全 文 ：第 25卷第 8期
2005年 8月
生 态 学 报
ACTAECOLOGICASINICA
Vol.25,No.8
Aug.,2005
焦化废水处理厂接触氧化池中降酚菌群的
苯酚羟化酶大亚基基因多样性
张学礼,熊顺子,刘彬彬,严 兴,周志华,王凌华,赵立平*
(上海交通大学生命科学技术学院,上海 200240)
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30240014)
收稿日期:2004-10-14;修订日期:2005-04-20
作者简介:张学礼(1981～),男,江苏靖江人,博士生,主要从事环境微生物分子生态学研究.E-mail:xlzhang@sjtu.edu.cn
* 通讯作者 Authorforcorrespondence.E-mail:lpzhao@sjtu.edu.cn
Foundationitem:NationalNaturalScienceFoundationofChina(No.30240014)
Receiveddate:2004-10-14;Accepteddate:2005-04-20
Biography:ZHANGXue-Li,Ph.D.candidate,mainlyengagedinmicrobialecology.E-mail:xlzhang@sjtu.edu.cn
摘要:研究了某焦化废水处理厂接触氧化池中降酚菌群的苯酚羟化酶大亚基基因(thelargestsubunitofthemulti-component
phenolhydroxylase,LmPH)的多样性。通过温度梯度凝胶电泳(temperaturegradientgelelectrophoresis,TGGE)对比分析了
氧化池 4个区段(O1-O4)中降酚菌群 LmPH的组成。它们的 TGGE图谱完全一样,相似性为 100%,表明该处理池中不同区
段的降酚菌群的功能基因组成是高度相似的。以O4段的菌群为代表建立LmPH基因克隆文库,从中挑选了 49个克隆测序。依
据 LmPH基因的 DNA序列所推测的氨基酸序列完全相同的归为一类的原则,49个克隆被分为 16种类型,其中优势 LmPH基
因主要有 5种类型(多于 4个克隆),而另外 11种类型都只有 1个克隆。与已知基因同源性超过 90%的有 7种类型,低于 80%
的有 2种类型。基于氨基酸序列的系统进化树分析表明,LmPH文库中绝大部分的类型都属于低亲和常数(low-Ks)的 LmPH,
占所有克隆的 92%。只有一个类型属于高亲和常数(high-Ks)的。因此,处理焦化废水的工业装置中不仅具有丰富多样的苯酚
羟化酶基因类型,而且以编码低亲和常数的占优势地位,而过去报道的通过富集培养分离得到的降酚菌则多带有高亲和常数的
酶。这提示我们传统的富集培养方法并不能筛选到生态环境中的真正优势功能菌。
关键词:苯酚羟化酶大亚基(LmPH)基因;TGGE;多样性;克隆文库;焦化废水
文章编号:1000-0933(2005)08-2025-06 中图分类号:Q938.1 文献标识码:A
Diversity analysisofthelargestsubunitofthemulti-componentphenol
hydroxylase(LmPH)genefromthephenoldegradingmicrobialcommunitiesof
anaerationtankofacokingwastewatertreatmentplant
ZHANGXue-Li,XIONGShun-Zi,LIUBin-Bin,YANXing,ZHOUZhi-Hua,WANGLing-Hua,ZHAO
Li-Ping* (CollegeofLifeScienceandBiotechnology,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200240,China).ActaEcologicaSinica,
2005,25(8):2025～2030.
