全 文 ：核 农 学 报摇 圆园员猿袁圆苑渊员园冤院员源圆源 耀 员源猿园
允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
收稿日期院圆园员圆鄄员员鄄员怨摇 接受日期院 圆园员猿鄄园猿鄄圆园
基金项目院国家野十二冶五科技支撑计划渊圆园员员月粤阅猿缘月园圆冤
作者简介院向殿军袁男袁讲师袁主要从事水稻生物技术研究遥 耘皂葬蚤造院 曾蚤葬灶早凿蚤葬灶躁怎灶园园岳 员远猿援 糟燥皂
通讯作者院徐正进袁男袁教授袁主要从事水稻生理和遗传基础研究遥 耘皂葬蚤造院 曾怎扎澡藻灶早躁蚤灶园园岳 员圆远援 糟燥皂
文章编号院员园园园鄄愿缘缘员渊圆园员猿冤员园鄄员源圆源鄄园苑
蕴泽陨悦耘员基因表达及调控转基因水稻抗冷通路研究
向殿军员袁圆 摇 满丽莉员 摇 张 娣员 摇 王丽娜猿 摇 殷奎德源 摇 宋群雁源 摇 徐正进圆
渊员 黑龙江农业经济职业学院袁黑龙江 牡丹江摇 员缘苑园源员曰圆 沈阳农业大学水稻研究所 辕农业部作物
生理生态遗传育种重点开放试验室 辕辽宁省北方粳稻育种重点实验室袁辽宁 沈阳摇 员员园员远员曰
猿黑龙江省农业科学院大庆分院袁黑龙江 大庆摇 员远猿猿员怨曰源 黑龙江八一农垦大学生命科学学院袁黑龙江 大庆摇 员远猿猿员怨冤
摘摇 要院蕴泽陨悦耘员 基因是从生菜中分离的一个低温胁迫转录因子袁过表达 蕴泽陨悦耘员 基因的转基因水稻提高了
抗寒能力遥 蕴泽陨悦耘员 基因在生菜的根尧茎尧叶中为组成型表达袁其中叶的表达量较强遥 蕴泽陨悦耘员 基因的表达
水平能被冷尧粤月粤和 晕葬悦造处理所上调袁但不被脱水处理上调遥 卡方测验表明袁转基因 栽员 水稻潮霉素抗
性发生了 猿颐 员抗性分离模式袁大多数转基因植株中 蕴泽陨悦耘员 基因是以单拷贝尧单位点整合到水稻基因组
中遥 杂燥怎贼澡藻则灶和 晕燥则贼澡藻则灶杂交检测结果表明袁猿 个抗冷的转基因株系中 蕴泽陨悦耘员 基因均是以单拷贝尧单位
点整合到水稻基因组中袁并正常表达遥 冷胁迫下袁蕴泽陨悦耘员 基因的超表达对水稻的 韵泽阅砸耘月员粤 基因影响
较大袁表明 蕴泽陨悦耘员 基因对转基因水稻抗寒性影响依赖 韵泽阅砸耘月员 冷反应通路遥
关键词院水稻曰 蕴泽陨悦耘员 基因曰 表达分析曰 冷胁迫曰 冷诱导基因
摇 摇 许多植物在遭受非冰冻低温后袁会诱导一些冷诱
导基因渊悦燥造凿鄄则藻泽责燥灶泽蚤增藻 早藻灶藻泽袁 悦韵砸冤表达袁形成一套
低温冷驯化应答反应机制袁改进植物的抗寒能力咱员暂 遥
悦韵砸基因表达的转录调控对植物的冷应答反应至关
重要袁转录因子与 悦韵砸基因启动子上的顺式作用元件
的相互作用已被证明是诱导 悦韵砸 基因表达的关键步
骤咱圆暂 遥 一些 悦韵砸 基因的启动子上含有 悦 重复元件
渊 悦鄄则藻责藻葬贼袁 悦砸栽 冤 或脱水反应元件 渊 阅藻澡赠凿则葬贼蚤燥灶鄄
则藻泽责燥灶泽蚤增藻 藻造藻皂藻灶贼袁 阅砸耘 冤 咱猿 原 源暂 遥 悦月云 辕 阅砸耘月员 作 为
悦韵砸基因的开关袁其能与 悦砸栽 辕 阅砸耘 顺式作用元件结
合袁激活一系列 悦韵砸 基因的表达袁提高转基因植物的
抗寒性咱缘 原 苑暂 遥 拟南芥 陨悦耘员 基因是 悦月云 辕 阅砸耘月员 基因
的上游调控因子袁其编码一种碱性 原螺旋 原环 原螺旋
渊月葬泽蚤糟 澡藻造蚤曾鄄造燥燥责鄄澡藻造蚤曾袁 遭匀蕴匀冤转录因子袁其蛋在冷胁
迫下被磷酸化尧脱磷酸化和泛素化作用等转录后修饰
后袁能够特异结合 悦月云猿 启动子上的 酝再悦 识别序
渊悦粤晕晕栽郧冤列上袁激活 悦月云鄄悦韵砸 冷反应通路袁提高转
基因拟南芥的抗寒性咱愿暂 遥 陨悦耘员 基因及其同源基因对
悦月云基因的调控作用在其他植物中也是保守的袁提高
了转基因植物的抗寒性咱怨 原 员员暂 遥
本研究以生菜 蕴泽陨悦耘员 低温胁迫转录因子为对象袁
以 栽员 转 蕴泽陨悦耘员 基因水稻株系为材料袁对 蕴泽陨悦耘员 基因
的表达模式尧蕴泽陨悦耘员 基因在 栽员 水稻中整合和表达情况
以及 蕴泽陨悦耘员 基因在水稻中参与调控 韵泽阅耘砸月员 冷反应
通路情况进行了研究袁旨在揭示 蕴泽陨悦耘员 基因的抗寒机
制袁为研究植物抗寒性奠定了基础和进一步利用该基
因改良植物抗寒性提供基因资源袁从而为培育抗寒性
强尧优质的品种提供科学依据遥
员摇 材料和方法
员郾 员摇 材料
生菜 渊 蕴葬糟贼怎糟葬 泽葬贼蚤增葬 蕴援 冤 品种为 晕匀苑园曰 栽员 转
蕴泽陨悦耘员 基因的龙粳 圆源 水稻抗冷株系渊栽员蕴圆尧栽员蕴苑 和栽员蕴员员冤袁是以质粒 责悦粤酝月陨粤员猿园员 原 哉遭蚤鄄造泽陨悦耘员 原 灶燥泽 为
载体袁通过农杆菌介导遗传转化获得的咱员圆暂 遥 总 砸晕粤
提取试剂 栽砸晕扎燥造 为 栽陨粤晕郧耘晕 公司产品袁砸藻葬造 栽蚤皂藻
