$;5$##;$>Z 中图分类号：^#5!，^@?>，-#752 ?6Z 文献标识码：%
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栽培水稻是红壤的主要利用方式之一。红壤是高度风化和淋溶的土壤，#Q 低、营养缺乏，特别是磷和氮比较
缺乏［J］，作物通常受酸度和营养供给不足的限制。
土壤微生物种类极其丰富，在土壤生态系统中有着至关重要的作用。在生态学和环境科学中，土壤微生
物的多样性及其作用的研究越来越受到重视。土壤微生物多样性的研究方法很多，从目前国内外采用的方法
来看，大致上包括传统的微生物平板纯培养方法、群落水平生理代谢谱分析法（如 R,)*)+ 微平板法）、微生物
生物标记物分析法（如
有很多的缺陷，不能很好地反映土壤微生物多样性［O］。如可分离的微生物种类只占总数的 J1 U JV1，许多
“存活但不能培养”的微生物不能被分离和鉴定，这就使得采用新的技术和方法显得尤为必要。当前，群落水
平生理代谢谱分析法、微生物生物标记物分析法和分子生物学方法是应用最广泛的方法［0］。
分子生物学方法如
子工具来比较土壤微生物种群的多样性和对种群动态监测。
本研究采用
研究土壤利用方式变化和长期施无机肥条件下微生物群落多样性的变化。本研究的目的在于研究
肥、合理利用土壤、保护微生物多样性和实现农业生态系统的可持续发展提供科学依据。
)* 材料与方法
)& )* 长期试验描述和采样
长期定位试验始于 JLLV 年，设置于中国科学院鹰潭红壤生态试验站（OIXJHY0VZ;，JJ3XHHY0VZE）。该地区
是典型的亚热带季风气候，年降雨量 JGLH 88，年蒸发量 J0JI 88，年平均气温 JG& 3[。土壤为发育于第四
纪红粘土母质的红壤，作物为早稻和晚稻双季稻，冬季休闲。H 个处理分别为不施肥对照 （K=）、;=、;<、<=
和 ;<=，每个处理 W 个重复。;、< 和 = 肥分别为尿素、过磷酸钙和氯化钾，年施用量分别为：尿素 000 F+ $
!8O，过磷酸钙 OG0 F+ $ !8O，氯化钾 JOW F+ $ !8O。< 和 = 作为基肥施用，氮肥分别作基肥和追肥施用（比例
OHV\I0）。水稻籽粒和秸秆均收获。
于 OVV0 年 0 月（此时土壤休耕）从试验区采取耕作层（V U OV (8）土壤，同时从邻近的未开垦荒地采取表
层土壤（K=’）作对照，剔除根系后过 O 88筛，W[保存，所有分析在两个月内完成。
OJVW ] 生] 态] 学] 报] ] ] OG 卷]
!""#：$ $ %%%& ’()*)+,(-& (.
!& "# 土壤 /01的提取和 2/01的 345扩增
采用 6-7"/01! 8390 :," ;)2 8),*试剂盒和 6-7" 32’#<=63>?@ 核酸提取仪提取土壤 /01。345引物按照
文献报道合成，345条件列于表 >。为提高灵敏度和有利于 /AAB分析，使用了嵌套式 345扩增技术（.’7"’C
345 "’(!.,DE’）：在第一轮扩增中使用各类微生物的特征引物及其相对应的 345程序。在第二轮扩增中使用
通用引物或特征引物对第一轮扩增产物进行再次扩增。由于放线菌属于细菌域（C)F-,. ); "!’ G-("’2,-），故
在第二轮扩增中使用了细菌通用引物 3HHI;和 3J>I2。345反应体系的组成如下：上、下游引物各 @& ? "F)* $
K，C0<3 ?@@ "F)* $ K ，=+4*?>& J FF)* $ K，> L <-D /01 聚合酶缓冲液（不含 =+
? M），每 J@"* 反应体系用 <-D
/01 聚合酶 >& ?JN。在第一轮 345 中每 ?J"* 345 反应体系中加入 /01 提取物 >"*，在第二轮 345 中每
J@"* 345 反应体系中加入第一轮扩增产物 >"*。345结束后用 >& JO琼脂糖凝胶检验扩增片段。345 样品
在 PQ（几小时内）或是 R ?@Q下保存。
表 !# 本研究中使用的 $%&条件
’()*+ !# $%& ,-./010-. 23+/ 0. 1403 312/5
靶
<-2+’"
引物
32,F’27
345 条件 345 ().C,",).
