全 文 ：摇 核 农 学 报摇 圆园员圆袁圆远渊远冤院园愿苑猿 耀 园愿苑愿允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
收稿日期院圆园员圆鄄园源鄄圆源摇 接受日期院圆园员圆鄄园苑鄄圆源
基金项目院国家自然科学基金项目渊猿员园远园员怨源冤袁内蒙古自然科学基金项目渊圆园员员酝杂园缘员圆冤袁内蒙古自治区高等学校科学研究项目渊晕允在再员员圆园员冤
作者简介院刘摇 鹏渊员怨苑猿鄄冤袁男袁蒙古族袁内蒙古赤峰人袁副教授袁博士袁主要从事分子生物学研究遥 栽藻造院园源苑缘鄄愿猿员源愿园怨曰耘鄄皂葬蚤造院皂蚤灶凿葬造蚤怎责藻灶早岳员圆远援 糟燥皂
通讯作者院陈永胜渊员怨苑员鄄冤袁男袁蒙古族袁内蒙古通辽人袁教授袁博士袁主要从事分子生物学研究遥 栽藻造院园源苑缘鄄愿猿员源远远愿曰耘鄄皂葬蚤造院糟澡藻灶赠泽圆园园园岳 员远猿援 糟燥皂
文章编号院员园园园鄄愿缘缘员渊圆园员圆冤园远鄄园愿苑猿鄄园远
蓖麻细胞色素 孕源缘园基因片段的克隆
及 砸晕粤蚤表达载体的构建
刘摇 鹏员袁圆袁源 摇 张立军员 摇 张春兰猿 摇 栾世慧圆 摇 黄凤兰猿袁源 摇 陈永胜猿袁源
渊员援沈阳农业大学生物科学技术学院袁辽宁 沈阳摇 员员园愿远远曰圆援内蒙古民族大学农学院袁内蒙古 通辽摇 园圆愿园源圆曰
猿援内蒙古民族大学生命科学学院袁内蒙古 通辽摇 园圆愿园源圆曰源援内蒙古自治区高校蓖麻产业工程技术研究中心袁内蒙古 通辽摇 园圆愿园源圆冤
摘摇 要院采用 孕悦砸方法克隆了蓖麻细胞色素 孕源缘园 基因的正反 圆 个片段遥 正向片段长为 缘圆缘 个碱基袁反
向片段长为 源圆员 个碱基遥 经测序分析袁得到的正向基因片段和反向基因片段与 郧藻灶月葬灶噪 上的蓖麻细胞
色素 孕源缘园 基因渊载酝赃园园圆缘圆缘愿远猿郾 员冤的碱基同源性分别为 怨愿郾 愿缘豫和 怨怨郾 缘员豫 遥 利用载体 责匀粤晕晕陨月粤蕴
和限制性内切酶将正反 圆 个片段连接成具有发夹结构的中间载体 责匀粤晕鄄孕源缘园杂鄄孕源缘园粤袁然后将中间载
体和表达载体 责月陨鄄员圆员 连接袁构建了 孕源缘园 基因的 砸晕粤蚤植物表达载体袁为利用 砸晕粤干扰抑制 孕源缘园 基因
表达的研究奠定了基础遥
关键词院蓖麻曰孕源缘园曰砸晕粤蚤曰载体构建
悦蕴韵晕陨晕郧 韵云 悦再栽韵悦匀砸韵酝耘 孕粤砸栽陨粤蕴 孕源缘园 郧耘晕耘 云砸韵酝
悦粤杂栽韵砸渊砸蚤糟蚤灶怎泽 悦燥皂皂怎灶蚤泽 蕴援 冤 粤晕阅 悦韵晕杂栽砸哉悦栽陨韵晕 韵云 砸晕粤蚤 灾耘悦栽韵砸
