全 文 ： {_～峭
第 19卷第 6期
1g99年 11月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vo1．19．NO．6
NOV．．1gg9
Cd卜、Al3+对蚕豆(Vicia faba)DNA合成及修
复的影响
x I。 ． ；
常学秀，王焕校
(云南大学生物系．昆明 650091)
摘要．利用。H·TdR掺人方珐 ，研究了不同浓度单金属离子 Cd抖、AI卜对蚕豆 DNA合成、DNA修复 ( UDS为指标)的
影响 结果表明t在低浓度 cd抖、A】 (Cd抖浓度"(gOmg／1．A】 浓度<100rag／])处理后 ．蚕豆DNA舍成加快 ，并且不同
程度地诱导了 UDS的发生；但在高于此浓度的 cd抖、AI卜作用下 ．蚕豆 DNA合成受抑制，浓度越高 ，抑制作用越强 F并
且几乎不表现出UDS效应 这一结果说明Cd¨ 、A】 对蚕豆的遗传物质 DNA有损伤作用．在一定受掼范围内．蚕豆自
身有 DNA损伤修复能力．超过这个限度．DNA损伤不能被修复。Cd“+、A] 对 DNA合成和修复的影响是高等植物垒属
中毒的机制之一
关■词；蚕豆(v 咖 )；垒属离子}DNA合成}UDS (。t 』
～ ～ — - — — — ⋯
Effects of Cd” 、Al” 0n the DNA synthesis and DNA repair in Vicia
taOa
CHANG xHe—Xiu，W ANG Huan—Xiao (BiologyDepartme t． ⋯ U iversity．Kunming 650091．Chi~)
Abstract：Withthemethod ofincorporating。H—TdRinto DNA inVicia丘 bain vivo，the effects ofdifferent
concentrations of metal ions(CA and AI )on the scheduled DNA synthesis and DNA repair(using the
unscheduled DNA synthesis．UDS，as its endpoint)were studied．The results show as folows．The lOW
concentratioIlS Of Cd and AI promoted the DNA synthesis and induced UDS in Vicia丘ba in vivo(CA 抖
< 20mgll，AI”
ions．as Cd“+andAI ．couldinjure DNA inViciafabain vivo．Andthe plant hadthe ability ofDNA repair
within a certain lower damage degree．The efect of Cd 、AI” on the DNA synthesis and repa~ WaS one
kind of the toxic machenism of metal ions on the higher plants．
Key words：Vicia batmetal ion}DNA synthesis；UDS
文●蛐号 ：10o0—0933(1999)06—0885·05 中蕾分冀号 }X 171 文献标讽玛 A
研究表 明，环境污染物能影响生物 DNA的结构 、功能和代谢(包括合成 、分解和修复)_】 ]。而 DNA结
构和功能的稳定、完整对保持生物遗传性的稳定是必要的。DNA损伤修复功能在这里起着很大的作用。自
1958年 Repert等首次证明紫外线照射造成的 DNA损伤可被修复后 ，有关 DNA修复的研 究长期以来为生
命科学工作者所重视 。DNA损伤修复有多种类型．很多遗传毒理学所用的 DNA修复测试方法是细胞非按
期 DNA合成 (unscheduled DNA synthesis，简称 UDS)技术 。目前 UDS成为研究 DNA损伤修复的重要指
标 但是．前人关于污染物对生物 DNA合成影响、UDS效应方面的研究多见于以动物为实验对象 ，且多以
离体培养细胞为材料0叫 ．对高等植物的研究并不多见。另一方面，金属离子作为一类广泛存在于环境中
基盘硬 目：国家自然科学基盒资助项 目(39360020)