循环次数
0EFS’2 );
(T(*’7
变性
/’.-"E2-",).
Q F,.
退火
1..’-*,.+
Q F,.
链延伸
B*).+-",).
Q F,.
参考文献
5’;’2’.(’7
细菌 G-("’2,- ［I］
第一轮 345
6,27" 345 2)E.C
3UH;，5>HVI2 H@ WJ > JH > V? ?
第二轮 345
8’().C 345 2)E.C
3HHI;A4，
3J>I2
H@ WJ > JH > V? ?
古菌 12(!-’- ［I］
第一轮 345
6,27" 345 2)E.C
351PU;，
351>>@@2
H@ W? > JJ > V? >
第二轮 345
8’().C 345 2)E.C
3154XHP@;A4，
3154XJ>W2
H@ W? > JJ > V? >
放线菌 1(",.)FT(’"’7
第一轮 345
6,27" 345 2)E.C
6?PH，5>HVI2 HJ WJ > UH > V? ? ［W；>@］
第二轮 345
8’().C 345 2)E.C
3HHI;A4，3J>I2 H@ WJ > JH > V? ? ［I］
真菌 6E.+, ［>>］
第一轮 345
6,27" 345 2)E.C
08>，
08? M >@
H@ WJ > JJ > V? >
第二轮 345
8’().C 345 2)E.C
08?U，
J>I2A4
H@ WJ > JJ > V? >
!& 6# /AAB及凝胶成像分析
/AAB采用 =ETY’2 等的方法［J］，使用的电泳设备是 G,)Z5-C / A’.’ 系统 （G,)Z5-C K-S)2-")2,’7，
X’2(E*’7，41，N81）。将第二轮 345产物上样到 I+ $ >@@F*聚丙烯酰胺凝胶上，U@Q、?@@ [下电泳 J!。聚丙
烯酰胺凝胶变性梯度范围为 HJO至 UJO，电泳缓冲液为 @& J L <1B（?@ FF)* $ K <2,7，>@ FF)* $ K 冰醋酸，@& J
FF)* $ K B/<1 #XV& P）。电泳结束后用 >\>@@@@ 8]G5 A)*C （G,) 32)S’ 32)CE("7，5)(^*-.C，=B，N81）染色
H@F,.，立即用凝胶成像系统（G,)Z5-C K-S)2-")2,’7，X’2(E*’7，41，N81）成像和拍照。
!& 7# /AAB图谱分析
/AAB图谱中 /01 条带由凝胶成像系统分析软件 9F-+,.+ -.C 1.-*T7,7 8);"%-2’ （_,.C)%7 $ =-(,.")7!，
G,)Z5-C K-S)2-")2,’7，X’2(E*’7，41，N81）识别和统计，/AAB 带谱聚类分析（(*E7"’2,.+ -.-*T7,7）也使用该软
件。主成分分析使用 8388>@& @。
H>@P‘ >@期 ‘ ‘ ‘ 钟文辉‘ 等：用 345Z/AAB研究长期施用无机肥对种稻红壤微生物群落多样性的影响 ‘
!""#：$ $ %%%& ’()*)+,(-& (.