蕴陨哉 孕藻灶早员袁圆袁源 摇 在匀粤晕郧 蕴蚤鄄躁怎灶员 摇 在匀粤晕郧 悦澡怎灶鄄造葬灶猿 摇 蕴哉粤晕 杂澡蚤鄄澡怎蚤圆 摇 匀哉粤晕郧 云藻灶早鄄造葬灶猿袁源 摇 悦匀耘晕 再燥灶早鄄泽澡藻灶早猿
渊员援 悦燥造造藻早藻 燥枣 月蚤燥造燥早蚤糟葬造 杂糟蚤藻灶糟藻 葬灶凿 栽藻糟澡灶燥造燥早赠袁杂澡藻灶赠葬灶早 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁杂澡藻灶赠葬灶早袁 蕴蚤葬燥灶蚤灶早摇 员员园愿远远曰
圆援 悦燥造造藻早藻 燥枣 粤早则蚤糟怎造贼怎则藻袁 陨灶灶藻则 酝燥灶早燥造蚤葬 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠 枣燥则 晕葬贼蚤燥灶葬造蚤贼蚤藻泽袁 栽燥灶早造蚤葬燥袁 陨灶灶藻则 酝燥灶早燥造蚤葬摇 园圆愿园源圆曰
猿援 杂糟澡燥燥造 燥枣 蕴蚤枣藻 杂糟蚤藻灶糟藻袁 陨灶灶藻则 酝燥灶早燥造蚤葬 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠 枣燥则 晕葬贼蚤燥灶葬造蚤贼蚤藻泽袁 栽燥灶早造蚤葬燥袁 陨灶灶藻则 酝燥灶早燥造蚤葬摇 园圆愿园源圆曰
源援 耘灶早蚤灶藻藻则蚤灶早 砸藻泽藻葬则糟澡 悦藻灶贼藻则 燥枣 悦葬泽贼燥则 葬贼 哉灶蚤增藻则泽蚤贼蚤藻泽 燥枣 陨灶灶藻则 酝燥早燥造蚤葬 粤怎贼燥灶燥皂燥灶泽袁栽燥灶早造蚤葬燥袁 陨灶灶藻则 酝燥灶早燥造蚤葬摇 园圆愿园源圆冤
粤遭泽贼则葬糟贼院杂藻灶泽藻 葬灶凿 葬灶贼蚤鄄泽藻灶泽藻 枣则葬早皂藻灶贼泽 燥枣 糟葬泽贼燥则 糟赠贼燥糟澡则燥皂藻 孕源缘园 憎藻则藻 糟造燥灶藻凿 遭赠 孕悦砸援 粤 缘圆缘遭责 泽藻灶泽藻 枣则葬早皂藻灶贼 葬灶凿
葬 源圆员遭责 葬灶贼蚤鄄泽藻灶泽藻 枣则葬早皂藻灶贼 憎藻则藻 燥遭贼葬蚤灶藻凿袁 憎澡蚤糟澡 澡葬凿 葬 澡燥皂燥造燥早赠 燥枣 怨愿郾 愿缘豫 葬灶凿 怨怨郾 缘员豫 憎蚤贼澡 贼澡藻 燥则蚤早蚤灶葬造 泽藻择怎藻灶糟藻袁
则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠援 粤灶 蚤灶贼藻则皂藻凿蚤葬贼藻 增藻糟贼燥则 责匀粤晕鄄孕源缘园杂鄄孕源缘园粤 憎蚤贼澡 澡葬蚤则责蚤灶 泽贼则怎糟贼怎则藻 憎葬泽 糟燥灶泽贼则怎糟贼藻凿袁 憎澡蚤糟澡 憎葬泽