本文在实验及写作过程中 ．云南大学生物系段昌群教授一直给予极大的关心和帮助 ，在此深表谢意
收稿日期 }1997—18一oll话订 日期：1998—06 10
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的潜在有毒物质 ．有关它们对生物毒害机制的研究成果国内外均有很多报道“卜” 。但它们对生物t特别是
整体动植物的 DNA合成和修复的研究 尚少见报道 。为此 ，在前人研究的基础上以蚕豆为材料，用。H TdR
前体掺入法探讨 了 cd“+、A1抖对植物 DNA合成及修复的影响．进一步研究金属离子的遗传毒性 一并且为
高等植物 DNA损伤修复的研究提供一点参考材料 。
1 材料和方法
1．1 实验材料
蚕豆(Vicia如ba)品种 8363，由云南省农业科学研究院豆科所提供 。
1．2 试验方法
供试材料 的培养 ：选择饱满．大小均匀的蚕豆种子+用蒸溜承冲洗后放在垫有滤纸的培养皿中(每皿 10
粒种子)，在培养箱中无光培养(24士0．5"C)+每天早晚各换一次承。待多数胚根突破种皮(培养 30h)，进行
染毒处理 对照组用双蒸水培养。40h后将种子冲洗干净+并用蒸馏水恢复培养后进行 下测定
1．2．1 蚕豆 DNA合成速率的测定 参照孟祥栋等 “]，周晓强等 ，王浩丹等：“ 研究者的实验方法并略
加改进 。取恢复培养 5h的萌发种子胚分别置于有 lml标记液的青霉素小瓶中(标记液配方： H TdR3uci／
ml+青霉素G50．t,g／m1．硫酸链霉素 50．g／m1)，24~0．5℃暗中保温 3h+中间经常摇动通气 。保温后的胚先用
自来承冲洗表面标记物，再 用冷无承乙醇冲洗 ，吸干置于一20C冰箱中冰冻 20h以终止细胞活动 。然后用
冷 乙醇在冰上研磨．提取定窖至 3ml，2000r／min离心 20rain。弃上清 ．沉淀部分用冷无水乙醇反复冲洗 ，离
心多次，直至游离标记物冲洗干净，加 2ml 5 高氰酸，70℃承解 40min，50℃水解过夜 ．再加 NaOH 中和．
取上清渣 0．5m1．加 5ml闪烁液(5gPPO+0．sgPOPOP，溶于 1L甲苯) 暗中静置 241x，于 FJ一2101双道液闲
仪上测定cpm 值．作为 H TdR对 DNA的掺入 ．其大小表示 DNA合成速率的大小。结果 3次重复的平
均值表示。
1．2．2 蚕豆胚非按期 DNA合成 (UDS)的测定 将恢复培养 3h的萌发种子换至 10vmol／ml(共 50m1)羟
基脲溶液中连续培养 2h．然后取肛进行标记 3h+(标记液配方 ：羟基脲 10vmol／ml，其余 同上)。为了检测羟
基脲对 DNA合成的抑制作用+特加了一十不经染毒，标记液 中也无 HU 的对 照处理 后的处理步骤同
DNA合成速率的测定 结果 3次重复的平均值表示 。
2 实验结果
2．1 不同浓度 cd抖、AI蚪对蚕豆 DNA合成的影响 ，实验结果见图 1和图 2。
_
． 帆几
0 l 5 J0 20 30 50
c 滩度(,as／L)
c Con~ tration
图 1 Cd抖对垂豆 DNA合成的影响
Fig 1 Efect of Cd 0n DNA sytthesis in Vicia ‰
5 l0 20 钟 J∞ 2∞
+
。 鉴( )
图 2 AI 对垂豆 DNA台成的影响
Fig．2 Effect of A] oft DNA synthesis in Vicia
由图 1、图 2可见 ，金属离子 c 、A1抖能影响蚕 豆 DNA合成+且不同浓度的 c 、Al抖对蚕豆 DNA
合成的影响是不同的 =与对照相 比，A1¨ 、cd针在低浓度时对 DNA台成有促进作用(Cd抖浓度<．20mg／L，
Al 浓度<~50mg／L)；而当它们增加到一定浓度时 ．促进作 用减弱．DNA合成接近对照水平；高浓度的金属
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6期 常学秀等 ：cd 、Al 对蚕豆(Vicia厶ba)DNA合成及修复的影响 837
离子抑制了 DNA的合成 ，表现为当 cd 一浓度>20mg／L，浓度 AI ~50mg／L时，DNA提取物放射性强度
(cpm值 )降低 cd 浓度 为lmg／L时，对 DNA合 成速率 具有 最大 的促 进作 用，而 Al。 则在其 浓度 为
