全 文 ：第 18 卷 第 1 期
Vol. 18 No. 1
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2010 年 1 月
Jan. 2010
苦马豆素降解菌 YLZZ-2的降解特性与条件优化
王 妍, 胡延春, 余永涛 , 宋毓民, 李海利, 耿果霞, 王建华*
(西北农林科技大学动物医学院, 陕西 杨凌 712100)
摘要: YLZZ-2是一种具有降解苦马豆素活性的嗜麦芽寡养单胞菌( Stenotr op homonas maltop hilia )。采用正交试
验设计对影响其降解能力的培养基初始 pH 值、温度、底物浓度和摇床转速等 4 个因素进行优化, 以对 YLZZ-2 的
降解特性进行初步了解。结果表明: YLZZ-2菌在 pH 7. 0,温度 30 , SW添加浓度 5% ,转速 160 r min- 1时具有
最佳降解 SW能力。抗性检测表明,该菌具有氨苄青霉素、卡那霉素双重抗性, 质粒消除后抗性消失,降解性也丧
失,说明 YLZZ-2 菌降解 SW的功能与质粒相关。
关键词:嗜麦芽寡养单胞菌, 苦马豆素,生物降解, 降解质粒
中图分类号: S859. 8; Q949. 3 文献标识码: A 文章编号: 1007-0435( 2010) 01-0089-04
Characteristics of Swainsonine-degrading Bacteria YLZZ-2 and
Optimization of Conditions for Degradation
WANG Yan, HU Yan-chun, YU Yong- tao, SONG Yu-m in, LI Ha-i li, GENG Guo-x ia, WANG Jian-hua
*
( College of Veterinary Medicine, Northw est A & F Un iversity, Yangl ing, S haanxi Province 712100, China)
Abstract: YLZZ-2 is a st rain o f Stenot rophomonas mal top hi l ia capable o f Sw ainsonine ( SW) degradat ion.
In this study, four condition facto rs w ere opt imized by orthogonal test including initial culture medium
pH , temperature, SW subst rate concentrat ion, and speed of shaking. T he results show that YLZZ-2 could
degrade SW at it s best ef f iciency under the condit ion o f pH value 7. 0, temperature 30 , SW concentra-
t ion 5%, and shaking speed 160 r min- 1 . Results of resistance test show that the bacteria had ampicillin-
and-kanamycin resistance. T he resistance disappear ed and the ability of SW deg radat ion lo st w hen the
plasmids w ere eliminated f rom YLZZ-2, w hich indicates that the SW degradat ion funct ion of YLZZ-2 is as-
sociated w ith it s plasmids.
Key words: S tenot rop homonas maltophil ia, Sw ainsonine, Biodeg radat ion, Degr adative plasm id
疯草是指豆科棘豆属( Oxy trop is DC. )与黄芪
属( A str ag alus L. )的某些有毒植物、主要分布于我
国西北、西南、华北的主要牧区[ 1] 。苦马豆素
( sw ainsonine, SW)是疯草内的主要有毒成分,家畜
大量采食疯草后导致流产、死亡等症状[ 2, 3] , 这给畜
牧业生产造成重大经济损失。
虽然从毒物学角度看, 疯草是一类危害家畜的
毒草,但从牧草学和营养学角度看,疯草富含粗蛋白
质、粗脂肪、矿物元素和多种氨基酸,各种营养成分
近似于苜蓿, 是一种潜在的牧草资源 [ 4]。现阶段西
部草原生态环境日益恶化, 把疯草转化为优质牧草
资源加以利用, 对保护草原生态平衡,提高牧草资源
利用率,促进草原畜牧业可持续发展具有十分重要
的社会、生态和经济效益。
赵兴华等 [ 5]首次分离得到能够有效降解苦马豆
素的 YLZZ-2 菌, 经鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌
( S tenotr ophomnas mal top hi l ia )。本文对 YLZZ-2
菌的培养条件进行优化, 并对降解特性进行了初步
研究。这可为进一步研究 SW 降解机理和构建降解
SW 基因工程菌提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 主要试剂
苦马豆素标准品, 由西北农林科技大学动物医
学院生物毒素与分子毒理学实验室提供; 普通质粒
收稿日期: 2009-04-27;修回日期: 2009-07-06
基金项目: 国家自然科学基金( 30871901) ( 30571315)资助
作者简介:王妍( 1979- ) , 女, 山东临邑人, 博士研究生, 研究方向为动物中毒性及营养代谢性疾病, E-mail: yanwang0803@ yahoo. com .
cn ; * 通讯作者 Author for corr espondence, E-mail: jhw ang1948@ sina. com.
