全 文 ：第 25卷第 6期
2005年 6月
生 态 学 报
ACTAECOLOGICASINICA
Vol.25,No.6
Jun.,2005
外源一氧化氮提高一年生黑麦草抗冷性机制
马向丽1,魏小红2*,龙瑞军1,3,崔文娟2,万引琳2
(1.甘肃农业大学草业学院,兰州 730070;2.甘肃农业大学生命科学学院,兰州 730070;3.中国科学院西北高原生物研究所,西宁 810008)
基金项目:甘肃省教育厅基金资助项目(032B-01);教育部高校优秀青年教师教学科研奖励基金资助项目;中国科学院"百人计划"资助项目
收稿日期:2004-07-13;修订日期:2004-12-26
作者简介:马向丽(1980～),女,湖北襄樊人,硕士生,主要从事草业生态生理研究。E-mail:xfmaxiangli@126.com
*通讯作者 Authorforcorrespondence.E-mail:weixiaohong2005@sina.com
Foundationitem:NaturalScienceFoundationofEducationDepartmentofGansuProvince(No.032B-01),andtheTeachingandResearchAward
ProgramforOutstandingYoungTeacherinHigherEducationInstitutionsofMOE,P.R.C.;the"100TalentsProgram"ofChineseAcademyof
Science
Receiveddate:2004-07-13;Accepteddate:2004-12-26
Biography:MAXiang-Li,Mastercandidate,mainlyengagedinecologyandphysiologyofgrassland.E-mail:xfmaxiangli@126.com
摘要:用不同浓度的一氧化氮(NO)供体硝普纳(sodiumnitroprusside,SNP)处理低温胁迫下 1年生黑麦草幼苗,探讨外源 NO
对提高黑麦草幼苗抗冷性的作用。结果表明:外源NO能减缓低温胁迫下黑麦草幼苗质膜相对透性的增加,促进脯氨酸(Pro)的
积累,提高超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)保护酶活性,其中 POD酶活性的提高尤为显著。恢
复生长时,经 SNP处理的幼苗膜透性、脯氨酸和保护酶活性恢复较快,其中 0.5mmol/LSNP处理的效果最为明显,0.2、1.0
mmol/LSNP处理的效果次之。
关键词:1年生黑麦草;一氧化氮(NO);低温胁迫;保护酶;抗冷性
文章编号:1000-0933(2005)06-1269-06 中图分类号:Q948 文献标识码:A
Studiesonmechanismofenhancingthechillingresistanceofannualryegrassby
exogenousnitricoxide
MAXiang-Li1,WEIXiao-Hong2*,LONGRui-Jun1,3,CUIWen-Juan2,WANYin-Lin2 (1.FacultyofGrassland
Science,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China;2.SchoolofLifeScience&TechnologyofGansuAgriculturalUniversity,
Lanzhou730070,China;3.NorthwestInstituteofPlateauBiology,ChineseAcademyofScience,Xining810008,China).ActaEcologicaSinica,
2005,25(6):1269～1274.
Abstract:Theannualryegrass(Lolioummultiflorum)wasusedinthisstudy.Theseedsofryegrassweregerminatedina
growthchamberat20±1℃,with60% to80% ofhumidity,under12hlight(400lx)/12hdark.Thecontinuousilumination
wasprovidedbycool-whitefluorescentlamps(400lx).Whenthesecondorthefourthleavesfulyexpandedthenormalleaves
wereselectedfortheexperiments.
SNP([Na2Fe(CN)5]·NO,Merck,Karmstadt,Germany)wasusedasNOdonor.Intheexperimentsthestocksolution
of10mmol/LSNPwaspreparedandimmediatelydilutedtothedemandedconcentrations.Thefolowingtwoexperimentswere
carriedout:
Experiment1 TheSNPsprayingtreatment:inthegrowthchamber,whenthefirstleavesfulyexpanded(3～4cmlong)
theseedlingsweregroupedandsprayedwithsolutionofSNPatdifferentconcentrationsof0,0.2,0.5and1.0mmol/L,which
contained2‰ Polysorbate-80toincreasetheleafsurfacetension.Thespraytreatmentswereconductedonceadayforthree
consecutivedays.Thenthesampleswithtriplicateweretakenupforthefurtherdetermination.
