全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 042721207
土壤微生物多样性研究的 DGGEΠTGGE 技术进展
张洪霞1 　谭周进2 　张祺玲1 　盛　荣1 ,3 　肖和艾3
(1. 湖南农业大学生物安全科技学院 , 湖南 长沙　410128 ; 2. 湖南中医药大学基础医学院 , 湖南 长沙　410208 ;
3. 中国科学院亚热带农业生态研究所 , 湖南 长沙　410125)
摘 　要 :分子生物学技术比传统的培养方法可得到土壤微生物种群多样性更全面的信息。变性梯度凝胶
电泳 ( Denaturing gradient gel electrophoresis , DGGE) 和温度梯度凝胶电泳 ( Temperature gradient gel
electrophoresis , TGGE)可分离 PCR 扩增的 DNA 片段 ,已成为研究土壤微生物群落多样性的重要手段。
本文综述了 DGGEΠTGGE技术在土壤微生物多样性研究中的应用进展 ,分析了该方法的主要影响因素
及其优点和存在的问题。
关键词 :土壤微生物 ;多样性 ;DGGE ;TGGE
ADVANCES OF DGGEΠTGGE TECHNIQUE FOR SOIL MICROBIAL DIVERSITY STUDY
ZHANG Hong2xia1 ,3 　TAN Zhou2jin2 　ZHANG Qi2ling1 　SHENG Rong1 ,3 　XIAO He2ai3
(1. College of Biosafety Science and Technology , Hunan Agricultural University , Changsha , Hunan 　410128 ;
2. School of Preclinical Medicine , University of Hunan , Changsha , Hunan 　410208 ;
3. Institute of Subtropical Agriculture , Chinese Academy of Sciences , Changsha , Hunan 　410125)
Abstract :Molecular biological technology can be used to research and characterize soil microbes which currently can not be
cultured by traditional microbial research methods , and to get more and more complete information about soil microbial
community, to reveal soil microbial population structure and genetic diversity more accurately. Denaturing gradient gel
electrophoresis (DGGE) and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) techniques had been proven to be powerful tools
for analyzing microbial diversity , which can directly separating the PCR amplification clips. In this paper , the influence factors
and application aspects , as well as the potentials and the limitations of DGGEΠTGGE techniques for microbial diversity analysis
were reviewed.
Key words :microbial ; diversity ; DGGE ; TGGE
收稿日期 :2009201201 　接受日期 :2009204220
基金项目 :中国科学院知识创新工程项目 ( KZCX22YW2408) ,国家自然科学基金 (40771116) ,国家支撑计划项目课题 (2008BADA7B09)