草 地 学 报 第 18卷
小提试剂盒( T iangen Biotech)、甘露糖甙( Sigma)、硅
烷化试剂 BSTFA + TMCS( Suplelco)、琼脂糖凝胶
( Biowest Agarose)、苯甲酸钠、甲醇等为国产分析纯。
1. 2 菌种来源
嗜麦芽寡养单胞菌 YLZZ-2, 由西北农林科技
大学动物医学院实验室从埋有疯草的土壤中分离、
鉴定。现保存于中国典型培养物保藏中心, 保藏编
号: CCT CC NO: M 207109[ 6]。
1. 3 YLZZ-2菌的降解条件优化
YLZZ-2菌株经活化培养, 以 5% ( OD 600值为
0. 05)接种量接入无机盐培养液( MS) [ NH 4NO 31. 0
g, MgSO4 0. 15 g, ( NH 4 ) 2SO 4 0. 5 g , KH 2PO40. 5
g, NaCl 0. 5 g, K 2HPO 4 1. 5 g, 蒸馏水1L]。按照
实验设计添加不同浓度 SW( 1g L - 1 )为唯一碳源,
培养 24 h。试验采用 4因素 3水平[ L 18 ( 34 ) ]正交
试验设计[ 7, 8] (表 1)。研究培养基初始 pH、培养温
度、底物 SW浓度、摇床转速等不同因素对 YLZZ-2
菌降解 SW的影响,每组试验重复 3次。
表 1 正交实验设计因素水平表
T able 1 Facto rs and levels o f the o rthogonal test
水平
Level
因素 Factor
pH
温度( )
T em perature
SW 浓度(% )
C on cent rat ion
转速( r min - 1)、
Rpm
1 6. 5 25 1 120
2 7. 0 30 5 160
3 7. 5 37 10 200
1. 4 抗性检测
将 YLZZ-2菌分别接入加有不同浓度的氨苄青
霉素( Amp+ )、卡那霉素 ( Ka+ )、链霉素( Sm+ )、氯
霉素( Cm+ )LB板中,观察菌株生长情况,确定其抗性。
1. 5 质粒检测
1. 5. 1 质粒提取 质粒的提取均严格按照试剂盒
产品说明书操作进行。
1. 5. 2 质粒消除 在 MS+ SW 液体培养基中添加
600 mmol L - 1苯甲酸钠进行质粒消除 [ 9] , 设阴性
对照。30 培养 72 h,取 50 L 涂布于 LB 板。再
选取相应菌落接种到 MS+ SW 板、LB 板(分别含
100 g mL - 1氨苄青霉素、60 g mL - 1卡那霉
素) ,试验重复 3次,平行对照 3个。30 16 h 后观
察菌落长势,并选取相应的菌落进行质粒提取和降
解效果测定。
1. 6 SW降解效果测定
1. 6. 1 薄层色谱法测定 [ 10] 定时取样品, 冷冻干
燥后溶于甲醇。展开剂为甲醇氯仿 氨水蒸馏
水= 70 26 2 2 ( V/ V) , Eh richs 试剂显色。
SW 标准品作对照。
1. 6. 2 气相色谱法测定 [ 11] 以吡啶为溶剂, 硅烷
化试剂 BSTFA + T MCS 进行衍生化。采用 GC-
14C气相色谱仪进行检测, AT . SE-54 型石英毛细
管柱( 30 m 0. 25 mm 0. 33 m) , 柱温 210 , 进
样口温度 280 , 氢火焰离子化检测器 ( FID)温度
300 , 载气为高纯氮, 流速为 2 mL min- 1 , 进样
2 L,分流比 601。
1. 7 统计分析
试验数据用 SPSS 13. 0 软件处理, 对影响
YLZZ-2 菌降解 SW 的各因素进行了正交方差分
析。试验结果以平均值 标准差表示。
2 结果与分析
2. 1 各因素对 YLZZ-2菌降解 SW能力的影响
培养基初始 pH 值、培养温度、底物 SW 浓度、
摇床转速等不同因素对 YLZZ-2 菌降解 SW 的影
响。由图1可知, 在pH 7. 0,温度30 , 添加 SW浓
度为 5%, 转速为 160 r min- 1时降解效果最好。4
因素交互比较结果(表 2)显示: pH 值、温度和 SW
浓度对 YLZZ-2 菌降解 SW 能力的影响差异显著
( P< 0. 05) ,转速影响差异不显著。
图 1 培养基初始 pH值、温度、SW添加浓度、摇床转速对降解率的影响
Fig. 1 Effect of initial cultur e medium pH value, temperature, SW addition concentration and shaking speed on degradation rate
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第 1期 王妍等:苦马豆素降解菌 YLZZ-2的降解特性与条件优化
表 2 正交方差分析
Table 2 Variance analysis o f or thogona l exper iment
方差来源
S ou rce
偏差平方和
Sum of Square
自由度
Freedom
均方
Mean Square
F P
pH 值 55. 593 2 27. 797 6. 174 . 021
温度
Temperatur e
84. 440 2 42. 220 9. 377 . 006
浓度
Concent ration
60. 160 2 30. 080 6. 681 . 017
转数 Rpm 23. 380 2 11. 690 2. 596 . 129
误差 E rror 40. 522 9 4. 502
2. 2 YLZZ-2菌的抗性与质粒的检测
抗性检测结果见表 3。YLZZ-2菌具有氨苄青
霉素和卡那霉素双重抗性。
经试剂盒小量制备消除前后的质粒, 结果见图
2。采用苯甲酸钠处理后,质粒被消除。
经苯甲酸钠处理的菌株只能在 LB 板中生长,
而不能在 MS+ SW板和含有氨苄青霉素、卡那霉素
的 LB 板上生长。这表明经质粒消除后的菌体不能
利用 SW 作为唯一碳源进行生长,而且抗性也消失。
表 3 YLZZ-2 菌的抗性检测结果
Table 3 Result of YLZZ-2 resistance test
浓度( mg L- 1 )
Concent ra tion
Amp+
100 200
Cm +
100 200
Ka+
75 150
Sm+
60 125
消除前
Befo re elim itat ion
+ + - - + + - -
消除后
A fter elimit ation
- - - -
注: + 表示生长; - 表示不生长
Not e: + indicat es g rowth; - means no growt h
图 2 YLZZ-2菌质粒消除前后的琼脂糖凝胶电泳.