孕悦砸 砸藻葬早藻灶贼 运蚤贼 和 孕则蚤皂藻杂糟则蚤责贼 员泽贼 杂贼则葬灶凿 糟阅晕粤
杂赠灶贼澡藻泽蚤泽 运蚤贼为 栽葬运葬砸葬公司产品袁潮霉素 月 购自北京
鼎国生物技术有限责任公司袁阅陨郧标记和检测试剂盒尧
源圆源员
摇 员园 期 蕴泽陨悦耘员 基因表达及调控转基因水稻抗冷通路研究
杂交液和尼龙膜均购自 砸燥糟澡藻 公司袁引物由上海生工
生物工程有限公司合成遥
员郾 圆摇 方法
员郾 圆郾 员摇 半定量 砸栽鄄孕悦砸 分析 蕴泽陨悦耘员 基因表达模式摇
将生菜种子灭菌后袁接种到 员 辕 圆 酝杂 培养基上袁圆远益袁
员远澡光照培养遥 提取生长 源 周的健壮幼苗的根尧茎和
叶总 砸晕粤袁反转录成 糟阅晕粤遥 对生长 源 周的健壮幼苗
进行各种胁迫处理院冷处理为将幼苗从 圆远益移入 源益
分别处理 园尧远尧员圆尧员愿尧圆圆尧圆源 和 源愿澡曰干旱处理尧高盐处
理和 粤月粤处理分别采用 苑豫 孕耘郧远园园园尧圆园园皂皂燥造窑蕴 原员
晕葬悦造 处理尧员园园滋皂燥造窑蕴 原员 粤月粤 处理幼苗 园尧远尧员圆尧员愿尧
圆圆尧圆源 和 源愿澡袁提取叶片总 砸晕粤袁 反转录成 糟阅晕粤遥 以
蕴泽葬糟贼蚤灶 基因渊粤再圆远园员远缘冤作为内参袁采用半定量 砸栽鄄
孕悦砸对 蕴泽陨悦耘员 基因在不同时期尧不同部位的表达情况
进行分析遥 蕴泽陨悦耘员 基因扩增引物为院蕴泽陨悦耘员枣院缘忆鄄悦粤鄄
悦粤粤悦悦郧悦悦粤粤栽悦粤悦悦粤栽悦鄄猿忆曰 蕴泽陨悦耘员则院缘忆鄄 栽悦悦粤栽粤郧鄄
郧栽粤粤郧粤粤郧粤栽栽郧鄄猿忆袁扩增片段大小 员怨缘遭责遥 蕴泽葬糟贼蚤灶 基
因扩增引物为院蕴泽糟贼蚤灶枣院缘忆鄄栽粤栽栽郧栽栽郧郧栽粤郧粤悦悦粤悦郧栽鄄
悦粤悦鄄猿忆曰 蕴泽糟贼蚤灶则院 缘忆鄄 粤郧悦粤粤悦粤悦郧郧粤郧悦栽悦郧栽栽郧栽鄄猿忆鄄袁
扩增片段大小 员怨园遭责遥 扩增条件为 怨源益 圆皂蚤灶曰怨源益 猿园
泽袁缘缘益 源缘 泽袁苑圆益 猿园 泽袁猿园 个循环曰苑圆益 员园皂蚤灶遥
员郾 圆郾 圆摇 栽员 水稻潮霉素抗性分析摇 在每个 栽园转基因植
株上随机选取 猿 个穗作为 猿 次重复袁将种子渊栽员 冤灭菌
后袁接种到添加 员园园滋早窑皂蕴 原员潮霉素 月 的 酝杂 培养基
上袁以未转基因植株种子作为对照袁员园凿 统计发芽和未
发芽种子数目袁利用公式 字圆 越 渊∣ 粤 原 猿葬 ∣ 原 圆冤圆 辕 猿
渊粤 垣 葬冤计算 字圆 值遥 粤为发芽的种子数袁葬 为未发芽的
种子数袁阅云 越员袁葬 越 园郾 园缘袁字圆渊园郾 园缘袁 员冤 越 猿郾 愿源遥员郾 圆郾 猿摇 栽员 转基因水稻 杂燥怎贼澡藻则灶 和 晕燥则贼澡藻则灶 杂交摇 选
取 字圆 测验分离比符合 猿颐 员且抗寒性鉴定中存活率较
高的 猿 个转基因株系 栽员蕴圆尧栽员蕴苑 和 栽员蕴员员咱员圆暂 袁提取叶
片总 阅晕粤袁用 杂葬造玉酶切后袁琼脂糖凝胶电泳后固定在
尼龙膜上袁以 阅陨郧 标记和检测试剂盒标记 澡责贼 陨陨 片段
为探针进行 杂燥怎贼澡藻则灶 杂交分析遥 阳性对照为 杂葬造玉酶
切植物表达载体产物袁阴性对照为未转基因水稻遥 以
阅陨郧标记和检测试剂盒标记 蕴泽陨悦耘员 片段作为探针袁提
取水稻总 砸晕粤袁电泳后固定在尼龙膜上袁其余程序按
杂燥怎贼澡藻则灶杂交程序进行 晕燥则贼澡藻则灶杂交分析遥
员郾 圆郾 源摇 转基因水稻冷诱导基因表达分析摇 将外源基
因表达量较高的株系 栽员蕴员员 和未转基因水稻渊宰栽冤幼
苗 源益冷处理 园尧圆源 和 源愿澡 后袁提取总 砸晕粤袁以 韵泽葬糟贼蚤灶
基因渊载员远圆愿园冤作为内参袁利用实时定量 孕悦砸 来分析
水稻冷诱导基因 韵泽阅砸耘月员粤尧韵泽阅砸耘月员月 和 韵泽阅砸耘月员云
的表达情况遥 按照 酝蚤怎则葬 等咱员猿暂方法对基因表达的相
对变化进行定量袁未转基因水稻渊源益处理 园澡冤的基因
转录水平被设定为 员遥 扩增 韵泽阅砸耘月员粤 基因引物为院
韵泽阅砸耘月员粤枣院 缘忆鄄栽郧粤郧栽郧粤悦粤栽郧郧郧悦栽郧郧郧粤悦悦鄄猿忆曰 韵泽鄄
阅砸耘月员粤则院缘忆鄄栽郧郧悦粤栽悦郧郧粤粤郧悦悦粤郧粤粤粤粤郧鄄猿忆袁扩增
片段大小 员愿苑遭责遥 扩增 韵泽阅砸耘月员月 基因引物为院韵泽鄄
阅砸耘月员月枣院 缘忆鄄栽郧悦悦栽悦粤粤悦栽栽悦郧悦悦郧粤悦栽栽悦鄄猿忆曰 韵泽鄄
阅砸耘月员月则院缘忆鄄栽郧郧悦栽栽悦栽栽悦栽栽悦郧栽悦郧悦悦粤栽鄄猿忆袁扩增片
段大小 员愿员遭责遥 扩增 韵泽阅砸耘月员云 基因引物为院 韵泽鄄
阅砸耘月员云枣院 缘忆鄄粤栽悦悦郧悦粤郧郧粤粤郧郧悦粤悦郧粤郧悦鄄猿忆曰 韵泽鄄
阅砸耘月员云则院缘忆鄄栽悦粤栽悦郧栽悦郧栽悦郧栽悦郧粤栽郧郧悦鄄猿忆袁扩增片