作者简介 :张洪霞 (19852) ,女 ,山东费县人 ,硕士生 ,研究方向为微生物生态学。E2mail :zhxia128 @163. com
通讯作者 :肖和艾 (19622) ,男 ,湖南洞口县人 ,副研究员 ,研究方向为土壤微生物与养分循环。E2mail :haxiao @isa. ac. cn　　土壤微生物多样性是指其在遗传、种类、结构与生态功能方面的变化 ,指示土壤微生物群落的稳定性 ,在保持土壤质量和生态系统稳定性等方面具重要意义。传统土壤微生物培养方法只能分离土壤中极少数微生物 ,很难全面反映土壤微生物的多样性。近年来随着分子生物学技术的发展 ,建立了以 DNA 指纹图谱分析为基础的现代微生物分子生态学研究方法 ,包括限制性片段长度多态性分析 ( Restriction fragment length polymorphism, RFLP) 、随机扩增 DNA 多态性分析(Random amplified polymorphic DNA , RAPD) 、单链构象多态性分析 ( Single strain conformation polymorphism ,SSCP) 、荧 光 原 位 杂 交 技 术 ( FISH ) 、基 因 芯 片(Microarry) 、磷脂脂肪酸图谱分析 ( PLFA) 、稳定同位素探针 (SIP) 、PCR2DGGEΠTGGE (DGGE ,TGGE)等 ,为全面揭示土壤微生物种群结构和遗传多样性提供了重要手段。
127　核 农 学 报　2009 ,23 (4) :721～727Journal of Nuclear Agricultural Sciences
DGGE是由 Fischer 等[1 ] 于 1979 年首先提出的用
于检测 DNA 突变的一种电泳技术 ,其分辨力高于琼脂
糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,是最常用的单碱基突
变筛查检测方法之一。1993 年 ,Muzyer 等[2 ] 将 DGGE
技术应用于分子微生物学研究领域 ,在揭示自然界微
生物群落遗传多样性和种群差异方面具有明显优越
性。TGGE是在 DGGE 基础上衍生出的温度梯度凝胶
电泳技术[3 ] 。近十多年来 ,DGGEΠTGGE 技术已成为研
究土壤微生物多样性的重要手段。本文介绍了 DGGEΠ
TGGE技术在土壤微生物生态学研究方面的应用 ,该
技术的主要影响因素以及其优点和存在的问题。
1 　DGGEΠTGGE 在土壤微生物多样性研究中的
应用
　　自Muyzer 等[2 ]首次将 DGGE技术应用于微生物分
子生物学研究以来 ,该技术迅速被广泛用于土壤[4 ] 、活
性污泥[5 ] 、海洋[6 ] 、底泥[7 ] 等样品中微生物多样性分
析、微生物鉴定和变异以及种群演替等方面研究。
111 　DGGEΠTGGE与 PCR 结合
DGGEΠTGGE技术是对 PCR 扩增微生物 rDNA 产
生的 DNA 片段混合物的分析。PCR2DGGEΠTGGE 技术
的优点是可靠、重现性好、方便快捷 ,适合于大量样品
快速分析。可用于不同微生物群落之间的差异分析 ,
也可进行同一种微生物群落随时间和环境变化演替规
律的研究[6 ] ,是微生物群落遗传多样性和动态分析的
有力工具。
Cheung等[8 ]采用特异性引物 PCR 扩增分支杆菌
属的 16S rRNA 基因 ,利用 TGGE 分离扩增产物 ,表明
被石油严重污染的土壤中分支杆菌的多样性较轻度污
染土壤中少。Hernan 等[9 ] 采用 PCR 扩增了 74 株酿酒
酵母菌的 18S rRNA ,通过 TGGE技术分析其扩增产物 ,
发现部分酵母菌存在着种内差异。Zhou 等[10 ]采用 16S
rRNA 基因的 PCR2DGGE 技术研究了放牧强度对内蒙
古草原土壤中甲烷氧化细菌群落和活性的影响 ,表明
不同放牧强度下土壤中甲烷氧化细菌群落有较大差
异。Martínez2Alonso 等[11 ] 利用 PCR2DGGE 等方法揭示
了湖水在流动和静态下垂直分布的主要微生态特征 ,
并发现随深度和时间的改变 ,细菌种群也发生变化。
112 　巢式 PCR2DGGEΠTGGE技术
巢式 PCR(Nested PCR)也称嵌套 PCR ,是指利用两