泽怎遭泽藻择怎藻灶贼造赠 凿蚤早藻泽贼藻凿 憎蚤贼澡 则藻泽贼则蚤糟贼蚤燥灶 藻灶扎赠皂藻袁 葬灶凿 憎葬泽 造蚤早葬贼藻凿 蚤灶贼燥 贼澡藻 责月陨鄄员圆员 增藻糟贼燥则袁 责则燥凿怎糟蚤灶早 贼澡藻 枣蚤灶葬造 责造葬灶贼
藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 增藻糟贼燥则援 栽澡蚤泽 则藻泽怎造贼 责则燥增蚤凿藻凿 葬 枣燥怎灶凿葬贼蚤燥灶 枣燥则 枣怎则贼澡藻则 则藻泽藻葬则糟澡 燥枣 孕源缘园 早藻灶藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 遭赠 砸晕粤 蚤灶贼藻则枣藻则藻灶糟藻
贼藻糟澡灶燥造燥早赠援
运藻赠 憎燥则凿泽院糟葬泽贼燥则曰 糟赠贼燥糟澡则燥皂藻 孕源缘园曰 砸晕粤蚤曰 糟燥灶泽贼则怎糟贼蚤燥灶 燥枣 增藻糟贼燥则
摇 摇 蓖麻渊砸蚤糟蚤灶怎泽 糟燥皂皂怎灶蚤泽 蕴援 冤为大戟科蓖麻属一年
或多年生草本植物袁是重要的油料作物和能源作物遥
据全国蓖麻年会报道袁圆园员员 年中国收获的蓖麻籽仅 猿园
万吨左右袁远远不能满足蓖麻加工企业的需求遥 目前袁
影响农户种植蓖麻积极性的主要因素是单位面积产量
低和不适于机械化收获袁就育种角度而言袁培育矮化蓖
麻品种有希望解决这 圆 个瓶颈问题遥
引起植物矮化的因素很多袁植物激素如赤霉素尧油
菜素内酯的生物合成或信号转导途径受阻均会导致植
物矮化遥 细胞色素 孕源缘园 渊 糟赠贼燥糟澡则燥皂藻 孕源缘园冤基因广泛
猿苑愿
核摇 农摇 学摇 报 圆远 卷
存在于动物尧植物尧细菌尧真菌等细胞内咱员暂 袁参与包括
赤霉素和油菜素内酯等植物生长调节物质的生物合
成袁许多植物 孕源缘园 基因突变体导致赤霉素和油菜素
内酯生物合成受阻袁植株矮化咱圆 耀 缘暂 遥 由此推测蓖麻细
胞色素 孕源缘园 在调控蓖麻株高上可能也发挥了重要作
用遥 但迄今为止尚未见 孕源缘园 基因与蓖麻株高之间的
研究报道遥
砸晕粤干扰渊砸晕粤蚤冤技术是通过导入双链 砸晕粤 袁特
异性地降解相应序列的靶 皂砸晕粤袁从而阻断相应基因
的表达遥 在植物中袁砸晕粤蚤技术主要应用于改良作物的
产量和品质咱远 耀 员园暂 遥 本研究根据 砸晕粤蚤技术的原理合成
孕源缘园 基因片段袁 构建其对应的 砸晕粤蚤 表达载体袁以为
特异性阻断该基因表达尧得到 孕源缘园 基因沉默突变体
和确定该基因在蓖麻中的功能奠定基础遥
员摇 材料与方法
员郾 员摇 材料