!" 结果与分析
!& #" 细菌 /01 2345的 67893::;
采用嵌套式 678扩增技术对细菌 /01 2345进行扩增，获得预期大小的 345 片段。第一轮和第二轮扩
增分别得到 /<<=>#和 ?<@>#的 /01 2345片段（图 /），第二轮扩增产物的 3::; 图谱见图 ?，7A’、7A、4A、
46、6A、46A分别有
析显示，第一、二、三主成分的方差贡献率分别为 D@& ?< E、/=& D=E和 /0& =BE，前三主成分的方差贡献率达
F<& 0?E。三维因子载荷图（图 ?）显示，7A’分布在第 / 因子的正端，对该因子的得分最高，其它处理分布在
第 / 因子的负端。施 6的处理在三维因子载荷图中分布接近。
图 /G 土壤样品中细菌 /01 2345的 678扩增产物
H,+& /G I-("’2,-* /01 2345 678 -J#*,K,(-",). #2)LM("N )K N),* N-J#*’N
O：345 O-2P’2 （/BB># *-LL’2）；5 、I 分别为第一、二轮 678扩增产物G 5 -.L I -2’ K,2N" -.L N’().L 2)M.L 678 -J#*,K,(-",). #2)LM("N
图 ?G 土壤样品中细菌 /01 2345的 3::;图谱及其主成分分析结果
H,+& ?G 3::; #-""’2. -.L ,"N 675 -.-*QN,N 2’NM*" )K >-("’2,-* /01 2345 678 -J#*,K,(-",). #2)LM("N )K N),* N-J#*’N
$& !" 古菌 #%1 2345的 67893::;
古菌第一轮和第二轮扩增分别得到 /B@?>#和 ?<@># 的 /01 2345片段。第二轮扩增产物的 3::; 图谱
见图 D，7A’、7A、4A、46、6A、46A分别有 /@、/=、?B、/@、/= 和 /@ 条 345 带。聚类分析表明（图
理的差异最大，3::;带谱相似性只有 <
!""#：$ $ %%%& ’()*)+,(-& (.
图 /0 土壤样品 1223带谱的聚类分析结果
4,+& /0 5*67"’8,.+ -.-*97,7 8’76*"7 ): "!’ 1223 #-""’8.7 ): "!’ 7),* 7-;#*’7
<：细菌 =-("’8,-；=：古菌 <8(!-’-；5：放线菌 <(",.);9(’"’7；1：真菌 46.+,
图 >0 土壤样品中古菌 ?@A 81B<的 1223图谱及其主成分分析结果
4,+& >0 1223 #-""’8. -.C ,"7 D5< -.-*97,7 8’76*" ): -8(!-’-* ?@A 81B< D5E -;#*,:,(-",). #8)C6("7 ): 7),* 7-;#*’7
分别为 FG& HI J、?>& FHJ和 ?I& >>J，前三主成分的方差贡献率达 GF& HFJ。三维因子载荷图（图 >）显示，
5K’分布在第 ? 因子的负端，得分最低，其它处理分布在第 ? 因子的正端且得分接近。另一方面，BK分布在
第 I 因子的正端，其它分布在第 I 因子的负端。
!& !" 放线菌 ?@A 81B<的 D5EL1223
放线菌第一轮和第二轮扩增分别得到 ??FGM# 和 I/NM# 的 ?@A 81B<片段。第二轮扩增产物的 1223 图
谱见图 F，5K’、5K、BK、BD、DK、BDK分别有 I/、IF、I/、IF、II 条和 IF 条 1B< 带。聚类分析表明（图 /5），/
个施 D的处理（BD、BDK和 DK）的 1223带谱相似性最高，达到 NHJ；5K’与其它处理的差异最大，1223 带
谱相似性为 @/J。1223带谱主成分分析显示，第一、二、三主成分的方差贡献率分别为 >/& INJ、IF& NFJ和
F?O>0 ?O期 0 0 0 钟文辉0 等：用 D5EL1223研究长期施用无机肥对种稻红壤微生物群落多样性的影响 0
!""#：$ $ %%%& ’()*)+,(-& (.
/0& 0/1，前三主成分的方差贡献率达 23& 041。三维因子载荷图（图 5）显示，67’分布在第 / 因子的正端，得
分最高，其它处理分布在第 / 因子的负端且得分接近。
图 58 土壤样品中放线菌 /39 :;<=的 ;>>?图谱及其主成分分析结果
@,+& 58 ;>>? #-""’:. -.A ,"B C6= -.-*DB,B :’BE*" )F -(",.)GD(’"’B /39 :;<= C6H -G#*,F,(-",). #:)AE("B )F B),* B-G#*’B
!& "# 真菌 /29 : ;<=的 C6HI;>>?