套 PCR 引物进行两轮 PCR 扩增反应 ,以第一轮扩增的
DNA 序列内部的一对引物进行第二轮扩增。巢式
PCR 的两次 PCR 扩增降低了扩增多个靶位点的可能
性 ,因为与两套引物均互补的序列很少 ,从而增加了检
测的敏感性和可靠性 ,有利于对微生物特异种属的研
究。
Ghosh 等[12 ]采用巢式 PCR2DGGE 技术分析了膜偶
联生物反应器 (MBRs) 中氨氧化细菌 (AOB) 群落的多
样性 ,检测到 2 个亚硝酸单胞菌种群和 1 个亚硝酸螺
菌属种群 ,并证明利用 MBRs 可高效去除污水中含氮
和碳的污染物。Maukonen 等[13 ] 对造纸厂污水中脱硫
弧菌相关联的硫酸盐还原菌 ( sulfate2reducing bacteria ,
SRB) 研究时发现 ,巢式 PCR2DGGE 法更适合于对 SRB
种群的分析 ,可通过 SRB 快速检测出废水污染点。
Shabir 等[14 ]在用巢式 PCR2DGGE法分析生物反应器中
的 SRB 时 ,检测出无杂带干扰的含量在 0101 %的
SRB。孙晓棠等[15 ]用巢式 PCR2DGGE 法研究番茄不同
生育期根际微生物种群的动态变化 ,表明不同生育期
番茄根际均具有较高的细菌多样性 ,其细菌种类和数
量在初花期变化较为显著 ,初果期根际群落多样性指
数 (H)和物种丰度 (S)值都达到最高 ,是筛选拮抗菌的
较好时期。李友发等[16 ] 利用嵌套 PCR2DGGE 法分析
了福建省 6 个地区稻田土壤的细菌群落结构 ,表明不
同地区稻田土壤的细菌群落结构存在较大差异 ,大体
分为闽东、闽南、闽北、闽西 4 大类 ,且同一地区的根际
土和表土样品之间也存在差异。
113 　D GGEΠTGGE与标记技术结合
DGGEΠTGGE与标记技术的结合分析 ,是在对 PCR
扩增产物进行梯度凝胶电泳后 ,以 DGGEΠTGGE 图谱
上的条带为原始模板 ,制备带有标记的核苷酸探针 ,与
已知纯培养物的相应基因扩增产物进行杂交 ,分析确
定 DGGEΠTGGE图谱上特定条带的微生物种类。Heuer
等[17 ]以转基因马铃薯根际土壤样品的 TGGE图谱上回
收的条带为原始模板 ,制备出带有地高辛 (Digoxigenin)
标记的 16S rDNA V62V8 ( F984GC2R1057) 可变区核苷
酸探针 ,然后分别与等量的来自克隆和细菌纯培养物
的 16S rDNA 进行杂交 ,来鉴定群落指纹图中与分离到
的菌株相对应的条带。Samantha 等[18 ]采用稳定同位素
探针 (SIP)2PCR2DGGE 技术研究了土壤中甲烷细菌群
落生态多样性 ,以及有机污染土壤中微生物群落功能
和遗传结构的演变过程。如果要分析情况复杂的土壤
样品 ,则以 DGGEΠTGGE 图谱条带进行标记来制备核
苷酸探针 ,然后与已知菌的扩增 DNA 片段杂交 ,这样
可更准确地分析微生物种类 ,特别是对不可培养微生
物的分析鉴定有着重要的意义。
114 　D GGEΠTGGE与克隆技术结合
PCR2DGGEΠTGGE与 16S rDNA 克隆技术结合包括
227 核　农　学　报 23 卷
2 种方法 :1 种是首先对待测样品 16S rDNA 基因进行
PCR2DGGEΠTGGE凝胶电泳分析 ,再将目标条带剪下回
收、克隆建库和测序 ,对土壤中重要的或受外界影响显
著的微生物种群进行鉴定和多样性分析 ;另 1 种是先
以 PCR 产物建立克隆文库 ,将各克隆用引物扩增后 ,
与环境样品扩增产物一起进行 DGGEΠTGGE 电泳 ,各
克隆条带与样品中所有条带一一对应 ,在对环境样品
高可变区DGGE分析得到群落特征的同时 ,从克隆 16S
rDNA 长片段可获得更多的序列信息 ,克服了 PCR2
DGGE检测片段携带信息量有限的缺点 ,还可对多克
隆集合 DGGE分析 ,反映生态系统中的优势群落。
Kowalchuk 等[19 ] 用巢式 PCR 扩增得到 5′端带有
GC夹的 569bp 的 18S rDNA 片段 ,对此片段进行变性
梯度凝胶电泳分析后 ,再进行克隆建库、测序和系统分
类分析 ,鉴定出侵染滨草 ( Ammophila arenaria) 的土壤
真菌主要属于担子菌门和子囊菌门。Wang 等[20 ] 采用
PCR 扩增 16S rDNA 的高可变区并对其产物进行 DGGE
电泳 ,对特定图谱条带片段用载体 p GEM2T 转入 E.