Abstract:Thediversityofthelargestsubunitofthemulti-componentphenolhydroxylase(LmPH)geneinfourcompartments
oftheaerationtank(O1-O4)ofacokingwastewatertreatmentplantinShanghaiwasanalyzedviaPCR-TGGE(temperature
gradientgelelectrophoresis)analysis.TGGEfingerprintswereidenticalinalfourcompartments,suggestingthatthephenol-
degradingmicrobialpopulationsinthedifferentcompartmentsoftheaerationtankwerehighlysimilar.ALmPHgeneclone
libraryfromthefourthcompartment(O4)wasconstructedandthenucleotidesequencesof49randomlyselectedcloneswere
determined.The49cloneswereclassifiedinto16groups(aminoacidsequenceswith100% similarityweredefinedasone
group)basedonthededucedaminoacidsequences.FivepredominantLmPHgroupswereidentified,eachofwhichhadmore
thanfourclones.Eachoftheother11groupswererepresentedbyoneclone.SevenLmPH groupshadmorethan90%
similaritywiththeirnearestLmPHsintheGenBank,while2groupshadlessthan80%.
===================================================================
Phylogeneticanalysisofthepartial
aminoacidsequencesoftheLmPHsindicatedthatmostoftheclonesinthelibrary(92%)wereaffiliatedwithlow-Ks(affinity
constants)LmPH,whileonlyoneclone(L-SJ32)wasaffiliatedwithhigh-KsLmPH.TheseresultssuggestthatLmPHgenes
wereverydiverseinthecokingwastewaterandthatthelow-KsLmPHswerethepredominanttypeinvolvedinphenol
degradation.Sincemostofthepreviouslyisolatedphenol-degradingbacteriahadhigh-KsLmPHs,thisindicatesthattraditional
enrichmentculturemethodsmaynothaveidentifiedthekeyfunctionalbacteriafromthisenvironment.
Keywords:LmPH;TGGE;diversity;clonelibrary;cokingwastewater
焦化废水的排放量大,成分复杂,有毒有害难降解有机物含量高。若不处理直接排放,不但对环境造成很大的污染,还直接
威胁到人类的健康。焦化废水处理工艺已有长期研究,利用微生物的生物降解法是主要方法[1]。以前的研究绝大部分都集中在
处理工艺的改善上,如采用 A2/O(厌氧-缺氧-好氧)法代替原来的活性污泥法从而能更好地去除 COD和氨氮[1～3]。但对废水处
理中真正起作用的微生物的研究却比较少。只有少数工作用传统的分离培养方法对焦化废水处理系统中的微生物进行了研
究[4]。
越来越多的工作表明,能培养的微生物只占自然环境中的很少一部分,绝大部分微生物是用现有技术很难培养或不能培养