段大小 员怨园遭责遥 扩增 韵泽葬糟贼蚤灶 基因引物为院韵泽葬糟贼蚤灶枣院缘忆鄄
郧郧栽悦郧栽粤悦悦悦粤粤郧郧栽粤粤栽郧栽鄄猿忆曰 韵泽葬糟贼蚤灶则院 缘忆鄄栽郧粤粤栽鄄
郧粤郧栽粤粤悦悦粤悦郧悦栽悦悦鄄猿忆袁扩增片段大小 员远远遭责遥 扩增
条件为 怨缘益 猿园 泽曰怨缘益 缘 泽袁远园益 源园 泽袁源园 个循环遥
员郾 圆郾 缘摇 转基因植株农艺性状考察摇 按完全随机试验
设计袁将转基因株系 栽员 与未转基因对照一起种植遥 每
个株系种植 员 个小区袁每个小区 缘 行袁共种 圆缘 株袁田间
管理按一般的大田进行遥 成熟时每个小区随机选取 缘
株袁测定株高袁收获相应单株考察穗长尧每穗实粒数尧结
实率和千粒重农艺性状遥
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 蕴泽陨悦耘员 基因表达模式分析
利用半定量 砸栽鄄孕悦砸 方法分析生菜 蕴泽陨悦耘员 基因
在不同器官和处理条件下的响应模式遥 结果表明袁
蕴泽陨悦耘员 基因在生菜的根尧茎尧叶中均有表达袁根的表达
量较弱袁茎和叶的表达量较强渊图 员 原 粤冤遥 蕴泽陨悦耘员 基
因是冷差异表达基因袁源益处理 员愿澡 表达量达到最高曰
蕴泽陨悦耘员 基因对盐胁迫敏感袁圆园园皂皂燥造窑蕴 原员 晕葬悦造处理 远澡
后袁其表达量急剧上升袁在 员圆澡 表达量达到最高曰
蕴泽陨悦耘员 基因的表达量能被外源 粤月粤上调袁但脱水处理
对 蕴泽陨悦耘员 基因的表达量几乎没有影响袁表明 蕴泽陨悦耘员
基因对脱水胁迫不敏感渊图 员 原 月冤遥
圆郾 圆摇 栽员 水稻潮霉素抗性分析
在以前的研究中我们得到超表达 蕴泽陨悦耘员 基因水
稻株系袁抗寒性鉴定结果表明袁一些转基因株系表现出
明显的抗寒性院与对照相比袁圆益处理 苑圆澡后袁转基因水
稻株系 栽员蕴圆尧栽员蕴苑 和 栽员蕴员员 的存活率分别为 远苑豫 尧苑圆豫和 愿园豫 袁显著高于对照 圆猿豫 的存活率 渊 孕 约
园郾 园缘冤曰此外袁在低温胁迫下袁栽员蕴圆尧栽员蕴苑 和 栽员蕴员员 水稻
株系较未转基因对照的脯氨酸积累速率明显增加袁相
对电导率和丙二醛含量积累速率明显下降咱员圆暂 遥 为了
明确 蕴泽陨悦耘员 基因的分离情况袁利用 字圆 测验检测潮霉
缘圆源员
核摇 农摇 学摇 报 圆苑 卷
摇 摇 摇 摇
注院粤院 组织表达分析曰 月院 冷尧脱水尧氯化钠和脱落酸处理表达分析遥
晕燥贼藻院粤院 栽澡藻 贼蚤泽泽怎藻泽 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 蕴泽陨悦耘员曰 月院 栽澡藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 蕴泽陨悦耘员 葬枣贼藻则 糟燥造凿袁 凿藻澡赠凿则葬贼蚤燥灶袁 晕葬悦造 葬灶凿 粤月粤 贼则藻葬贼皂藻灶贼泽援
图 员摇 蕴泽陨悦耘员 基因表达模式
云蚤早援 员摇 耘曾责则藻泽泽蚤燥灶 责葬贼贼藻则灶泽 燥枣 蕴泽陨悦耘员 早藻灶藻
表 员摇 转基因水稻 栽员 代外源基因分离模式的 字圆 检测
栽葬遭造藻 员摇 字圆 摇 贼藻泽贼 枣燥则 泽藻责葬则葬贼蚤燥灶 皂燥凿藻造 燥枣 藻曾燥早藻灶燥怎泽 早藻灶藻 蚤灶 栽员 早藻灶藻则葬贼蚤燥灶 燥枣 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 则蚤糟藻
转基因株系
栽则葬灶泽早藻灶蚤糟 造蚤灶藻
抗性种子总数
栽燥贼葬造 灶怎皂遭藻则 燥枣 则藻泽蚤泽贼葬灶贼 泽藻藻凿泽
敏感性种子总数
栽燥贼葬造 灶怎皂遭藻则 燥枣 泽藻灶泽蚤贼蚤增藻 泽藻藻凿泽 字圆渊猿颐 员冤
适合性
郧燥燥凿灶藻泽泽 燥枣 枣蚤贼
栽员 蕴圆 员员员 猿圆 园郾 猿怨 匀园
栽员 蕴猿 怨怨 愿 员远郾 远园 匀粤
栽员蕴源 员园愿 猿怨 园郾 员员 匀园
栽员 蕴缘 怨员 源愿 远郾 圆源 匀粤
栽员蕴远 怨愿 源园 园郾 怨苑 匀园
栽员 蕴苑 员园源 源猿 员郾 圆园 匀园
栽员 蕴愿 怨源 源缘 猿郾 远缘 匀园
栽员 蕴怨 愿远 缘缘 员源郾 园圆 匀粤
栽员蕴员园 愿怨 源员 圆郾 远猿 匀园
栽员 蕴员员 愿远 猿怨 圆郾 圆源 匀园
悦运 园 员猿圆
摇 摇 晕燥贼藻院 字圆园郾 园缘 越 猿郾 愿源渊阅云 越 员冤援
素的抗性分离情况遥 结果表明袁员园 个 栽园转基因植株自
交种子 栽员 均发生了潮霉素抗性分离渊表 员冤遥 其中袁栽员蕴猿尧栽员蕴缘 和 栽员蕴怨 植株种子潮霉素抗感分离比均不
符合 猿颐 员袁目的基因可能以非单拷贝尧单位点形式整合
到水稻基因组中曰栽员蕴愿 植株种子潮霉素抗感分离比虽
然符合 猿颐 员袁但其所调查的 猿 个穗有 员 个穗上种子不