Experiment2 Chilingstress:AssoonastheExperiment1wasfinished,someofryegrassleaveswerekeptingrowth
chamberat0℃ tosufferfromchilingstress.Thereforethetreatmentsweredesignedasfolows:ANormalcontrol;B0℃-
chilingstresscontrol;C0.2mmol/LSNP+0℃-chilingstress;D0.5mmol/LSNP+0℃-chilingstressandE1.0mmol/L
SNP+0℃-chilingstress.Theabovechilingstresstreatmentslastedforoneorthreedaysinthegrowthchamber.
===================================================================
Thenthe
growthchamberwasresetat20℃,therebygettingtheryegrassbacktoanormalgrowthforthreedays.Duringchilingstress
periodandaftera3-dayrecoveringgrowth,theleavesweresampledwithtriplicate.
Althesamplesobtainedfrom theabovetwoexperimentswereusedtomeasurethemembranepermeability,proline
contentandtheactivitiesofSOD,PODandCAT.Altheexperimentaldatawereexpressedasmeans±SE,andthenanalyzed
byusingEXCELandDPStools.Moreoverthedatafromindependentsampleswerecomprisedbyusingt-test.Thedifferent
measurementsweresubjectedtoaone-wayanalysisofvariance(ANOVA).Inalcasestheconfidencecoefficientwassetat0.
05and0.01.
TheresultsshowedthattheSNPtreatmentwasabletoaleviatetheriseofmembranepermeabilityandacceleratethe
accumulationofprolineinryegrassunderchilingstress.Moreover,theactivitiesreductiontrendsofSOD,PODandCATin
thetreatedseedlingswereapparentlyslowedcomparedtothoseofchilingstresscontroledseedlings.Aftera3-dayrecovery,
themembranepermeability,prolinecontentandprotectiveenzymesactivitiesoftheseedlingstreatedwithSNPgotbacktothe
levelsofnormalseedlings,whilethoseofchilingstressseedlingswerenotabletogetrecoverycompletelyduetothechiling
damage.TheseindicatedthattheSNPhadafunctionofprotectingseedlingsfrom beingharmedbychilingstress;in
particular,theeffectof0.5mmol/LSNPwasmuchsignificant.ThemechanismthatNOisabletoenhancecoldresistanceof