coli DH5a 中克隆 ,并进行序列分析 ,从而分析出石油
库中细菌群落的系统发育性及优势种群。王岳坤
等[21 ]应用变性梯度凝胶电泳 (DGGE) 和分子克隆技术
相结合分析了土壤微生物的 16S rDNA V3 片段的多态
性 ,发现地域因素和红树品种影响土壤细菌群落结构。
115 　双梯度2变性梯度凝胶电泳( DG2DGGE)的应用
DG2DGGE 是在原有单一化学变性剂梯度的基础
上引入凝胶浓度梯度 ,变性剂和聚丙烯酰胺的浓度均
从上至下递增 ,形成变性剂与凝胶分子筛双重电泳阻
力 ,以提高 DGGE的灵敏度。
邢德峰等[22 ]以 PCR 扩增 16S rRNA 基因 V22V3 区
域 ,用双梯度2变性梯度凝胶电泳 (DG2DGGE) 技术分离
和鉴定 PCR 扩增产物 ,获得了连续流生物制氢反应器
活性污泥中微生物群落多样性信息。陈桐生等[23 ] 以
细菌 16S rDNA 中 V3 可变区的特异性引物扩增目的片
段 ,应用 DG2DGGE 技术分析表明 ,除臭生物滤池中不
同层次的空间分布多样性存在明显差异 ,且培养前后
及不同培养基富集培养的微生物种群多样性和特异性
有很大差别。James 等[24 ] 采用 PCR 扩增细菌的 16S
rRNA 基因后结合 DG2DGGE技术分析了不同深度海洋
沉积物细菌的多样性 ,结果表明深度对海洋沉淀物中
细菌群落多样性影响不显著。
2 　DGGE分析的主要影响因子
根据变性剂梯度和电泳方向 , DGGE 分为垂直
DGGE和水平 DGGE。目前用于环境微生物样品分析
的通常是水平 DGGE ,其变性剂浓度梯度范围比较窄 ,
主要用于解链温度范围明确的 DNA 片段的检测。影
响 DGGE技术的因素包括土壤样品 DNA 提取、纯化、
PCR 扩增 ,变性剂浓度梯度范围、温度以及电泳时间
等。
211 　土壤微生物总 DNA 提取
土壤微生物总 DNA 提取的质量是 DGGEΠTGGE 技
术的关键 ,也是试验误差的主要来源。土壤中腐殖酸
是提取土壤微生物总 DNA 的主要污染物 ,它可螯合
Mg2 + 或与 DNA、蛋白质发生共价结合 ,从而抑制酶的
活性、影响限制性内切酶的酶切作用和 PCR 扩增等过
程。另外待测细胞是否充分裂解、一些抑制 DNA 降解
的物质是否完全去除等[25 ] ,也是影响DNA 提取质量的
因素。从土壤中提取微生物 DNA 的方法主要包括 2
种 :1 种是对土壤样品进行反复悬浮和离心后 ,提取土
壤微生物细胞 ,再采用酶裂解细胞提取微生物总
DNA。另 1 种是用机械破碎、化学、酶解 3 种手段相结
合直接裂解土壤微生物细胞 ,使其释放 DNA。
21111 　细胞裂解 　直接裂解土壤微生物细胞的方法
包括 :机械破碎法、化学法、酶解法以及 3 种手段相结
合的方法。机械破碎法常用的有冻融法、超声波法和
玻璃微珠震荡法。化学法常用的是十二烷基磺酸钠
(SDS)处理 ;溶菌酶可处理革兰氏阳性菌细胞壁 ,还可
水解糖苷键和腐殖酸。2 种或多种方法相结合对 DNA
的提取效果较好。王啸波等[26 ] 采用研磨 + 冰融 + SDS
法提取土壤微生物 DNA ,纯化后用于构建以 pUC18 为
载体的 DNA 文库。熊开容等[27 ] 采用冻融 + 玻璃珠 +
溶菌酶 + SDS 方法提取了活性污泥中微生物 DNA ,结
果表明获得的 DNA 适合于酶解和 PCR 扩增要求。
土壤中微生物种类繁多 ,生理状态不同 ,革兰氏阳
性和阴性细菌的细胞壁结构和组成亦不相同。可根据
试验的性质选择裂解方法 ,但为了使提取的 DNA 具有