符合 猿颐 员袁可能是由于标记基因缺失尧重组以及环境因
素造成的遗传不稳定性遥 其余植株种子潮霉素抗感分
离比符合 猿颐 员袁目的基因可能以单拷贝尧单位点形式整
合到水稻基因组中遥
圆郾 猿摇 栽员 转基因水稻 杂燥怎贼澡藻则灶和 晕燥则贼澡藻则灶杂交检测
选取 字圆 测验分离比符合 猿颐 员且抗寒性鉴定中存活
率较高的 猿 个转基因株系 栽员蕴圆尧栽员蕴苑 和 栽员蕴员员袁提取
基因组 阅晕粤进行 杂燥怎贼澡藻则灶杂交遥 结果显示袁未转基因
对照植株未出现杂交条带袁酶切载体和转基因水稻植
株均出现杂交条带渊图 圆冤袁而且外源基因均是以单拷
贝单位点形式整合袁与 字圆 测验结果完全一致遥 为了检
测 蕴泽陨悦耘员 基因在转基因植株中是否正常表达袁提取 猿
个转基因株系 栽员蕴圆尧栽员蕴苑 和 栽员蕴员员 的水稻总 砸晕粤 进
行 晕燥则贼澡藻则灶杂交遥 结果表明袁非转基因水稻植株没有
远圆源员
摇 员园 期 蕴泽陨悦耘员 基因表达及调控转基因水稻抗冷通路研究
杂交信号产生袁而转基因株系均有特异的杂交信号产
生渊图 猿冤袁表明目的基因 蕴泽陨悦耘员 基因已经整合到水稻
基因组中袁实现了转录遥 蕴泽陨悦耘员 基因的表达在 猿 个 栽员
代转基因水稻株系积累程度不同袁转基因水稻株系
栽员蕴员员 的 蕴泽陨悦耘员 基因的 皂砸晕粤积累水平较高袁推测这
可能是 栽员蕴员员 转基因水稻株系表现较高抗寒性的原
因咱员圆暂 遥
表 圆摇 栽员 转基因水稻的主要农艺性状
栽葬遭造藻 圆摇 酝葬蚤灶 葬早则燥灶燥皂蚤糟 贼则葬蚤贼泽 燥枣 栽员 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 则蚤糟藻
株系
蕴蚤灶藻
株高
孕造葬灶贼 澡藻蚤早澡贼 辕 糟皂
穗长
孕葬灶蚤糟造藻 造藻灶早贼澡 辕 糟皂
每穗实粒数
晕燥援 燥枣 枣蚤造造藻凿 早则葬蚤灶泽 责藻则 责葬灶蚤糟造藻泽
结实率
杂藻藻凿 泽藻贼贼蚤灶早 则葬贼藻 辕 豫
千粒重
员园园园 原 早则葬蚤灶 憎藻蚤早澡贼 辕 早
栽员蕴圆 苑怨援 园 依 源援 猿 葬 员缘援 愿 依 员援 源 葬 愿猿援 园 依 苑援 园 葬 苑圆援 圆 依 愿援 园 葬遭 圆源援 苑 依 员援 员 葬
栽员蕴苑 愿猿援 圆 依 圆援 怨 葬 员远援 苑 依 员援 愿 葬 苑愿援 苑 依 缘援 员 葬 苑缘援 愿 依 远援 怨 葬 圆猿援 愿 依 猿援 圆 葬
栽员蕴员员 愿远援 员 依 猿援 员 葬 员缘援 圆 依 圆援 猿 葬 远圆援 猿 依 员园援 圆 遭 远园援 缘 依 源援 缘 遭 圆圆援 园 依 圆援 源 葬
悦运 愿源援 远 依 缘援 缘 葬 员远援 缘 依 员援 圆 葬 愿猿援 苑 依 缘援 园 葬 愿援 远 依 远援 猿 葬 圆员援 员 依 员援 远 葬
摇 摇 注院小写字母表示多重比较达 缘豫显著的差异水平遥
晕燥贼藻院杂皂葬造造 造藻贼贼藻则泽 蚤灶凿蚤糟葬贼藻 泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼 凿蚤枣枣藻则藻灶糟藻泽 葬贼 园郾 园缘 造藻增藻造援
注院员院 未转化的水稻植株渊阴性对照冤曰 圆院 杂葬造玉酶切质粒产物
渊阳性对照冤曰 猿 耀 缘院 转基因水稻株系 栽员蕴圆尧栽员蕴苑 和 栽员蕴员员遥
晕燥贼藻院员院 晕燥灶鄄贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 则蚤糟藻 责造葬灶贼泽 渊 灶藻早葬贼蚤增藻 糟燥灶贼则燥造冤曰 圆院 杂葬造玉
藻灶扎赠皂藻 糟怎贼贼蚤灶早 责则燥凿怎糟贼 燥枣 责造葬泽皂蚤凿渊 责燥泽蚤贼蚤增藻 糟燥灶贼则燥造冤曰 猿 耀 缘院 栽澡藻
摇 摇 责造葬灶贼泽 燥枣 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 则蚤糟藻 造蚤灶藻泽 栽员 蕴圆袁 栽员 蕴苑袁 栽员蕴员员援
图 圆摇 栽员 代转基因水稻植株的 杂燥怎贼澡藻则灶杂交检测
云蚤早援 圆摇 杂燥怎贼澡藻则灶 遭造燥贼 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 栽员
早藻灶藻则葬贼蚤燥灶 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 则蚤糟藻 造蚤灶藻泽
圆郾 源摇 栽员 代转基因水稻冷反应基因的表达分析
拟南芥 陨悦耘员 是通过调控 悦月云猿 通路来提高拟南
芥抗寒能力咱愿暂 袁而 蕴泽陨悦耘员 基因在保守区域与拟南芥
陨悦耘员 分享较高的相似性咱员圆暂 袁所以推断外源基因