的[5]。为了克服这一困难,基于 16SrDNA基因的各种分子生物学方法,如克隆文库,探针杂交,温度梯度凝胶电泳等指纹图谱
分析技术,已被广泛用于微生物群落结构的研究[5]。但由于很多微生物生态系统,如处理焦化废水的微生物菌群,特别复杂,含
有很多微生物种群,因此基于 16SrDNA基因的分子生物学方法也有较大局限性。它们只能识别系统中的优势菌群,对于一些
比例比较低但可能有重要功能的菌群却忽略了[5]。为了解决这个问题,特异性地研究系统中起某种特定功能的功能菌群是很好
的一个办法[6]。
苯酚是焦化废水中主要的有毒有害物质之一[3],对焦化废水中苯酚最有效的处理方法是生物降解[7]。到目前为止,科学家
们已经分离出了很多降酚菌,包括 Pseudomonas[8～13],Ralstonia[9,12,14],Acinetobacter[15],Comamonas[12,16],Burkholderia[12],Var-
iovorax[9],并详细研究了它们的苯酚降解途径及其基因调控机制。苯酚生物降解的第一步是在苯酚羟化酶催化下,将苯酚转变
为儿茶酚。这是整个苯酚代谢途径的限速反应,决定了苯酚降解的动力学属性[17]。自然环境中有单组分和多组分两种苯酚羟化
酶,其中多组分苯酚羟化酶(mPH)是自然环境中的优势类型[9,13,18]。编码多组分苯酚羟化酶大亚基的 DNA片段(thelargest
subunitofmulti-componentphenolhydroxylase,LmPH)已被成功用作分子标记,来研究自然环境中的降酚菌的遗传和功能多
样性[13,19]。
上海某焦化厂(以下简称 SJ)废水处理工业装置系统采用 A2/O(厌氧-缺氧-好氧)接触氧化法对废水进行处理,其中苯酚好
氧降解主要发生在接触氧化池。本文研究,把接触氧化池平均分成 4段,先通过温度梯度凝胶电泳(TGGE)对比分析了不同区
段生物膜样品中降酚菌群的 LmPH的组成结构,然后对其中的一个区段(O4)菌群的 LmPH基因构建克隆文库,通过对克隆的
测序分析,详细地研究了其中 LmPH基因的多样性。
1 材料和方法
1.1 样品
样品采自 SJ废水处理工业装置系统(A2/O法)的缺氧池和氧化池中的生物膜。其中氧化池从进水口到出水口被等距离分
成 4段(O1,O2,O3,O4)。
1.2 基因组总 DNA提取
参考文献[20],提取各废水处理池生物膜样品中菌群的基因组总 DNA。将 50mg样品放置在 Eppendorf管中,加入 200µL
抽提缓冲液(100mmolTris,100mmolEDTA,200mmolNaCl,1% PVP,2% CTAB,pH8.0),用旋涡混合器击打 5min使
样品充分混匀。加入 200µLSDS缓冲液(100mmolTris,200mmolNaCl,2% SDS,pH8.0),轻微地上下颠倒几次,使细胞裂
解。将Eppendorf管放置在冰上 10min,然后在 4℃,13,000g高速离心 10min。上清液经酚、氯仿-异戊醇抽提纯化后,加入 2倍
体积的乙醇,沉淀干燥。用 30µLTE缓冲液溶解。
1.3 苯酚羟化酶大亚基(LmPH)基因扩增
使用 LmPH基因通用引物 Phe149GC和 Phe212[13]从生物膜样品基因组总 DNA中扩增 LmPH基因用于 TGGE分析。
PCR扩增体系和程序参考文献[13,21]。PCR扩增采用 Promega公司的 Taq聚合酶扩增体系。反应总体积为 50µL,其中 10×
Buffer5µL、MgCl23µL(25mmol)、dNTP4µL(25mmol)、引物各 1µL(12.5pmol/µL)、模板 DNA10ng、Taq酶 0.25µL
(5u/µL)。PCR反应程序为 94℃预变性 3min,30个循环的 94℃变性 1min、55℃退火 1min,72℃延伸 1min,最后 72℃ 6min。
扩增产物再经过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(denaturedpolyacrylamidegelelectrophoresis,d-PAGE)纯化以消除第一次
PCR过程中的单链 DNA和杂合双链 DNA污染[22]。
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1.4 LmPH基因的 TGGE分析