10mg／L时才表现出这种最大促进作用。另外，50mg／L的 cd 使 DNA合成速率比对照降低了 0 6倍 ，而
此浓度水平的 Al。 尚未表现出对 DNA合成的抑制作用。甚至 100mg／L的 AI卜的抑制作用都没有 50rag／
L的cd抖的抑制作用强烈。说明Cd抖和A1 +促进或抑制 DNA台成的l临界旅度不同。
2．2 Cd”+、AI计诱导蚕豆非按期 DNA合成 (UDS)的效应
实验结果见图 3、图 4。
一
馨
主
A】’ 维 度 Al Co~l~ trat[on (rag／L)
图 3 Cd“f诱导蚕豆 UDS的效应
Fig．3 Inductive effect of Cd抖 on UDS in Viola胁 图 4 AI抖 诱导 蚕豆 UDS的效 应
Fig 4 Inductive effect of A【。 on UDS in Viola
由图 3、图 4可见，Cd 、AI 均能诱导蚕豆发生 UDS，而且不同浓度的金属离子诱导蚕 豆 UDS的效
应是不同的。加入羟基喙抑制正常的 s期 DNA合成。结果表明这种抑制作用是明显的(尸<0．01)，不加羟
基脲时对照组的。H TdR掺入量是加入羟基脲后的 2～3倍 。小于 20mg／L的Cd 和小于 100mg／L的 Al抖
都能不同程度地诱导蚕豆发生 UDS，表现为 DNA提取物放射性强度 (cpm值)的升高 。其中，Cd。 浓度在
lmg／L时，表现出最大诱导作 用(其 cpm值是对照组 的 1．5倍)，而 Al 则在 20mg／L时诱导作用最强 (其
cpm值是对照组的 2倍)。大于 20mg／L的 cd’f和大于 100mg／L的 Al 则几乎没有 UDS效应 ，表 明此旅
度水平的cd”+、AI 作用下，蚕豆几乎投有 DNA修复能力。
3 结论
cd抖、AI 对 DNA合成和修复的影响是高等植物金属中毒的机制之一。
3．1 cd抖、AI 能直接或间接损伤 DNA分子 ，具有遗传基因毒性
UDS的发 生是 DNA 分子受损伤的表现。州。软低 浓度 Cd抖、A1卜作 用下高等植 物发生 UDS表明
Cd抖、A1卜能直接或间接损伤 DNA分子 ，使植物在遗传基因水平上中毒 较高旅度的 Cd抖、A1¨ 引起 DNA
分子过度损伤，也包括修复系统本身，DNA修复活动难以进行。DNA修复不完全将使损伤固定为突变或
染色体断裂，并因而提高突变率
3．1 Cd +、A1“+能直接或间接影响 DNA台成 ，具有生理生化毒性
DNA 损伤使 DNA模板完整性 丧失，引起低效的转录及转译{DNA损伤 引起的修 复活动 也会抑 制
DNA正常复制 。cd“+、A1抖对 DNA合成的影响会给高等植物带来一系列不 良后果 ，这种“链式反应”使植
物在各十层次上受到毒害。①DNA修复是以 DNA合成为基础的 ，DNA合成受抑制影响了 DNA修复的顺
利进行 ：，提高突变机率 ②间期 DNA复制是细胞有丝分裂的基础 ，DNA合成受抑制将使细胞有丝分裂
频率降低；③组织、器官和个体的生长将 因有丝分裂的减少而停滞 }④根的生长受抑制将 降低植物对水分
和矿质养分的吸收}叶的生长受抑制将降低植物光台作用台成有机物的能力；@整个植物个体将因新陈代
谢 的紊乱而受害，甚至死亡 ．
4 讨论
几¨¨U∞
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门 ¨¨U 圳谢
且 。般
一
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4．1 金属离子影响高等植物 UDS效应分析
研 究表明，羟基脲抑制 H TdR掺入 NDA的作用是明显的(图 3、图 4)，不加羟基脲时 H—TdR的掺入
量是加入羟基脲后的 2～3倍 。在羟基脲存在条件下，金属 离子 cd抖、AI 所刺激的 H—TdR掺入量增加是
它 们诱导 UDS效应的结果，是 DNA修复合成 的表现 。在高浓度 (CA 。 浓度>20mg／1、A1抖>100mg／1)
下 ． H—TdR掺入量保持在对照水平而没有进一步下降也证明了这种增加是 DNA修复的表现。
很 多遗传毒理学实验所采用的 DNA修复测试是 UDS技术，只要发现 UDS量增 加，就表 明曾经发生
了DNA 损伤 。本文的结果表明，金属离子能诱导蚕豆胚发生 UDS，说明它们对 DNA分子有损伤作 用，
而生物在一定范围内能修复受损伤的 DNA．以维持其遗传上的稳定性 。由图 3、图 4可见．金属离子在一定