A. YLZZ-2 菌质粒;B. 经苯甲酸钠处理后提取的质粒;
M. -EcoT 14 digest DNA Marker.
Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of YLZZ-2 plasmid before or after
elimination. A. YLZZ-2 plasmid; B. YLZZ-2 plasmid after sodium
benzoate treatment; M. -EcoT 14 digest DNA Marker.
2. 3 降解性检测
薄层色谱法检测结果见图 3, 气相色谱法检测
结果见图 4、5、6。
由图 3可知, YLZZ-2 菌在 5% SW MS 培养基
中培养 24 h后未观察出紫红色斑点(即 SW 斑点) ;
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草 地 学 报 第 18卷
16 h紫色点比 0 h 淡且斑点面积小;经苯甲酸钠处
理的 YLZZ-2菌在 5% SW培养基中培养 24 h 的斑
点面积和颜色与 0 h 斑点大小相似。气相色谱检测
进一步证实消除质粒的 YLZZ-2菌在相同时间内无
降解 SW 能力(图 6)。
图 6 经苯甲酸钠处理 YLZZ-2 菌培养 24 h
1. 甘露糖甙; 2. SW
Fig . 6 Gas chromat og ram of YLZZ-2 cultur ed fo r 24 h after
sodium benzoate tr eat ment 1. me-Gal; 2. SW
3 讨论
目前解决家畜疯草中毒的常规措施一般有生态
系统控制、添加解毒剂、动物免疫等。应用生物降解
手段向动物瘤胃添加降解苦马豆素基因工程菌则为
解决动物疯草中毒提供了一条新途径。本实验室从
埋有疯草的土壤中分离、鉴定了多株苦马豆素降解
菌[ 5,12] , YLZZ-2菌为其中一株嗜麦芽寡养单胞菌。
环境因素对微生物降解有机物具有重要影响作
用。它不仅直接关系到有机物的去除效率, 而且不
同的环境因素可能导致有机物不同的降解途径。因
此在应用生物降解技术时必须加以考虑。本研究通
过对 YLZZ-2菌的培养特性优化, 发现在 pH7. 0,
30 ,添加 5%SW 浓度, 160 r min- 1的摇床转速
条件下 SW可达到最佳降解。这与本实验室分离的
另一种降解 SW 的不动杆菌 YLZZ-1 最适条件相
似[ 12] ; 与刘鹏 [ 13] 和黄星[ 14] 分别筛选的降解阿特拉
津和噻吩磺隆的嗜麦芽寡养单胞菌最佳降解条件中
的 pH 值一致, 但其它条件有所差异,这可能与降解
底物的不同有关。降解菌培养条件的优化为大量发
酵 YLZZ-2菌奠定了基础。
抗生素的抗性大多都是与细菌所含的质粒有关
(也有一些抗性直接由染色体编码 [ 15] )。本试验通
过四种抗生素筛选发现, 该菌具有氨苄青霉素和卡
那霉素双重抗性, 且与质粒有关。这可为转基因工
程菌的构建与降解性研究提供抗性标记。研究表
明,很多编码异生物质降解酶系的基因都存在于质
粒 DNA 上[ 9, 16]。质粒消除试验是鉴定质粒功能的
一个重要手段。本试验通过苯甲酸钠干扰质粒复
制,进行了质粒消除。为了精确监测 YLZZ-2 菌质
粒消除后的降解能力, 本研究同时使用了薄层色谱
与气相色谱。结果表明降解检测效果相一致,即质
粒消除降解能力丧失。初步认定 YLZZ-2菌降解
SW 的能力与质粒相关, 此结果为降解基因定位,克
隆与表达提供了线索。
在薄层色谱检测中同时还发现 YLZZ-2 菌在
16 h、24 h均出现明显的黄色斑点,推测是 SW 降解
产生的中间产物。但在气相色谱中未检测出特异
峰,可能检测过程中添加了衍生化试剂,导致与其代
谢产物发生化学反应未被检出。这些现象有待于进
一步研究。
4 结论
苦马豆素降解菌 YLZZ-2在 pH 值 7. 0, 培养温
度 30 , SW 浓度 5% ,转速 160 r min- 1时降解效率
最高; YLZZ-2菌具有氨苄青霉素和卡那霉素双重抗
性,其抗性和降解 SW的特性均与质粒有密切关系。
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(责任编辑 邵新庆)
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