真菌 /29 :;<=第一轮和第二轮扩增分别得到 530J# 和 4/0J# 的 /29 :;<= 片段。第二轮扩增产物的
;>>?图谱见图 3，67’、67、<7、
;>>?带谱相似性为 331。;>>?带谱主成分分析显示，第一、二、三主成分的方差贡献率分别为 LM& MK1、
KN& 3K1和 //& K41，前三主成分的方差贡献率达 2/& 001。三维因子载荷图（图 3）显示，67’分布在第 / 因
子的正端，得分最高，其它处理分布在第 / 因子的负端且得分接近。另一方面，4 个未施 C 的处理（67’、67
和 <7）分布在第 K 因子的负端，4 个施 C的处理（
@,+& 38 ;>>? #-""’:. -.A ,"B C6= -.-*DB,B )F FE.+-* /29 :;<= C6H -G#*,F,(-",). #:)AE("B )F B),* B-G#*’B
"# 讨论
"& $# C6HI;>>?方法与土壤微生物多样性
8 8 在 ;>>?图谱中，处于不同位置的每条 ;<=带及其相对浓度（亮度）很可能代表微生物群落中某一特定
3/NL 8 生8 态8 学8 报8 8 8 K0 卷8
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微生物种及其在群落中的相对丰度［/］。在 01234556 方法中，由于 012 模板为土壤总 478，其中既含可培
养微生物的 478，也含不可培养微生物的 478，反映的微生物种类要比可培养微生物种类多。另一方面，
01234556方法只能反映土壤中数量达到一定程度的那一部分微生物，若微生物数量过低，其 478 含量即
低，经 012扩增后的 99: ;478产量亦低，可能在 4556 图谱中不能被分辨出来。<=>?’; 等报道［/］，当某一
模板 478在总 478中的量小于 @A时，在 4556图谱中还能分辨出该 478带，因此推测 4556 法可反映微
生物群落中数量上大于 @A的优势种群。本研究中，4556 图谱中显示出分别有 BC D EF、@C D BF、BG D EC、@E
D @/ 条细菌、古菌、放线菌、真菌 99: ;478带，可能分别反映出与 478 条带数相当的各类微生物种群，该数
量均比以往资料报道的红壤中可分离培养的各类微生物种类多［@］。
在使用 01234556进行微生物多样性研究中，关键在于对样品中所有微生物群落 @G9 $ @H9 ;478基因进
行有效地扩增，所以在 012过程中选择合适的引物显得尤为重要。一方面，选择的引物必须能够对样品中的
绝大多数微生物种类进行有效扩增，这样就能保证研究结果的全面性；另一方面，选择的引物在设计上必须要
求所有在 012过程中扩增出的微生物的 @G9 ;478片断，在后续的 4556 分析中能够被完全分离，这样就有
利于对单个微生物类群的 @G9 $ @H9 ;478片断的回收和测序，从而对之进行分类单元上的定性。本研究所采
用的引物是目前国际上常用引物。在 012扩增技术上，也有不用嵌套技术的［/］，本研究发现采用嵌套技术扩
增效果比较好，以用 I-J"478& 90K7 L," M); 9),*试剂盒提取的 478为模板，直接用 0EEHIM5130/@H;扩增不仅
产量较低，而且容易出现“拖尾”现象。
@G9 ;478 4556指纹（M,.+’;#;,.",.+）技术目前已经广泛低用于监测细菌生长和分析细菌群落，然而，用
@H9 ;478 4556指纹技术对真菌群落的分析方法却没有很好地建立起来［@@］。对于不同的研究对象，可能需
要采用不同的引物。9N," 等用 6IO36IE $ M=.+-/（第一轮扩增）和 6IO379E51（第二轮扩增）成功地研究了小麦