用 TGGE-Minisystem(Biometra)对 LmPH基因进行研究。TGGE胶的配方为 8%丙烯酰胺/双丙烯酰胺(37.5:1),8M
尿素和 20%甲酰胺。电泳采用 TAE缓冲液系统,电压 200V,电泳时间 3h。温度梯度为 40～60℃。
1.5 TGGE指纹图谱的相似性比较
使用 Dice相似性系数(Dicesimilaritycoefficient,Cs)[23]来比较 TGGE指纹图谱之间的相似性。Cs=2j/(a+b)×100,其中
a是第 1组 TGGE指纹图谱的条带数目,b是第 2组 TGGE指纹图谱的条带数目,j是在两个图谱中共有的条带的数目。
1.6 LmPH基因克隆文库分析
用不带 GC夹子的 LmPH基因通用引物[13]从 O4池生物膜样品基因组总 DNA中扩增 LmPH基因。扩增产物经 MOBIO
公司的 UltraCleanTM 15DNAPurification试剂盒纯化,连接到 pGEM-Teasy载体(Promega),转化入大肠杆菌 DH5α。转化子
涂布在含氨苄和 X-Gal/IPTG的 LB平板上。挑选白色克隆送至上海博雅公司测序。
1.7 LmPH基因序列分析
通过 BlastX分析从各克隆的 LmPH基因 DNA序列推测其氨基酸序列,用 ClustalX软件[24]对所有推测的氨基酸序列进
行 alignment分析,根据所推测氨基酸序列的异同,研究 LmPH基因的多样性。用 ClustalX软件[24]对所得的每种 LmPH基因
类型的氨基酸序列和 GenBank数据库中已有的与其最相近的代表性降酚菌的 LmPH基因氨基酸序列构建邻近树(neighbor-
joiningtree)[25],进行系统进化分析。Bootstrap分析进化树枝点处的统计学可信度。
1.8 核酸序列登录号(Accessionnumber)
本研究中发现的 LmPH基因核酸序列在 GenBank数据库中的登录号为 AY770085-AY770100。
2 结果
2.1 活性污泥基因组总 DNA提取与 LmPH基因扩增
按照实验室建立的方法,从 4个接触氧化池生物膜样品中均能很好地提取出基因组总DNA,片段均大于 20Kb(图 1)。从 4
个接触氧化池生物膜样品基因组总 DNA中均能很好地扩增出 LmPH基因,片段大小为 250bp左右(带 GC夹子)。
图 1 接触氧化池 4个区段生物膜样品基因组总 DNA
Fig.1 TotalgenomicDNAextractedfromthebiofilmsamplesof
fourcompartmentsoftheaerationtank
Lanes:1,λDNAMarker;2,O1;3,O2;4,O3;5,O4
图 2 接触氧化池 4个区段生物膜样品 LmPH基因的 TGGE指纹
图谱分析
Fig.2 TGGEanalysisoftheLmPH genesofthefourcompar-
tmentsoftheaerationtank
Lanes:1,O1;2,O2;3,O3;4,O4
2.2 LmPH基因 TGGE图谱分析
用 TGGE对扩增的接触氧化池 4个区段的 LmPH基因多样性进行分析(图 2)。4个样品的 TGGE图谱均含有 3条较强的
主带和 6条较弱的条带。用 Dice相似性系数分析 4个池的 LmPH基因 TGGE指纹图谱的相似性。四个氧化池区段样品的
LmPH的 TGGE图谱完全一样,相似性为 100%。
2.3 LmPH基因克隆文库分析
选取第 4个区段(O4),建立其 LmPH基因克隆文库,挑选了 49个克隆测序。对这些克隆的推测氨基酸序列进行 alignment
分析,如果按照氨基酸序列完全相同的归为一类,可以将它们分为 16类。其中优势的 LmPH基因类型主要有 5种,分别有 14,
7,7,6和 4个克隆。其它 11种类型均只有 1个克隆(表 1)。
用 Blastx软件对所有 LmPH基因类型在氨基酸序列水平进行了同源序列分析,找到了各自最相近的已知基因序列。用
ClustalX软件对各类型的氨基酸序列和 GenBank数据库中相应的最相近的代表性降酚菌的 LmPH基因氨基酸序列进行聚类
分析(图 3)。根据 LmPH基因氨基酸序列的系统进化树,LmPH基因主要有三大类(类型Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ)。其中类型Ⅰ和Ⅱ的
LmPH基因都属于低亲和常数的,而类型Ⅲ的 LmPH基因属于高亲和常数。