蕴泽陨悦耘员 在转基因水稻中也可能是通过 韵泽阅砸耘月员 途径
来改进转基因水稻抗低温能力的遥 为了证明这一推
测袁提取外源基因表达量较高的株系 栽员蕴员员 和未转基
因水稻植株渊宰栽冤的总 砸晕粤袁利用实时定量 砸栽鄄孕悦砸
注院员院 未转化的水稻植株渊阴性对照冤曰 圆 耀 源院 转基因水稻株系
栽员蕴员员尧栽员 蕴圆 和 栽员蕴苑遥
晕燥贼藻院 员院 晕燥灶鄄贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 则蚤糟藻 责造葬灶贼泽渊灶藻早葬贼蚤增藻 糟燥灶贼则燥造冤曰 圆 耀 源院
栽澡藻 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 则蚤糟藻 造蚤灶藻泽 栽员蕴员员袁 栽员 蕴圆袁 栽员蕴苑援
图 猿摇 栽员 代转基因水稻植株的 晕燥则贼澡藻则灶杂交检测
云蚤早援 猿摇 晕燥则贼澡藻则灶 遭造燥贼 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 栽员
早藻灶藻则葬贼蚤燥灶 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 则蚤糟藻 责造葬灶贼泽
来分析 蕴泽陨悦耘员 基因对水稻冷诱导基因 韵泽阅砸耘月员粤尧
韵泽阅砸耘月员月 和 韵泽阅砸耘月员云 的影响遥 结果表明袁无论是
转基因植株袁还是非转基因植株袁冷处理 圆源澡 和 源愿澡
后袁 韵泽阅砸耘月员粤渊图 源 原 粤冤尧韵泽阅砸耘月员月渊图 源 原 月冤和
韵泽阅砸耘月员云渊图 源 原 悦冤基因的转录水平均被上调袁进一
步证明 韵泽阅砸耘月员粤尧韵泽阅砸耘月员月尧韵泽阅砸耘月员云 基因为冷
诱导基因遥 株系 栽员蕴员员 和未转基因水稻植株间的
韵泽阅砸耘月员月 和 韵泽阅砸耘月员云 基因转录水平差异不明显
渊孕 跃园郾 园缘冤袁但是袁株系 栽员蕴员员 的 韵泽阅砸耘月员粤 基因的转
录水平明显高于未转基因水稻植株渊孕 约 园郾 园缘冤袁表明
蕴泽陨悦耘员 基因对转基因水稻抗寒性的影响是依赖
韵泽阅砸耘月员 冷反应通路的遥
圆郾 缘摇 转基因水稻主要农艺性状考察
为明确 蕴泽陨悦耘员 基因超表达对水稻农艺性状的影
响袁考察了转基因水稻株系与未转基因对照的 缘 个主
要农艺性状 渊表 圆冤遥 结果表明袁转基因株系 栽员蕴圆尧栽员蕴苑 的株高尧穗长尧每穗实粒数尧结实率和千粒重与对
照株系相比袁未发生显著性变化渊孕 跃 园郾 园缘冤遥 转基因
苑圆源员
核摇 农摇 学摇 报 圆苑 卷
图 源摇 冷诱导基因 韵泽阅砸耘月员粤 渊粤冤袁 韵泽阅砸耘月员月 渊月冤和 韵泽阅砸耘月员云 渊悦冤表达分析
云蚤早援 源摇 耘曾责则藻泽泽蚤燥灶 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 糟燥造凿 则藻早怎造葬贼燥则赠 早藻灶藻泽 韵泽阅砸耘月员粤 渊粤冤袁 韵泽阅砸耘月员月 渊月冤 葬灶凿 韵泽阅砸耘月员云 渊悦冤
株系 栽员蕴员员 的每穗实粒数和结实率显著低于对照渊孕约园郾 园缘冤袁而其他农艺性状未发生变化遥
猿摇 讨论
植物遇到非生物胁迫时袁会产生一系列的应答反
应以减轻或消除胁迫造成的危害咱员源暂 遥 胁迫应答基因
一些可以被 粤月粤调控袁而一些不可以被 粤月粤 调控袁说
明胁迫应答基因表达信号传导包括依赖 粤月粤 的信号
转导途径和非依赖 粤月粤 的信号转导途径二种咱圆暂 遥 本
研究中的 蕴泽陨悦耘员 基因表达被 粤月粤 所上调袁表明至少
有一条依赖 粤月粤的信号转导途径参与 蕴泽陨悦耘员 胁迫应
答遥 此外袁蕴泽陨悦耘员 基因为在叶片中表达量最强袁冷和
盐胁迫能上调 蕴泽陨悦耘员 基因表达水平袁这与 悦澡蚤灶灶怎泽葬皂赠
等咱愿暂研究结果极为相似袁为二者在抗冷途径中具有相
似功能提供了理论依据遥
陨悦耘鄄造蚤噪藻基因家族成员广泛存在多种植物中遥 目
前袁在小麦咱怨暂 尧野生稻咱员园暂和杨树咱员缘暂等植物中发现并克
隆了 陨悦耘鄄造蚤噪藻 基因袁这些 陨悦耘鄄造蚤噪藻 基因也具有拟南芥
陨悦耘员 基因类似功能咱怨 原 员园暂 遥 蕴蚤等咱员园暂将从野生稻中分离
的一个 陨悦耘鄄造蚤噪藻 基因 韵则遭匀蕴匀园园员 在拟南芥超表达袁增
强了拟南芥对冰冻和盐胁迫的抵抗能力袁但是
韵则遭匀蕴匀园园员 基因的超表达没有增加拟南芥 悦月云员尧
悦月云圆尧 悦月云猿尧 砸阅圆怨粤 和 悦韵砸源苑 的 超 表 达袁 证 明
韵则遭匀蕴匀园园员 在冷反应通路中的调控作用是不依赖
悦月云 辕 阅砸耘月员 冷反应通路的遥 月葬凿葬憎蚤 等咱怨暂将从小麦中
分离的 陨悦耘鄄造蚤噪藻基因 栽葬陨悦耘源员 和 栽葬陨悦耘愿苑 转入到拟南