ryegrassmightberelatedtothemodulationoftheactivitiesofprotectiveenzymesandthevariationofthemembrane
permeabilityandtheprolinecontent.
Keywords:annualryegrass;nitricoxide(NO);chilingstress;protectiveenzymes;coldresistance
草坪草同其它植物一样,常遭受不良环境的影响。温度是影响草坪草生长及分布的重要生态因子之一。草坪草的生长温度
域很窄,冷季型草的适宜温度为 15.6～23.9℃,超过此限,草坪草的正常生长发育和健康就会受到影响[1]。在温度胁迫下草坪
草将发生一系列生理反应,其中细胞保护酶活性、膜透性、脯氨酸含量等生理参数可作为评价草坪草抗冷性强弱的指标[2～4]。超
氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)是植物细胞内清除活性氧的重要保护酶,在胁迫强度和胁迫时
间不超过植物活性氧调控限度时,保护酶可诱导植物避免活性氧自由基对植物的伤害[5]。植物遭受低温冷害时,膜脂发生相变,
膜透性增加,溶质向胞外渗透,代谢失调,导致植物的代谢和死亡[6],所以,细胞质膜相对透性可反映低温下植物细胞膜受伤害
的程度[7]。脯氨酸为细胞渗透调节物质,植物体内脯氨酸的含量在一定程度上反映了植物的抗逆性,其含量的多少与植物抗性
呈正相关[8]。用生理生化方法来提高草坪草的抗冷性,对于提高草坪质量,解决冬季草坪泛黄现象,延长绿期有着重要的意义。
一氧化氮(NO)作为广泛分布于生物体的一类气体生物活性分子,属于活性氮(reactivenitrogenspecies,RNS)范畴。植物
体内通过酶促和非酶促途径产生 NO[9～11]。大量研究表明,自由基,尤其是活性氧自由基与植物的抗性密切相关[12]。NO可能以
自由基的形式参与植物抗逆生理生化过程[13],也可能是通过提高胞内其它活性氧诱发抗性反应[14]。Beligni等[15]在研究 NO对
马铃薯叶片保绿的实验中发现,NO具有中和植物细胞中活性氧自由基的作用。
此外,Caro和 Puntarulo[16]观察到 NO还可以显著降低大豆胚轴微粒体超氧阴离子的释放速度,说明 NO在植物细胞中具
有氧化与抗氧化双重作用。低浓度 NO可以促进植物的生长发育[17～19],也可以缓解盐胁迫诱导的小麦叶片膜脂过氧化,提高耐
盐性[20]。GarciaMata和 Lamattina[21]研究发现外源 NO预处理可以提高干旱胁迫下田间植物叶片的保水性、降低离子渗透、诱
导气孔关闭,从而提高耐旱性。2004年,王宪叶等[22]首次发现外源 NO预处理对小麦渗透胁迫造成的膜质过氧化有明显的缓解
作用。作为信号分子,NO在植物抗逆性中的作用越来越受重视。但是,NO对提高草坪草抗冷性的研究尚未见报道。本研究选
用特高(Tetragold)1年生四倍体多花黑麦草(Lolioummultiflorum)为供试材料,通过叶片喷施外源 NO,研究 NO对低温胁迫
下 1年生黑麦草膜透性及保护酶活性的影响,探讨 NO对提高草坪草抗冷性的作用。
1 材料与方法
(1)材料与处理 供试草种为特高 1年生四倍体多花黑麦草(Lolioummultiflorum)。将黑麦草种子均匀播撒于预先装入高
压蒸汽灭菌处理的土壤花盆中,置于 20±1℃的培养箱中生长,每天光照 12h,黑暗 12h,光强为 4000lx。待生长至 2～3叶期,选
取长势整齐一致,无病,无损伤的植株进行 NO供体硝普钠(sodiumnitroprusside,SNP)处理。3个 SNP处理浓度分别为 0.2、
0.5和 1.0mmol/L,各浓度处理量为 100ml,采用喷雾器喷施于黑麦草叶面,每个处理 3次重复,对照处理为蒸馏水。喷施后用
塑料薄膜覆盖植株保湿 2h。连续喷施 3d,每天 1次 ,第 4天将经过SNP处理的植物材料从培养箱中取出,在 0℃进行低温胁迫
1～3d。3d后取出置光照培养箱中在 20℃常温下恢复生长。试验分 5种处理:A.常温对照(20℃);B.低温对照(0℃);C.0.2