浓度范围内，随着浓度升高，诱导 UDS的能力也加强，表明对 DNA的损伤作用增大 超过一定浓度后 ，随
着浓度增加．诱导 UDS的能力下降。在大于 20mg／L的 Cd件或大于 100mg／L的 Al“-的作用下 ．蚕豆胚几
乎不表现出 UDS数应。但这不是说没有 DNA损伤 ，而是修复台成能力的丧失。分析这一结果表明，生物的
DNA修复能力是有一定限度的，超过这个限度 ．DNA损伤不能修复。固为 DNA修复是一个酶促过程 ，而
且修复与转录相偶联0 过高的诱变物剂量使参与这一生理过程的酶等修复系统失活 ，同时DNA修复
是以 DNA合成为基础的，DNA合成受抑制影响了UDS的发生 ]¨ 早期 的研 究者认为，高等植物没有切除
修复能力 ，就 是固为它们所 用的辐射剂量太高．产生的二 聚体比例均高 于能修复的范 围 ，即 DNA 分子
上的损伤数量超过细胞修复能力的限度 。
Jackson和 Linskens用 22种金属离子加到矮牵牛花粉的悬浮培养液中，观察到非预定 DNA合成。这
个结果与本文的实验结果相一致嘲]，他们发现 Al卜的作用最强 ．并把这种现象解释为这些金属离子，如
Al抖与 DNA分子相结合，弓f起这部分 DNA的切除修复 ，从而发生非预定 DNA 合成。但杨瑞等在研 究
BHC和 CdC1 对草鱼原代肝细胞培养物中DNA修复的诱导作用时发现 ，BHC可诱导 DNA修复 ．但 CdC1
没有活性 ．这与本文的结果相悖 ，可能与所用供试材料和受检物浓度不同有关
4．2 金属 离子影响高等植物 DNA合成机制探讨
在低剂量金属离子作用下，DNA合成有明显加速现象，这可能是 由于 DNA分子一定的损伤而诱发的
一 种适应性反应。有人认为小剂量诱变剂前处理，可能加快 了植物棱酸代谢活动，使单位 DNA分子复制时
同诱变剂作用机会降低 。接冗余理论来理解 ，生物在低浓度金属离子的诱导下产生较多的 DNA，一方面
可部分抵消金属离子促进 DNA 降解 而引起的 DNA含量下降 ；另一方面 ，部分 DNA分子受损的同时．生
物加快 DNA 的“生产 以保证有足够的完整 DNA来维持生物体遗传性的稳定和完整 。本文的实验结果表
明 DNA台成 加速与 UDS效应这两个生物学终点具有相近 的剂量效应区，推 测低浓度 金属离子处理 时
DNA合成量的增加与 DNA修复有关 ．这种增加可 能部分是 UDS效应的结果 。
前人的研究结果表明，诱变剂能抑制 DNA合成0 ]。孟紫强研究了砷对人血淋巴细胞 DNA 合成的
效应时．发现无机砷化台物在低浓度下，对植物血凝幕刺激的人外周血淋巴细胞 DNA台成有显著促进作
用 ．而当其选到一定浓度时．对 DNA合成有显著抑制作用 ] 这与本文的结果相一致 另外．体外试验表
明，铝可减步 DNA 的合成 有人认为细咆 DNA合成速率受抑制表明 DNA复制模块受到损害 。张治
平对亚砷酸钠致整体动物 DNA合成抑制 的研究表明，亚砷酸钠 对各组织均有明显的抑制 DNA 合成作
用 。汪丽虹等研究 C¨ 重离子辐射对枸杞萌发种子核酸合成的抑制作用表明，DNA链断裂使 DNA模板
完整性丧失，引起低效的转录及转译 。关于金属离子弓f起 DNA链损伤断裂、DNA构象改变、DNA台成
酶活性变化等影响的报道还有很多 卜” 龃] 这些 因素都能使 DNA 合成受影响。有的学者认为 ，金属离子
能与 DNA结合成牢固的“DNA一金属离子 复合物，造成 DNA的交联 ，这样会妨碍 s期增殖细胞 DNA的
解链 ]。而解链是 DNA复制的基础 。
总之．金属离子影响 DNA合成 、UDS效应的机理可能是多元的 ．是多种效应的综合结果。本文的研究
仅揭示 了金属离子对新合成 DNA速度的影响 ，至于这种影响到底发生在哪些环节上还不甚清楚．有待进
一 步研究 但有一点值得指出．如果没有 DNA 损伤．则不会发生 UDS效应 。cd 、Al +能诱导蚕豆胚
UDS的发生．说明它们能够损伤 DNA模板。这种损伤是它们影响 DNA合成的原固之一。
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6期 常学秀等 ：Cd +、Al卜对蚕豆 (Vicia血ba)DNA台成及修复的影响 859
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