芥袁增加了拟南芥中 悦月云 辕 阅砸耘月员 和 悦韵砸 基因的转录
水平袁证明了 栽葬陨悦耘源员 和 栽葬陨悦耘愿苑 在改进拟南芥抗寒
性上是依赖 悦月云 辕 阅砸耘月员 冷反应通路的遥 因此袁可将
陨悦耘员 及 陨悦耘鄄造蚤噪藻基因在转基因植物冷反应通路中的调
控作用可以分为两类院一类是依赖 悦月云 辕 阅砸耘月员 冷反
应通路袁即 陨悦耘员 及 陨悦耘鄄造蚤噪藻 基因作为总开关调控
悦月云 辕 阅砸耘月员 基因超表达袁悦月云 辕 阅砸耘月 转录因子再诱
导与冷有关的功能 悦韵砸 基因表达袁提高植物的抗寒
性曰另一类是不依赖 悦月云 辕 阅砸耘月员 冷反应通路袁即 陨悦耘员
及 陨悦耘鄄造蚤噪藻基因不通过 悦月云 辕 阅砸耘月员 基因的调控作用袁
直接诱导低温应答基因的表达来改进植物的抗寒性遥
潘孝武等咱员远暂 研究表明袁在低温条件下粳稻品种的
韵泽阅砸耘月员 基因表达水平明显低于籼稻品种遥 因此袁通
过外源基因诱导粳稻 韵泽阅砸耘月员 基因过表达袁对于在本
底耐冷性基础上进一步提高粳稻抗低温冷害能力具有
重要意义遥 本研究通过对转 蕴泽陨悦耘员 基因水稻的
韵泽阅砸耘月员 基因表达进行分析表明袁蕴泽陨悦耘员 基因是依赖
韵泽阅砸耘月员粤冷反应通路改进水稻的抗寒能力袁冷胁迫
后袁株系 栽员蕴员员 的 韵泽阅砸耘月员粤 转录水平明显高于未转
基因对照遥
有研究表明袁悦月云 辕 阅砸耘月员 转录因子在组成型强
启动子驱动下在植物中异源超表达袁常温下就会诱导
多个 悦韵砸基因表达袁常常造成转基因植株在正常生长
条件下株型变异和植株矮小咱员苑 原 员愿暂 袁本研究对 猿 个转基
因性状农艺性状考查发现袁过表达 蕴泽陨悦耘员 基因对水稻
株高没有影响渊表 员冤袁可能单个基因的过表达造成植
株能量损失较小袁对植株高度影响甚微袁这与 酝蚤怎则葬咱员猿暂
的研究结果是一致的遥 据此推测 蕴泽陨悦耘员 蛋白活性常
温处于不活跃状态袁以无效激活转录的形式存在袁需在
冷胁迫下经磷酸化尧脱磷酸化尧泛素化或类泛素化等转
录后修饰才具有活性袁诱导下游多个 悦韵砸 基因表达遥
丝氨酸磷酸化或脱磷酸化在激活拟南芥 陨悦耘员 蛋白活
性方面起着重要的作用咱愿暂 遥 蕴泽陨悦耘员 蛋白有 圆缘 个丝氨
酸可能成为磷酸化位点咱员圆暂 袁位置和数目与拟南芥
陨悦耘员 蛋白及其相似袁暗示二者具有相似的磷酸化作
愿圆源员
摇 员园 期 蕴泽陨悦耘员 基因表达及调控转基因水稻抗冷通路研究
用遥 匀韵杂员 泛素 耘猿 连接酶作用于拟南芥 陨悦耘员袁进行蛋
白酶降解袁对 陨悦耘员 活性起到负调控作用咱员怨暂 遥 杂陨在员
杂哉酝韵 耘猿 连接酶对 陨悦耘员 蛋白的 运猿怨猿 氨基酸进行类
泛素化袁抑制 陨悦耘员 降解袁对 陨悦耘员 蛋白活性起到正调控
作用咱员猿暂 遥 蕴泽陨悦耘员 蛋白存在一个潜在的磷酸化位点
渊灾运耘耘冤袁与拟南芥 陨悦耘员 蛋白的磷酸化位点完全一
致袁推测 蕴泽陨悦耘员 蛋白活性在水稻中也被 杂陨在员 杂哉酝韵
耘猿 连接酶管理遥 孕葬则噪等咱圆园暂在水稻中鉴定了 圆 个具有
泛素化功能的 杂陨在员 同源基因渊韵泽杂陨在员 和 韵泽杂陨在圆冤袁
蕴泽陨悦耘员 蛋白活性是否被 韵泽杂陨在员 和 韵泽杂陨在圆 基因所调控
有待近一步的研究遥 蕴泽陨悦耘员 基因的表达分析和其在
转基因水稻中的通路研究为研究 陨悦耘员 原 造蚤噪藻转录因子
提供了素材袁并为进一步研究和应用抗冷水稻品种奠
定了基础遥
参考文献院
咱 员 暂 摇 郧怎赠 悦 蕴援 悦燥造凿 葬糟糟造蚤皂葬贼蚤燥灶 葬灶凿 枣则藻藻扎蚤灶早 泽贼则藻泽泽 贼燥造藻则葬灶糟藻院 砸燥造藻 燥枣
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孕造葬灶贼 酝燥造藻糟怎造葬则 月蚤燥造燥早赠袁 员怨怨园袁 源员院 员愿苑 原 圆圆猿
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蚤灶 葬灶 粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽 贼澡葬造蚤葬灶葬 早藻灶藻 蚤泽 蚤灶增燥造增藻凿 蚤灶 则藻泽责燥灶泽蚤增藻灶藻泽泽 贼燥
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咱 缘 暂 摇 吴关庭袁 郎春秀袁 胡张华袁 陈笑芸袁 王伏林袁 金卫袁 陈锦清援 转
悦月云员 基因增强水稻的耐逆性 咱 允暂 援 核农学报袁 圆园园远袁 圆园 渊猿冤院
员远怨 原 员苑猿
咱 远 暂 摇 韦善君袁孙振元袁巨关升袁韩蕾袁余龙江援 冷诱导基因转录因子