员郾 员郾 员摇 菌种和质粒 摇 菌种院 大肠杆菌 渊耘泽糟澡藻则蚤糟澡葬
糟燥造蚤冤 允酝员园怨尧根癌农杆菌渊 粤早则燥遭葬糟贼藻则蚤怎皂 贼怎皂藻枣葬糟蚤藻灶泽冤
蕴月粤源源园源 由本实验室保存曰克隆载体院 责郧耘酝 鄄 栽 耘葬泽赠
灾藻糟贼燥则袁 购自 孕则燥皂藻早葬公司曰表达载体质粒 责月陨鄄员圆员尧中
间载体 责匀粤晕晕陨月粤蕴质粒由本实验室保存遥
员郾 员郾 圆摇 试剂摇 蕴粤 栽葬择 阅晕粤 聚合酶袁阅晕粤 酝葬则噪藻则袁限
制性内切酶 载遭葬 陨尧运责灶 陨尧杂葬糟 陨尧匀葬灶凿芋袁 栽源 阅晕粤连接
酶等购于 栽葬运葬砸葬 公司曰琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒
购于北京博迈德科技发展有限公司曰质粒提取试剂盒
购于北京索莱宝科技有限公司遥
员郾 圆摇 方法
员郾 圆郾 员摇 引物设计与合成摇 根据基因的序列同源性尧基
因内部限制性酶切位点尧克隆载体 责郧耘酝鄄栽 耘葬泽赠
灾藻糟贼燥则和表达载体 责月陨鄄员圆员 质粒上的多克隆位点及
砸晕粤蚤技术的原理设计 源 条引物袁分别在它们的 缘忆端引
入 杂葬糟 陨尧运责灶 陨尧载遭葬 陨和 匀蚤灶凿 陨陨陨 酶切位点袁正反向引物
序列如下院
孕源缘园 正向 上游引物摇 缘忆鄄郧郧郧粤郧悦栽悦渊杂葬糟 陨酶切位点冤葬早葬早葬早葬葬早早早糟葬贼糟葬葬葬葬鄄猿忆下游引物摇 缘忆鄄郧郧郧郧栽粤悦悦渊运责灶 陨酶切位点冤糟糟糟贼糟糟葬葬葬葬葬贼早葬鄄猿忆{
孕源缘园 反向 上游引物摇 缘忆鄄郧郧栽悦栽粤郧粤渊载遭葬 陨酶切位点冤葬早葬葬早早早糟葬贼糟葬葬葬葬早葬葬葬鄄猿忆下游引物摇 缘忆鄄郧郧粤粤郧悦栽栽渊匀蚤灶凿 陨陨陨酶切位点冤糟贼葬早贼葬贼葬葬葬糟葬贼葬早葬贼贼糟贼糟糟鄄猿忆{
摇 摇 同时设计 苑 对引物袁上游引物分别命名为 云员尧云圆尧云猿尧云源尧云缘尧云远尧云苑袁下游引物分别命名为 砸员尧砸圆尧砸猿尧砸源尧砸缘尧砸远尧砸苑袁云员 猿爷端和 云圆 缘爷端有 圆园 个碱基重叠袁砸员 猿爷
端和 砸圆 缘爷端有 圆园 个碱基重叠袁以此类推遥 苑 对引物
碱基序列如下院
云员院 早早早早早葬早糟贼糟葬早葬早葬早葬葬早早早糟葬贼糟葬葬葬葬早葬葬葬糟糟糟葬贼葬葬葬早葬糟葬贼早糟贼贼早早贼
砸员院 早早早早早早贼葬糟糟糟糟糟贼糟糟葬葬葬葬葬贼早葬葬早葬早葬贼葬早贼贼贼贼早葬早葬糟贼糟糟葬葬葬糟贼贼糟贼葬贼
云圆院 糟糟糟葬贼葬葬葬早葬糟葬贼早糟贼贼早早贼贼早糟糟贼糟葬贼早葬葬葬葬糟贼早葬贼早葬葬葬葬糟葬早葬贼葬糟葬葬葬糟贼糟葬葬