72028期 张学礼 等:焦化废水处理厂接触氧化池中降酚菌群的苯酚羟化酶大亚基基因多样性
表 1 O4池 LmPH基因克隆文库中各类型的代表序列分析
Table1 RepresentativesequenceanalysisoftheLmPHgeneclonelibraryoftheO4department
LmPH类型
Types
代表克隆
Clone
GenBank登录号
克隆数目
Numberofclone
最相似的 LmPH基因
Thebestsimilarclone
相似性 Similar
character(%)
1 L-SJ04 AY770085 14 Burkholderiacepacia(Tbc1Dmonooxygenase) 92
2 L-SJ21 AY770090 7 Burkholderiacepacia(Tbc1Dmonooxygenase) 88
3 L-SJ33 AY770093 7 Burkholderiacepacia(Tbc1Dmonooxygenase) 94
4 L-SJ11 AY770088 6 Burkholderiacepacia(Tbc1Dmonooxygenase) 88
5 L-SJ14 AY770089 4 Burkholderiacepacia(Tbc1Dmonooxygenase) 97
6 L-SJ07 AY770086 1 Burkholderiacepacia(Tbc1Dmonooxygenase) 91
7 L-SJ45 AY770095 1 Burkholderiacepacia(Tbc1Dmonooxygenase) 92
8 L-SJ48 AY770096 1 Burkholderiacepacia(Tbc1Dmonooxygenase) 89
9 L-SJ24 AY770091 1 Burkholderiacepacia(Tbc1Dmonooxygenase) 86
10 L-SJ38 AY770094 1 Burkholderiacepacia(Tbc1Dmonooxygenase) 86
11 L-SJ57 AY770098 1 Burkholderiacepacia(Tbc1Dmonooxygenase) 89
12 L-SJ51 AY770097 1 ComamonastestosteroniR5(phcN) 88
13 L-SJ32 AY770092 1 Pseudomonassp.strainCF600(dmpN) 100
14 L-SJ09 AY770087 1 Comamonassp.E6 78
15 L-SJ60 AY770099 1 PseudomonasputidaMT4 91
16 L-SJ62 AY770100 1 Pseudomonassp.LAB-16 78
得到的 16种 LmPH类型中,有 12个类型(45个克隆)归为低亲和常数的 LmPH,它们和数据库中最相近的代表性降酚菌
的序列相似性很高。其中 11个类型(44个克隆)和 Burkholderiacepacia的 Tbc1D单加氧酶亲源关系最近,相似性从 86%到
97%;另一个类型(L-SJ51)和 ComamonastestosteroniR5的phcN亲源关系最近,相似性为 88%。只有 1个克隆(L-SJ32)属于高
亲和常数的 LmPH,它和 Pseudomonassp.strainCF600的 dmpN等的相似性为 100%。另外 3个克隆 L-SJ09,L-SJ60,L-SJ62
和现有的 3种主要 LmPH类型亲缘关系都不是很近(图 3),其中的 2个克隆(L-SJ09,L-SJ62)和数据库中已有的最相近序列的
相似性低于 80%,可能是新的降酚基因类型。克隆文库中 92%的克隆序列都属于低亲和常数的 LmPH类型,这表明该类型是
SJ焦化废水降酚菌群中的优势降解类型。
3 讨论
Watanabe研究小组[9,12,13,19]最先用多组分苯酚羟化酶大亚基(LmPH)基因来研究降酚菌的多样性。他们发现降酚菌的苯
酚降解动力学属性主要有低亲和常数(high-Ks)和高亲和常数(high-Ks)两大类。根据 LmPH的氨基酸序列构建的进化树也把
它们分成与全细胞降解动力学特性相对应的两个主要类群。他们对处理原油精炼厂废水及生活污水的活性污泥的降酚动力学
研究表明,它们的苯酚降解动力学属性是低亲和常数,这表明低亲和常数的苯酚羟化酶基因有可能是废水处理系统中的优势降