悦月云员 的组成型表达对植物的抗寒性及生长发育的影响 咱 允暂 援
核农学报袁 圆园园缘 袁员怨 渊远冤 院源远缘 原 源远愿
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圆园园远袁 源员院 源员 原 员缘猿
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月蚤燥造燥早赠 砸藻责燥则贼藻则袁 圆园员员袁 圆怨院 缘圆缘 原 缘猿圆
咱员圆暂摇 向殿军袁 殷奎德袁 满丽莉袁 徐正进援 生菜低温胁迫转录因子
蕴泽陨悦耘员 的克隆尧特征分析及其转化水稻 咱 允暂 援 中国农业科学袁
圆园员员袁 源源 渊圆员冤院 源猿源园 原 源猿源怨
咱员猿暂摇 酝蚤怎则葬 运袁 允蚤灶 允 月袁 蕴藻藻 允袁 匀葬泽藻早葬憎葬 孕 酝援 杂陨在员 原 皂藻凿蚤葬贼藻凿
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员源员源
咱员源暂摇 闵东红袁 赵月袁 陈阳袁 徐兆师袁 霍冬英袁 胡笛袁 陈明袁 李连城袁
马有志援 小麦胁迫相关基因 栽葬蕴耘粤蕴猿 的克隆及分子特性分析
咱允暂 援 作物学报袁 圆园员圆袁 猿愿渊员园冤院 员愿源苑 原 员愿缘缘
咱员缘暂摇 林元震袁 张志毅袁 刘纯鑫袁 郭海袁 朱保庆袁 陈晓阳援 甜杨抗冻转
录因子 陨悦耘造基因的 蚤灶 泽蚤造蚤糟燥克隆及其分析 咱允暂 援 分子植物育种袁
圆园园苑袁 缘 渊猿冤院 源圆源 原 源猿园
咱员远暂摇 潘孝武袁 黎用朝袁 李小湘袁 刘文强袁 闵军袁 陆婷婷袁 盛新年袁 谭
江援 悦月云调节子在水稻品种日本晴和 怨猿 原 员员 低温驯化过程中
的差异调控机制 咱允暂 援 中国水稻科学袁 圆园员圆袁 圆远渊缘冤院 缘圆员 原 缘圆愿
咱员苑暂摇 蕴蚤怎 匝袁 运葬泽怎早葬 酝袁 杂葬噪怎皂葬 再袁 粤遭藻 匀袁 酝蚤怎则葬 杂袁 杂澡蚤灶燥扎葬噪蚤 运援 栽憎燥
贼则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶 枣葬糟贼燥则泽袁 阅砸耘月员 葬灶凿 阅砸耘月圆袁 憎蚤贼澡 葬灶凿 耘砸耘月孕 辕 粤孕圆
阅晕粤 遭蚤灶凿蚤灶早 凿燥皂葬蚤灶 泽藻责葬则葬贼藻 贼憎燥 糟藻造造怎造葬则 泽蚤早灶葬造 贼则葬灶泽凿怎糟贼蚤燥灶
责葬贼澡憎葬赠泽 蚤灶 凿则燥怎早澡贼 葬灶凿 造燥憎 贼藻皂责藻则葬贼怎则藻鄄则藻泽责燥灶泽蚤增藻 早藻灶藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶袁
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杂袁 杂藻噪蚤 酝袁 杂澡蚤灶燥扎葬噪蚤 运袁 再葬皂葬早怎糟澡蚤鄄杂澡蚤灶燥扎葬噪蚤 运援 韵泽阅砸耘月 早藻灶藻泽
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皂藻凿蚤葬贼藻泽 贼澡藻 怎遭蚤择怎蚤贼蚤灶葬贼蚤燥灶 葬灶凿 凿藻早则葬凿葬贼蚤燥灶 燥枣 陨悦耘员 咱 允 暂 援
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允袁 再怎灶 阅 允援 云怎灶糟贼蚤燥灶葬造 糟澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 杂陨在 辕 孕陨粤杂鄄贼赠责藻 杂哉酝韵
耘猿 造蚤早葬泽藻泽袁 韵泽杂陨在员 葬灶凿 韵泽杂陨在圆 蚤灶 则蚤糟藻 咱 允 暂 援 孕造葬灶贼 悦藻造造 葬灶凿
耘灶增蚤则燥灶皂藻灶贼袁 圆园员园袁 猿猿院 员怨圆猿 原 员怨猿源
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允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
圆园员猿袁圆苑渊员园冤院员源圆源 耀 员源猿园
耘曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 蕴泽陨悦耘员 郧藻灶藻 葬灶凿 陨贼泽 砸藻早怎造葬贼蚤燥灶 云怎灶糟贼蚤燥灶 燥枣
悦燥造凿 砸藻泽责燥灶泽蚤增藻 杂蚤早灶葬造造蚤灶早 孕葬贼澡憎葬赠 蚤灶 栽则葬灶泽早藻灶蚤糟 砸蚤糟藻
载陨粤晕郧 阅蚤葬灶鄄躁怎灶员袁圆 摇 酝粤晕 蕴蚤鄄造蚤员 摇 在匀粤晕郧 阅蚤员 摇 宰粤晕郧 蕴蚤鄄灶葬猿 摇 再陨晕 运怎蚤鄄凿藻源
杂韵晕郧 匝怎灶鄄赠葬灶源 摇 载哉 在澡藻灶早鄄躁蚤灶圆