砸圆院 贼贼早葬早葬糟贼糟糟葬葬葬糟贼贼糟贼葬贼糟糟葬贼糟糟葬贼糟贼糟糟葬贼早早早贼贼早葬葬葬早葬糟葬葬贼早早葬贼糟贼早早早
云猿院 早葬葬葬葬糟葬早葬贼葬糟葬葬葬糟贼糟葬葬贼早葬贼早葬贼早葬早葬贼葬葬贼贼早葬贼糟葬葬葬贼糟葬贼糟葬糟葬葬贼贼贼贼葬贼
砸猿院 贼早葬葬葬早葬糟葬葬贼早早葬贼糟贼早早早贼葬糟葬葬早贼葬早早早葬贼糟葬贼葬早贼贼贼葬贼糟贼糟糟糟贼葬早贼葬贼葬葬葬糟
云源院 贼糟葬葬葬贼糟葬贼糟葬糟葬葬贼贼贼贼葬贼葬贼贼糟贼早早早贼葬糟早葬葬葬糟葬早贼糟贼糟葬葬糟葬葬糟贼贼糟葬葬贼早葬贼早
砸源院 贼贼贼葬贼糟贼糟糟糟贼葬早贼葬贼葬葬葬糟葬贼葬早葬贼贼糟贼糟糟葬贼糟糟贼贼糟葬早早葬葬贼糟葬糟葬葬葬贼糟糟葬贼贼贼葬
云缘院 贼糟贼糟葬葬糟葬葬糟贼贼糟葬葬贼早葬贼早早糟贼葬贼贼葬葬早贼葬贼贼贼早糟葬贼早葬贼糟葬糟糟糟贼糟葬葬葬贼糟糟贼贼糟葬
砸缘院 葬早早葬葬贼糟葬糟葬葬葬贼糟糟葬贼贼贼葬贼贼贼糟糟葬贼贼贼糟贼贼贼葬早贼葬早贼糟贼贼贼糟贼糟葬早葬葬糟糟糟糟葬贼贼葬
云远院 早葬贼糟葬糟糟糟贼糟葬葬葬贼糟糟贼贼糟葬葬早葬葬糟贼葬葬早葬葬葬葬早葬葬糟葬贼贼贼葬早糟葬葬贼贼葬早葬早葬葬葬葬早葬
砸远院 贼糟贼贼贼糟贼糟葬早葬葬糟糟糟糟葬贼贼葬葬糟贼葬贼贼早贼葬早糟贼葬葬贼糟贼贼早葬早早贼糟贼糟葬葬葬葬葬贼糟葬糟糟早糟
云苑院 贼贼贼葬早糟葬葬贼贼葬早葬早葬葬葬葬早葬葬葬葬贼早糟糟贼早葬早早葬贼糟糟葬葬贼贼葬葬糟贼贼葬葬葬糟早葬糟糟贼贼葬葬葬
砸苑院 早葬早早贼糟贼糟葬葬葬葬葬贼糟葬糟糟早糟葬糟早葬早贼葬葬葬葬糟葬糟葬贼糟早葬贼贼贼葬葬早早贼糟早贼贼贼葬葬早贼贼葬葬
源苑愿
摇 远 期 蓖麻细胞色素 孕源缘园 基因片段的克隆及 砸晕粤蚤表达载体的构建
摇 摇 上述 员愿 条引物在北京六合华大基因科技股份有
限公司合成遥
员郾 圆郾 圆摇 目的基因片段的 孕悦砸扩增摇 在离心管中分别加
入 员园 伊 蕴粤 孕悦砸 月怎枣枣藻则渊酝早圆 垣 孕造怎泽冤圆园滋造袁凿晕栽孕 酝蚤曾贼怎则藻
愿滋造袁 孕则蚤皂藻则 云 方向渊圆园责皂燥造 辕 滋造冤各 员滋造袁孕则蚤皂藻则 砸 方向
渊圆园责皂燥造 辕 滋造冤各员滋造袁蕴粤 栽葬择渊缘哉 辕 滋造冤员滋造袁凿凿匀圆韵 缘苑滋造袁反
应总体积 员园园滋造遥 将上述离心管 怨源益反应缘皂蚤灶后 员园皂蚤灶
内缓慢降温到 缘缘益袁再 缘缘益反应 缘皂蚤灶遥 反应后得到的
产物即为后续 孕悦砸反应的模板 阅晕粤遥