代表性 ,必须保证土壤样品中所有微生物细胞裂解释
放出核酸。已有研究证明 ,玻璃微珠振荡法能彻底破
坏样品结构 ,得以最大限度的触及整个微生物群落 ,是
一种有效的细胞裂解方法[28 ,29 ] 。李鹏等[30 ] 研究表明
基于 SDS 的裂解法是用于活性污泥微生物多样性
PCR2DGGE 研究的一种简便、可靠的总 DNA 提取方
法。
21112 　DNA 纯化　提取的土壤微生物总 DNA 通常采
用饱和酚或氯仿和蛋白酶处理 ,去除 DNA 样品中的蛋
白质和部分 RNA ,然后对 DNA 进行抽提 ,再用乙醇、异
丙醇或聚乙二醇 ( PEG) 沉淀后 ,经羟基磷灰石柱或氯
327　4 期 土壤微生物多样性研究的 DGGEΠTGGE技术进展
化铯密度梯度超速离心进一步纯化。其他纯化方法有
聚乙烯吡咯烷酮 (PVPP) 法、色谱法、电泳法、透析和过
滤法、试剂盒法等[31 ] 。
Zhou 等[32 ]研究表明采用聚乙烯吡咯烷酮和十六
烷基三甲基溴化铵 (CTAB) 可以有效去除提取的 DNA
中腐殖酸杂质。Jacobsen[33 ] 研究表明采用选择性磁性
捕获钳杂交 (Magnetic capture hybridization , MCH) 法也
可以去除DNA 中腐殖酸 ,避免其对 PCR 扩增时的抑制
作用。李钧敏等[34 ] 研究表明用含聚乙烯吡咯烷酮的
缓冲液预洗 DNA 样品 ,然后添加 CaCl2 和牛血清白蛋
白 (BSA)可去除其中的腐殖酸 ,用 PEG8000 沉淀 DNA ,
可提高 DNA 质量 ,并证实这是一种简便有效可直接应
用于 PCR 分析的土壤微生物总 DNA 的提取方法。吴
红萍等[35 ]采用酚氯仿和柱式腐殖酸去除剂对粗提取
的土壤微生物 DNA 进行纯化后 ,可用于 PCR 扩增 ,以
细菌 16S rDNA 基因引物可扩增到相应的片段。朱立
成等[36 ] 采用直接法提取土壤微生物总 DNA ,然后用
Sephadex G2200 凝胶离心层析法纯化 ,可得到纯度较高
的 DNA。段学军等[37 ] 采用稀释模板及巢式2PCR 法解
决在 DNA 提取纯化过程中不能完全去除腐殖质的问
题 ,将所得土壤样品总 DNA 以 BSFΠBSR 为引物扩增出
16S rDNA 全长后 ,再以其为模版以 338FΠ518R 为引物
进行 2 次 PCR 扩增 ,直接扩增得到扩增产物。此外 ,
BIO101 Systems 公司研制了一种多试管 FastPrep 核酸
提取系统 ,该系统使用方便、高效快速。滕应等[38 ] 将
该系统与相应的 FastDNA SPIN Kit for Soil 试剂盒联用 ,
有效地提取了重金属复合污染的农田土壤微生物总
DNA。
21113 　DNA 的纯度和浓度测定　通常采用紫外分光
光度法测定纯化后 DNA 溶液的 OD260 和 OD280 值 ,以
OD260ΠOD280的比值指示 DNA 的纯度 ,较纯 DNA 溶液的
OD260ΠOD280值为 118～212 ,而受蛋白质或其他杂质污
染时 ,OD260ΠOD280值则较低。此外 ,还可采用 PCR 扩增
检测 DNA 的纯化质量 ,所用扩增引物见文献 [ 39 ]。提
取的 DNA 浓度通常根据测定的 OD260值计算 ,DNA 浓
度 (μgΠml) = 50 ×OD260 ×稀释倍数 ,即可得到每克干土
总 DNA 的提取量。还有采用 DyNA Quant 200 荧光仪
(Pharmacia)对纯化后 DNA 的浓度进行测定[26 ] 。
212 　PCR扩增