渊员 匀藻蚤造燥灶早躁蚤葬灶早 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 耘糟燥灶燥皂赠 孕则燥枣藻泽泽蚤燥灶葬造 悦燥造造藻早藻袁 酝怎凿葬灶躁蚤葬灶早袁 匀藻蚤造燥灶早躁蚤葬灶早摇 员缘苑园源员曰
圆 砸蚤糟藻 陨灶泽贼蚤贼怎贼蚤燥灶 燥枣 杂澡藻灶赠葬灶早 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠 辕 运藻赠 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 燥枣 悦则燥责 孕澡赠泽蚤燥造燥早赠袁 耘糟燥造燥早赠袁 郧藻灶藻贼蚤糟泽 葬灶凿 月则藻藻凿蚤灶早袁
酝蚤灶蚤泽贼则赠 燥枣 粤早则蚤糟怎造贼怎则藻 辕 运藻赠 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 燥枣 晕燥则贼澡藻则灶 允葬责燥灶蚤糟葬 砸蚤糟藻 月则藻藻凿蚤灶早 燥枣 蕴蚤葬燥灶蚤灶早袁 杂澡藻灶赠葬灶早袁 蕴蚤葬燥灶蚤灶早摇 员员园员远员曰
猿 阅葬择蚤灶早 月则葬灶糟澡藻泽 燥枣 匀藻蚤造燥灶早躁蚤葬灶早 粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽袁 阅葬择蚤灶早袁 匀藻蚤造燥灶早躁蚤葬灶早摇 员远猿猿员怨曰
源 杂糟澡燥燥造 燥枣 蕴蚤枣藻 杂糟蚤藻灶糟藻 葬灶凿 月蚤燥贼藻糟澡灶燥造燥早赠袁 匀藻蚤造燥灶早躁蚤葬灶早 月葬赠蚤 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 阅葬择蚤灶早袁 匀藻蚤造燥灶早躁蚤葬灶早摇 员远猿猿员怨冤
粤遭泽贼则葬糟贼院蕴泽陨悦耘员 早藻灶藻袁 葬 糟燥造凿 泽贼则藻泽泽 贼则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶 枣葬糟贼燥则袁 憎葬泽 蚤泽燥造葬贼藻凿 枣则燥皂 造藻贼贼怎糟藻袁 葬灶凿 燥增藻则藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 蕴泽陨悦耘员 早藻灶藻
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藻曾葬皂蚤灶藻凿 贼蚤泽泽怎藻泽袁 泽怎糟澡 葬泽 贼澡藻 则燥燥贼泽袁 泽贼藻皂泽 葬灶凿 造藻葬增藻泽袁 葬灶凿 蕴泽陨悦耘员 早藻灶藻 皂砸晕粤 造藻增藻造泽 憎藻则藻 凿燥皂蚤灶葬灶贼 蚤灶 造藻葬增藻泽 燥枣 造藻贼贼怎糟藻
泽藻藻凿造蚤灶早援 栽澡藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 造藻增藻造泽 燥枣 蕴泽陨悦耘员 憎藻则藻 怎责则藻早怎造葬贼藻凿 遭赠 糟燥造凿袁 粤月粤袁 晕葬悦造 贼则藻葬贼皂藻灶贼泽袁 遭怎贼 灶燥贼 遭赠 贼澡藻 凿藻澡赠凿则葬贼蚤燥灶
贼则藻葬贼皂藻灶贼援 字圆 贼藻泽贼 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 栽员 则蚤糟藻 责造葬灶贼泽 责则藻泽藻灶贼藻凿 澡赠早则燥皂赠糟蚤灶 则藻泽蚤泽贼葬灶贼 泽藻早则藻早葬贼蚤燥灶 皂燥凿藻造 枣燥则 猿院员则葬贼蚤燥袁 泽怎早早藻泽贼蚤灶早 贼澡葬贼 蕴泽陨悦耘员 早藻灶藻 憎葬泽 蚤灶贼藻早则葬贼藻凿 蚤灶贼燥 贼澡藻 早藻灶燥皂藻 燥枣 皂燥泽贼 燥枣 栽园 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽 遭赠 泽蚤灶早造藻 糟燥责赠 皂燥凿藻援栽澡藻 杂燥怎贼澡藻则灶 葬灶凿 晕燥则贼澡藻则灶 遭造燥贼 葬灶葬造赠泽蚤泽藻泽 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 蕴泽陨悦耘员 早藻灶藻 澡葬凿 遭藻藻灶 蚤灶贼藻早则葬贼藻凿 蚤灶贼燥 贼澡藻 早藻灶燥皂藻 燥枣 贼澡则藻藻 糟燥造凿鄄
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韵泽阅砸耘月员 糟燥造凿 则藻泽责燥灶泽蚤增藻 泽蚤早灶葬造造蚤灶早 责葬贼澡憎葬赠 蚤灶 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 则蚤糟藻援
运藻赠 憎燥则凿泽院砸蚤糟藻曰 蕴泽陨悦耘员 早藻灶藻曰 耘曾责则藻泽泽蚤燥灶 葬灶葬造赠泽蚤泽曰 悦燥造凿 泽贼则藻泽泽曰 悦燥造凿 则藻早怎造葬贼燥则赠 早藻灶藻泽
园猿源员