mmol/LSNP喷施加低温处理(0℃);D.0.5mmol/LSNP喷施加低温处理(0℃);E.1.0mmol/LSNP喷施加低温处理(0℃)。
各处理取生长一致的幼苗于冷胁迫前(0d)、冷胁迫期间(1d、2d、3d)及恢复生长第 3天取样测定有关生理生化指标。
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(2)测定方法 参照王韵唐主编的《植物生理学实验指导》[23],质膜相对透性的测定采用 DDS-11A电导仪法,以相对电导
率表示;脯氨酸的测定采用茚三酮显色法;过氧化氢酶(CAT)的测定采用碘滴定法;过氧化物酶(POD)的测定采用愈伤姆酚氧
化法;超氧物歧化酶(SOD)的测定采用 NBT显色法。每项指标的测定重复 3次。
(3)数据处理 数据通过 MicrosoftExcel和 DPS软件进行统计分析。
2 结果
2.1 外源 NO对低温胁迫下黑麦草细胞膜透性的影响
由图 1可见,低温胁迫前 SNP处理组质膜相对透性显著低于对照组(p<0.05),胁迫期间膜透性随时间的延长而增加,但
SNP处理苗增加幅度较低温对照苗的缓慢。在低温胁迫第 1天,低温对照苗的质膜相对透性较常温对照苗增加了 42.2%,而
0.2、0.5和 1.0mol/LSNP处理苗增加分别为常温对照苗的 31.3%、22.6%和 23.4%,均显著低于低温对照苗(p<0.05)。胁
迫第 3天时各处理质膜相对透性的增加均达到最大,低温对照苗增加最为显著,达到 61.4%;而各 SNP处理幼苗质膜相对透性
的增加第 3天较第 2天都有不同程度的减缓。
2.2 外源 NO供体对低温胁迫下黑麦草脯氨酸含量的影响
如图 2所示,低温胁迫条件下出现脯氨酸累积,随胁迫时间的延长,黑麦草叶片内脯氨酸累积逐渐增加,第 3天时低温对照
苗的脯氨酸含量比常温对照苗提高了 62.4%,且较低温胁迫第 1天增加了 48.8%。SNP处理组低温胁迫前脯氨酸含量高于对
照组(p<0.05),胁迫第 1天时脯氨酸含量也开始增加,至第 3天达到最高,SNP0.2mmol/L处理的黑麦草幼苗叶片的脯氨酸
含量比常温对照苗增加了 97.9%,SNP0.5mmol/L增加了 150.6%,1.0mmol/LSNP增加了 76.3%,其中以SNP0.5mmol/
L差异最显著(p<0.05)。由此可见外源 NO可以促进低温胁迫下黑麦草脯氨酸含量的增加。
图 1 NO对低温胁迫下黑麦草膜透性的影响(±SE)
Fig.1 Effectofnitricoxideonthemembranepermeabilityin
ryegrassunderchilingstress(±SE)
图 2 NO对低温胁迫下黑麦草脯氨酸含量的影响(±SE)
Fig.2 Effectofnitricoxideonprolinecontentinryegrassunder
chilingstress(±SE)
2.3 外源 NO对低温胁迫下黑麦草 SOD、CAT和 POD酶活性的影响
由图 3可见,在持续 3d的低温胁迫中,随着胁迫时间的延长,SOD、CAT和 POD3种酶活性的变化趋势有所不同。外源
NO处理可显著提高 SOD酶活性。低温胁迫前SNP处理组SOD酶活性要显著高于对照组。在低温胁迫期间,低温对照苗SOD
酶活性随胁迫天数的增加呈线性降低,趋势方程为y=-0.0889x+13.057。而SNP处理组的幼苗在胁迫的第 1～第 2天活性
有所上升,第 3天则迅速下降。在第 2天时各 SNP处理苗(0.2,0.5,1.0mmol/L)SOD酶活性(U/min·gFW)达到最大,分别
为 28.5、37.6和 29.1,而此时的低温对照苗以降至 10.1,差异极显著(p<0.01)。第 3天时 SNP处理组 SOD酶活性也开始下
降,表明至第 3天,胁迫强度和胁迫时间已超过黑麦草活性氧调控的限度,外源 NO的保护作用渐至丧失。图 4显示,外源 NO
处理也可延缓低温胁迫下 CAT酶活性下降的程度。未进行低温胁迫时 SNP处理组 CAT酶活性要显著高于对照组。低温胁迫
期间,低温对照苗 CAT酶活性随胁迫天数的增加持续下降,外源 NO处理组的幼苗与之变化趋势相似,但下降程度较轻。在低