影响 PCR 扩增效率的主要因素包括引物、Mg2 + 、
dNTP和 Taq 酶等。引物浓度会影响 PCR 扩增的特异
性 ,引物浓度高时易出现非特异性扩增产物 ,因此引物
的设计要以提高特异性扩增效率为原则。Taq 酶的用
量范围通常为 110～215 单位 ,浓度过高会导致非特异
性扩增产物的增加。Mg2 + 浓度增加可提高 Taq 酶活
性 ,同时也会增加非特异性产物的扩增 ,故其浓度要控
制在适宜的范围内 ,一般为 110～210mmolΠL。通常
dNTP浓度以 5～200μmolΠL 为宜[40 ] ,实际操作中可根
据模板和引物探索最适扩增反应条件。邢德峰等[41 ]
研究表明不同引物下利用 PCR2DGGE技术分析活性污
泥中微生物多样性时 ,所得 DGGE 指纹图谱带存在明
显 差 异。 李 少 英 等[42 ] 以 Af : 5′2
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG23′ 与 Ir : 5′2
CCGTCAATTCCTTTGAGTTT23′为第一次 PCR 引物 ,以
Cf : 5′2CCTACGGGAGGCAGCAG23′ 与 Dr : 5′2
ATTACCGCGGCTGCTGG23′为巢式 PCR 引物 , 第一次
PCR 扩增完成后 ,再进行巢式 PCR ,在一定浓度的
DGGE电泳中得到清晰的双歧杆菌电泳带。
DGGE 技术几乎能检测出所有的突变 ,但利用
PCR 扩增复杂样品的靶基因时 ,由于 DNA 聚合酶识别
的错误和 DNA 点突变等原因 ,可能会产生一些人工序
列 (Artifactual sequence) ,如嵌合体 ( Chimeras) 、异源双
链 (Heteroduplexes) 等 ,这些人工序列在 DGGE 凝胶板
上的出现 ,会造成对样品中微生物种类过高的估计。
嵌合体可以通过重复 PCR 或对谱带序列测定来排除 ,
而异源双链产生的概率比嵌合体低一些[43 ] 。此外 ,在
PCR反应有效进行的前提下 ,退火要尽可能在较高温
度下进行 ,以减少或避免引物错配。
213 　“GC夹板”( GC2clamp)技术
所谓“GC 夹板”是将一段长度为 30～50bp 富含
G、C的 DNA 序列连接到双链的一端 ,形成一个人工高
温解链区 ,使 DNA 片段的原有部分处在低温解链区实
现更好的分离。在 DNA 分子中 ,G、C碱基对比 A、T碱
基对结合牢固 ,G、C 含量高的区域具有较高的解链温
度 ,为区别序列差异发生在最高解链温度区域的 DNA
片段 ,可使用“GC 夹板”。通常 DGGEΠTGGE 电泳技术
对于长度超过 500bp 的 DNA 片段的序列检出率只有
50 %[25 ] ,而利用“GC 夹板”技术可使其检出率提高到
100 %。罗海峰等[44 ]比较了不同引物扩增的 16S rDNA
片段在 DGGE中的电泳情况 ,结果表明含“GC 夹板”结
构的 PCR 扩增产物在 DGGE 中能够很好地分离 ,而无
“GC夹板”结构的则分离效果较差。
214 　D GGE相关技术参数
21411 　变性剂梯度的选择 　为了使仅一个碱基之差
的 DNA 片段获得最佳分离效果 ,先通过垂直变性梯度
电泳了解 DNA 分子的解链性质 ,确定变性剂浓度梯
度[43 ] 。在垂直变性梯度电泳中 ,电泳方向与变性剂梯
427 核　农　学　报 23 卷
度线性增加方向垂直 ,加样孔是一个占胶板整个宽度
的单一大孔 (与梯度方向平行) 。电泳后经染色在凝胶
板上会呈现出一条清晰的“S”型曲线 ,在曲线中出现的