根际真菌多样性［@B］。采用 6IO36IE $ M=.+-/ 成功地从所研究的红壤中扩增了 @H9 ;478，但用 6IO379E51 进
行第二轮扩增时，发现扩增产物中除目的 478带外，还有若干条非特异性 478带，不管如何优化 012条件，
这些非特异性带都不能消除。显然，用该引物体系并不适用于所研究的红壤。采用 79@379B P @F 以及 79BG3
/@H;51引物体系［@@］可成功地从所研究的红壤中扩增 @H9 ;478（图 G）。
理论上，只要选择的电泳条件如变性剂梯度、电泳时间、电压等足够精细，4556 技术对于 478片段的分
辨率可以达到一个碱基差异水平，这无疑对序列信息的系统发育分析都有一定的影响。但本研究表明，不同
的 4556实验条件很可能导致不同的带型谱图。待测样品的预处理过程是影响 4556 效能的关键步骤，这
一步骤也是实验误差的主要来源。很多因素都会影响样品 478 的提取过程，譬如，待测细胞是否充分裂解，
一些抑制 478降解的物质是否完全去除等。此外，在 012扩增过程中，如何避免优先扩增，使所有模板以均
等的几率被扩增，基因组的大小、引物的设计以及扩增程序的选择均对扩增后 478片段的质量和数量有很大
的影响。这些都将间接影响 4556 的分析结果。本研究表明，在 4556 电泳技术上，用 @EF Q、@@! 与用 BFF
Q、/!电泳的效果相当。
!& "# 荒地红壤改种水稻微生物多样性的变化和长期施用无机肥对土壤微生物多样性的影响
荒地红壤（1L’）的肥力水平很低，土壤有机碳含量极低（B& GO+ R+ S@），土壤微生物量碳和氮、可培养微生
物的数量、微生物群落功能多样性，均比改种水稻和施用 7、0、L肥料低!。但是，本研究结果表明，荒地红壤
改种水稻后，细菌、放线菌、古菌和真菌的 99: ;478的总数量未发生明显的变化，但带谱发生了明显的改变，
荒地红壤与种水稻、施肥处理土壤细菌、古菌、放线菌和真菌 99: ;478 4556带谱相似性分别为 /CA、EEA、
GEA、GGA，说明土壤微生物群落结构发生了显著的变化。根据 4556 带谱的聚类分析和主成分分析结果，
1L’与 1L及不同施肥处理（7L、70、0L和 70L）的差异比不同施肥处理之间的差异大，不管对所研究的哪个
类群的微生物，1L’的 4556带谱与其它处理的 4556带谱的差异都是最大的，表明荒地红壤改种水稻后土
C@FOT @F期 T T T 钟文辉T 等：用 01234556研究长期施用无机肥对种稻红壤微生物群落多样性的影响 T
! 待发表
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壤微生物群落结构变化程度比长期施用不同无机肥使土壤微生物群落结构发生变化的程度大。
在长期施用无机肥对土壤微生物多样性的影响上，根据 /001 图谱以及 /001 带谱的聚类分析和主成
分分析结果，不管对所研究的哪个类群的微生物，施 2处理 32、324和 24的 /001带谱相似性都是最高的，
四类微生物 /001带谱相似性高达到 567 8 9:7（图 ;），表明施用磷肥处理的土壤微生物群落结构最为接
近。而不施无机肥的对照 <4与施磷肥处理间细菌、古生菌、放线菌和真菌的 ==> ?/3@ /001带谱相似性分
别为 AB7、5C7、5A7、557（图 ;），提示 <4与施磷肥处理间土壤微生物群落结构的差异较大。34处理与施
用磷肥处理间微生物群落结构的差异也较大，细菌、古生菌、放线菌和真菌的 ==> ?/3@ /001 带谱相似性分
别为 AA7、DD7、5D7、557（图 ;）。可见，长期施用不同无机肥使种稻红壤微生物群落结构发生了一定的变
化，引起这些变化的原因还有待进一步研究。
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