酚基因[12,13,19]。
已经研究了太原某焦化厂(以下简称 TJ)废水处理系统的活性污泥中的苯酚羟化酶基因组成[21]。通过构建 LmPH基因克
隆文库,在已测序的 24个克隆中发现了 3种 LmPH基因,其中 2种基因(23个克隆)属于低亲和常数的苯酚羟化酶基因,在该
系统中占绝对优势(96%)[21],高亲和常数的只有 1个克隆。
SJ废水处理系统采用 A2/O法工业装置,有 1个厌氧池,1个缺氧池和 1个长的氧化池(等距离分为 O1,O2,O3,O4),其中
苯酚好氧降解主要发生在氧化池,因此选择氧化池的 4个区段来研究其中的 LmPH基因的多样性。TGGE指纹图谱对比分析
表明,各个区段的 LmPH基因组成完全一样,这说明它们中的主要降酚菌群是比较稳定的。氧化池的 4个区段是一个串联系
统,生态环境和处理工况一样,所以降酚菌群的功能基因类型一样是可以理解的。
对比分析 SJ和 TJ的 LmPH基因氨基酸序列[21],发现它们中的优势 LmPH基因亲源关系很近。L-SJ04和 L-ASb的氨基
酸序列一样;L-SJ33,L-SJ14和 L-ASb的氨基酸序列有 1个和 3个残基差异;L-SJ11,L-SJ21和 L-ASa的氨基酸序列有 1个和
2个残基差异。两个系统中的优势 LmPH基因都属于低亲和常数的 LmPH,且都和 Burkholderiacepacia的 Tbc1D单加氧酶亲
源关系最近。这也进一步说明了低亲和常数的 LmPH在焦化废水苯酚降解中的优势作用。研究中还发现 2个 LmPH类型和现
有类型的 LmPH亲缘关系都比较远,说明自然环境中还有很多 LmPH基因类型,它的多样性可能远比现在了解的要丰富。
另外,对比分析了SJ和TJ废水处理工业装置中LmPH的多样性。在TJ中只发现 3种LmPH基因类型,而在SJ中发现 16
种 LmPH基因类型,远比前者要丰富。这可能是由于两个焦化废水处理系统的处理工艺不一样所致。TJ采用的是传统的活性
污泥法,焦化废水直接流入瀑气池中,冲击负荷大,各种有毒有害物质对降酚菌群的毒性较大。很多降酚菌的生长代谢因此受到
抑制,所以降酚菌群的多样性就比较低。SJ采用的 A2/O法对焦化废水的处理分厌氧酸化,缺氧和好氧三步[2,3]。由于厌氧酸化
8202 生 态 学 报 25卷
可以把废水中部分大分子,难降解有毒有害物质转化为小分子及易被好氧微生物降解的有机物[3],这就降低了有毒有害物质的
浓度,对降酚菌群的毒性可能也就大大降低了。所以 SJ中降酚菌群的多样性就比较高。
图 3 LmPH基因氨基酸序列的系统进化树分析
Fig.3 Unrootedneighbor-joiningtreebasedonthepartialaminoacidsequencesofouridentifiedLmPHsinthispaperandprevious
identifiedrepresentativeLmPHsretrievedfromGenBank
进化树由本研究中所得到 LmPHs的氨基酸序列和 GenBank中的已经鉴定的有代表性的 LmPHs的氨基酸序列构建。大于 50的 Bootstrap
值标于进化树的分支处。图中的 bar代表 2%的序列差异 Numbersatthebranchnodesarebootstrapvalues(per100trials);onlyvalues
greaterthan50areindicated;Thebarrepresents0.02substitutionperaminoacidsite
以前对降酚菌的分离主要是以高浓度苯酚为唯一碳源通过批式富集培养得到的,因此绝大部分都是带高亲和常数的苯酚
羟化酶[8,10～13,19]。采用苯酚降解的特异性功能基因(LmPH)对两个焦化废水处理系统的降酚菌群的研究表明,低亲和常数的苯
酚羟化酶才是在工业焦化废水苯酚降解中起主要作用的。这提示人们用传统的富集培养方法去筛选生态环境中的功能菌并不
能得到系统中的真正优势功能菌。为了克服这一困难,一方面需要用基于功能基因的分子生物学方法对生态系统进行解析,从
而鉴定出系统中的真正优势功能菌。另一方面,需要在分子方法的监测和指导下,结合多种分离方法才有可能从环境中分离出
这些优势功能菌。
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