陡峭跃迁的位置显示有关 DNA 片段解链区域的数目
及相对变性剂浓度 (Tm)值 ,选择水平凝胶的条件包括
Tm约 10 ℃的范围区内 ,10 ℃相当于 30 %范围的变性
剂。据此可设计具有多个样品孔的平行变性梯度凝
胶 ,在最佳条件下进行靶片段的分析。李少英等[42 ] 研
究发现不同浓度的变性剂得到的电泳图谱有很大差
异 ,选择的变性剂最适浓度为 25 %～80 %。
21412 　电泳时间和温度的确定　DGGE系统要求电泳
温度低于待测解链区域 Tm 值。50 ℃～65 ℃对大多数
天然 DNA 片段是较适合的 ,但最佳解链温度需采用平
行凝胶电泳确定[25 ] ,变性剂梯度由胶板的顶端向底端
线性增加 ,电泳方向平行于变性剂梯度变化方向。平
行 DGGE技术适用于多个样品的比较分析。样品分析
前将待测样品以一定时间间隔在同一块胶版上加样、
跑胶 ,DNA 片段获得最大分辨率的时间即为最佳电泳
时间。低电压的电泳时间要长 ,高电压则相反。DNA
片段为 200bp 左右 ,通常电压为 150V 时 ,电泳 4h 可达
到良好的分离效果。宋业颖等[45 ] 发现双梯度2变性梯
度凝胶电泳 (DG2DGGE)技术电泳 5h 时分离条带最多 ,
差异条带也最多 ,是获得最大分辨率的电泳时间。以
寡核苷酸溶解性的研究及解链理论为基础 ,应用计算
机程序模拟与已知序列 DNA 解链温度有关的解链行
为、最佳凝胶电泳时间及碱基改变对解链图像产生的
预期影响 ,可为分析目标 DNA 片段节省大量时间。
215 　染色
DNA 电泳后需要进行染色才能呈现出带型和指
纹图谱 ,染色法包括溴化乙锭 ( Ethidium bromide , EB) 、
SYBR Green I、SYBR Gold 染色法和银染法。EB 染色使
用聚丙烯酰胺胶 ,其灵敏度低 ,容易低估样品中微生物
的种类。SYBR Green I和 SYBR Gold 染色法灵敏度高 ,
但 SYBR 染料价格较高。EB 和 SYBR 染料的特点是只
有双链 DNA 着色 ,单链 DNA 几乎不显色。银染法是
通过银离子 (Ag+ ) 与核酸形成稳定的复合物 ,再使用
还原剂 (如甲醛) 使 Ag + 还原成银颗粒 ,从而使核酸电
泳带变成黑褐色 ,其灵敏度高 ,比 EB 的灵敏度高 200
倍 ,但不适合回收 DNA ,不能进行后续的杂交分析。
216 　共迁移
当 DGGE试验条件选择不当时 ,不同序列 DNA 片
段可能发生共迁移的现象[46 ] ,即同一条带中含有不同
种类的细菌 DNA ,从而导致样品中实际微生物种类被
低估。降低共迁移发生的措施一是选用不同引物扩增
目的基因 ,比较 DGGE谱带的差异 ,另一方法是对相应
的 DGGE 条带割胶后用不带 GC 序列的引物进行扩
增 ,对其 PCR 产物序列测定后进行验证[43 ] 。
3 　DGGEΠTGGE技术的优点与局限性
DGGEΠTGGE技术可直接对提取的土壤样品总
DNA 进行微生物多样性分析 ,其优点是 :若 PCR 产物
突变发生在最先解链的 DNA 区域 ,DGGE 检出率可达
100 % ,检测片段最长可达 1kb ,但最适范围为 100bp～
500bp ;DGGE分辨率可达到 1 个碱基 ;DGGE 具有精密
控温系统 ,比一般聚丙烯酰胺凝胶电泳的重复性更好 ;
几乎可检出所有突变 ,无须对引物标记 ;可将突变分子
完好无损地同野生型分子分开以用于进一步的分析。
DGGEΠTGGE 技术也存在一定局限性。Muyzer
等[7 ]指出 DGGE法只能对微生物群落中数量大于 1 %