温胁迫第 3天各处理的 CAT酶活性均下降至最低点,低温对照苗下降为胁迫第 1天的 75%,0.2、0.5和 1.0mmol/LSNP处
理苗分别降至胁迫第 1天为 35%、45%和 46%,差异显著(p<0.05)。如图 5所示,POD酶活性在低温胁迫期间的变化不同于
17216期 马向丽 等:外源一氧化氮提高一年生黑麦草抗冷性机制
图 3 NO对低温胁迫下黑麦草 SOD活性的影响(±SE)
Fig.3 EffectofnitricoxideonSOD activityinryegrassunder
chilingstress(±SE)
SOD和 CAT酶。外源 NO处理的黑麦草幼苗在 3d的低温胁迫
期间 POD酶活性一直呈上升趋势,在胁迫的第 1、2天 POD酶
活性增加显著,第 3天趋势变缓;0.2mmol/LSNP处理的幼苗
在胁迫第 3天时 POD活性较常温对照苗增加 66.6%,0.5和
1.0mmol/LSNP处理的幼苗分别增加了 99.9%,幼苗较常温
对照苗增加了 79.9%,POD活性的提高达到显著水平(p<
0.05);而低温对照苗在第 1、2天有缓慢增加,第 3天显著下降
(p<0.05),较常温对照苗下降了 38%。表明外源 NO可显著地
诱导 POD酶活性的提高。
2.4 恢复生长第 3天黑麦草叶片内各物质含量及保护酶活性
的变化
表 1结果显示,常温生长 3d后,经低温胁迫的植株其膜透
性、脯氨酸含量及保护酶系的活性均有不同程度的恢复。恢复生
长后,低温对照苗的细胞膜透性、脯氨酸含量逐渐恢复接近常温
对照苗,但 SOD,CAT和 POD酶活性均低于常温对照苗(p<
0.05)。SNP处理的幼苗细胞膜透性显著低于常温对照苗,脯氨
酸含量显著高于常温对照苗(p<0.05),其中 SNP0.5mmol/L
处理的苗差异最为明显(p<0.05)。恢复生长后 SNP处理组 CAT酶活性均高于对照(p<0.05)。SNP0.5mmol/L处理的黑麦
草 SOD恢复到接近常温对照苗的水平(p>0.05),而 SNP0.2mmol/L和 SNP1.0mmol/L处理的黑麦草叶片未能恢复到常
温对照苗的水平(p<0.05)。
图 4 NO对低温胁迫下黑麦草 CAT活性的影响(±SE)
Fig.4 EffectofnitricoxideonCAT activityinryegrassunder
chilingstress(±SE)
图 5 NO对低温胁迫下黑麦草 POD活性的影响(±SE)
Fig.5 EffectofnitricoxideonPOD activityinryegrassunder
chilingstress(±SE)
3 讨论
植物细胞膜对维持细胞的微环境和正常代谢起着重要作用。正常条件下,细胞膜对物质具有选择透性的能力。当植物受到
逆境影响时,如低温伤害,细胞质膜的透性会发生不同程度的增大,导致细胞膜结构功能的破坏,细胞内溶质大量外渗[24]。膜透
性增大的程度与逆境胁迫强度有关,也取决于植物抗逆性的强弱[25]。本试验结果表明:外源 NO处理降低了低温胁迫下黑麦草
细胞膜的质膜相对透性。说明外源 NO对细胞膜具有良好的保护或修复作用,可减轻或防止细胞膜系统的伤害。这可能是外源
NO缓和了膜相变化,从而缓解了膜透性增大和离子外漏。其中 0.5mmol/L的 SNP处理对细胞膜保护作用最为显著。
逆境条件下(旱、盐碱、热、冷、冻),植物体内的脯氨酸含量显著增加,一定程度上反映了植物的抗逆性。本试验结果表明:外
源 NO处理的幼苗在低温胁迫下其脯氨酸含量增加明显高于对照,脯氨酸能维持细胞的结构和调节渗透压,使植物具有一定抗
2721 生 态 学 报 25卷
性。本试验结果较好地反映了外源 NO可缓解低温对黑麦草幼苗造成的伤害。
表 1 恢复生长第 3天黑麦草叶片内质膜相对透性、脯氨酸含量及各种保护酶活性的变化(±SE)
Table1 ChangesofLeankageofelectrolyes,prolinecontentandtheactivitiesofprotectiveenzymesintheryegrassaftergrowthresumesfor3
days(±SE)
项目
Index
质膜相对透性
Membrane