的优势种群进行分析 ,还不能完整地反映复杂环境中
微生物的群落。DGGEΠTGGE 检测的 DNA 片段长度范
围以 200bp～900bp 为好 ,超出此范围的片段难以检
测[47 ] ;PCR 扩增所需 GΠC 碱基对含量至少达 40 % ;
TGGE仪器所允许的温度范围为 15 ℃～80 ℃,较大片
段 DNA 的 Tm 值因为接近 80 ℃而使检测难度提高 ;若
电泳条件不适宜 ,不能完全保证将有序列差异的 DNA
片段分开 ,从而出现序列不同的 DNA 迁移在同一位置
的现象。此外 ,在 DGGEΠTGGE 检测的基础上往往需
结合杂交技术或核酸测序分析才能得到更详尽的信
息。
4 　展望
DGGEΠTGGE技术的建立提高了土壤微生物多样
性的真实性 ,成为快速分析微生物群落的有力工具。
DGGEΠTGGE技术与杂交技术或核酸测序分析相结合 ,
可以更深入地揭示土壤微生物群落的多样性。土壤微
生物多样性是评价土壤环境变化的重要指导 ,较全面
地研究土壤微生物多样性及其功能 ,对于阐明土壤中
各种微生物在土壤生态系统中的作用具有重要意义。
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“2009 稳定同位素技术、方法及设备应用交流研讨会”通知
稳定同位素技术是现代科学研究中一门新兴技术 ,在诸多领域中都展现了广阔的应用前景。为了加强我国
稳定同位素生态工作者之间的交流 ,及时了解国际最新研究前沿 ,推广稳定同位素技术在我国各领域研究的应
用 ,中国高科技产业化研究会将与《核农学报》联合于 2009 年 11 月 20 - 26 日在海口举办“2009 稳定同位素技术、
方法及设备应用交流研讨会”。
会议将邀请中国科学院、中国农业科学院及中国计量科学院相关领域的多位专家针对稳定同位素的最新研
究及应用进行学术交流 ,交流内容包括 :
1、稳定同位素技术在生态学、环境保护、地球化学、农业、林业、医学、食品安全等系统的应用研究 ;
2、稳定同位素技术科学前沿理论及研究热点 ;
3、同位素技术实践应用中的主要关键技术和注意事项 ;
4、稳定同位素分析技术、标准物质、分馏理论及应用 ;
5、碳、氢、氧和氮稳定同位素技术在全球变化生态学、土壤生态学、树木年轮学等方面的研究 ;
6、交流同位素采样方式 ,样品储存、样品处理实用技术 ;
7、同位素数据的分析及模型模拟 ;
8、同位素设备产品展示及维修应用。
会议注册费用为每人 980 元 ,学生 500 元 ,食宿、考察统一安排 ,费用自理。
会议将编辑会刊《2009 稳定同位素技术、方法及设备应用交流研讨会论文集》,《核农学报》将于 4 个月内发
表其中的优秀论文。欢迎从事同位素研究的专家、学者及科研人员踊跃投稿 ! 投稿细则如下 :文件格式为 word
文档 ,篇幅 6000 字左右 ,内容应包括论文题目、作者姓名、工作单位、地址、电话、论文摘要、英文摘要、正文及主要
参考文献等 ,具体格式参照《核农学报》稿件格式。投稿请在 2009 年 11 月 10 日前发至会务组邮箱或《核农学报》
编辑部。
会务组联系方式 :
联系电话 : (010) 81616258 86312187 (兼传真)
联 系 人 : 李 　洋 　手机 :13641049897
邮 　　箱 :zhongkeyuan80 @126. com ;hnxb5109 @263. net (裴颖)
727Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2009 ,23 (4) :721～727