permeablity(%)
脯氨酸含量
Prolinecontent
(umol/gFW)
超氧化物歧化酶
Superoxidedismutase
(U/(min·gFW))
过氧化氢酶
Catalase
(mg/(min·gFW))
过氧化物酶
Peroxidase
(umol/(min·gFW))
A 32.1±0.18 13.1±0.38 20.2±1.59 0.009±0.0007 122.2±9.62
B 33.5±0.53* 14.5±0.29 14.8±0.26* 0.005±0.0008* 94.4±19.2
C 28.5±0.50* 16.1±0.45* 17.3±0.55* 0.006±0.0007* 216.7±33.3*
D 24.6±0.64 18.4±0.35* 19.5±0.79 0.008±0.0005 250.0±16.7*
E 26.9±0.44* 15.8±0.27* 18.5±0.51* 0.007±0.0005* 227.8±25.5*
A 常温对照 Normalcontrol;B 0℃低温对照 0℃-chilingstresscontrol;C 0.2mmol/LSNP+0℃低温处理 0.2mmol/LSNP+ 0℃-
chilingstress;D 0.5mmol/LSNP+0℃低温处理 0.5mmol/LSNP+0℃-chilingstress;E 1.0mmol/LSNP+0℃低温处理 1.0mmol/L
SNP+ 0℃-chilingstress;* 常温对照差异显著(p<0.05)
许多研究表明,NO可以通过调节植物体内的活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)代谢来减轻胁迫伤害。例如外源 NO
供体(SNP)可以通过提高小麦叶片的抗氧化能力来缓解盐胁迫条件下的氧化损伤[20]。另一方面,NO可以诱导植物叶片保卫细
胞的气孔关闭,来降低干旱胁迫下的蒸腾作用,并可能与 ABA水平的调节有关[26]。另外,NO抑制植物线粒体活性的同时也可
增强抗氰呼吸,避免因线粒体电子传递链受阻而导致 ROS的积累[27]。逆境条件下,植物细胞产生的 OH-、O-2 和 H2O2等自由
基增多,自由基启动膜脂过氧化作用导致膜的损伤和破坏,造成植物体内重要的活性氧清除酶 SOD、CAT和 POD等膜保护酶
活性降低。因此,提高逆境下植物体内的 SOD、CAT和 POD酶活性能减缓膜脂过氧化过程[28,29]。本试验结果表明,外源 NO处
理可以提高低温胁迫下黑麦草幼苗 SOD、CAT和 POD的活性,并能维持在较高的水平上,尤其能显著诱导 POD活性的增高。
但外源 NO对 3种保护酶的诱导效果并不一致,可能与 NO在信号传导中的位置有关,也可能与植物低温胁迫下 SOD、CAT和
POD在膜脂过氧化中产生的位置和调节机制的不同有关。幼苗恢复常温生长以后,外源 NO浸种处理的幼苗细胞膜透性和膜
保护酶活性恢复较低温对照之幼苗快。说明外源 NO处理的黑麦草幼苗,受低温胁迫损伤较轻,细胞膜的修复较快,其中以
SNP0.5mmol/L处理的幼苗效果显著。
研究表明,外源 NO缓解膜脂过氧化、提高保护酶系活性,主要在于,一方面 NO通过抑制顺乌头酸酶等含非血红素铁类酶
活性来参与植物抗性生理反应。植物胞质顺乌头酸酶同工酶被 NO氧化失活后,可能转变为铁调节蛋白(iron-regulatory
peotein,IRP),进而调节体内铁稳态来影响与植物抗性有关的·OH生成[30]。另一方面,NO还可能影响过氧化氢酶(catalase,
CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(ascrobateperoxidase,APX)和细胞色素 C氧化酶(cytochromecoxidase,COX)[31]等含血红素铁
的酶活性来参与植物体内的生理代谢。从本试验结果来看,外源 NO提高 1年生黑麦草抗冷性与其抑制幼苗细胞质膜相对透性
升高,促进脯氨酸积累及提高 SOD,CAT和 POD等保护酶的活性有关。
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