孕悦砸扩增时采用 孕源缘园 正向及反向上游引物和下
游引物遥 反应总体积 缘园滋造 咱员园 伊 蕴粤 孕悦砸 月怎枣枣藻则渊酝早圆 垣
孕造怎泽冤缘滋造袁凿晕栽孕 酝蚤曾贼怎则藻 愿滋造袁 孕源缘园 正向及反向上游引
物和下游引物渊员园责皂燥造 辕 滋造冤各 员滋造袁模板 阅晕粤 源滋造袁蕴粤
栽葬择渊缘哉 辕 滋造冤园郾 缘滋造袁凿凿匀圆韵 猿园郾 缘滋造暂遥 反应条件院 怨源益员皂蚤灶曰怨源益 猿园泽袁源愿益 员皂蚤灶袁苑圆益 缘皂蚤灶袁 猿园 个循环曰
苑圆益延伸 苑皂蚤灶后 源益保存遥 扩增完毕后 员豫琼脂糖凝
胶电泳检测遥
员郾 圆郾 猿摇 孕悦砸 产物序列测定摇 孕悦砸 产物经琼脂糖凝胶
回收试剂盒回收纯化后袁与克隆载体 责郧耘酝鄄栽 耘葬泽赠
灾藻糟贼燥则 连接袁利用热激法将连接产物转化大肠杆菌
允酝员园怨 感受态细胞袁均匀涂布于含 粤皂责尧陨孕栽郧尧载鄄郧葬造
的 蕴月培养基上培养 员远澡 后进行蓝白斑筛选袁挑取阳
性克隆于 缘园皂造 蕴月液体培养基中恒温振荡培养至适宜
菌液浓度后进行菌液 孕悦砸鉴定袁同时提取阳性克隆菌
液的质粒袁正向重组质粒利用 运责灶 陨 和 杂葬糟 陨双酶切鉴
定袁反向重组质粒采用 载遭葬 陨 和 匀葬灶凿 芋双酶切鉴定遥
将鉴定的正向及反向片段阳性克隆分别命名为 孕源缘园杂
和 孕源缘园粤遥 测序工作由北京六合华大基因科技股份有
限公司完成遥
员郾 圆郾 源摇 中间载体的构建 摇 将载体 责匀粤晕晕陨月粤蕴 质粒
用 杂葬糟 陨和 运责灶 陨进行双酶切袁回收 责匀粤晕晕陨月粤蕴片段袁
利用 栽源 阅晕粤 连接酶将 孕源缘园杂 和 责匀粤晕晕陨月粤蕴 片段员远益过夜连接遥 连接反应体系如下院圆 伊 砸葬责蚤凿 蕴蚤早葬贼蚤燥灶
月怎枣枣藻则 圆滋造袁 孕澡葬灶灶蚤遭葬造 载体片段 员滋造袁 孕源缘园杂 远滋造袁 栽源
阅晕粤 蕴蚤早葬泽藻渊猿 哉 辕 滋造冤员滋造袁反应总体积 员园滋造遥 重组之后
的质粒命名为 责匀粤晕鄄孕源缘园杂遥 然后对 责匀粤晕鄄 孕源缘园杂 质
粒用 载遭葬 陨和 匀蚤灶凿 陨陨陨 进行双酶切袁回收 责匀粤晕鄄孕源缘园杂
片段袁利用 栽源 阅晕粤 连接酶将 孕源缘园粤 和 责匀粤晕鄄孕源缘园杂
片段 员远益过夜连接遥 连接反应体系如下院圆 伊 砸葬责蚤凿
蕴蚤早葬贼蚤燥灶 月怎枣枣藻则 圆滋造袁责匀粤晕鄄孕源缘园杂片段 圆滋造袁孕源缘园粤 缘滋造袁
栽源 阅晕粤 蕴蚤早葬泽藻渊猿 哉 辕 滋造冤员滋造袁反应总体积 员园滋造遥 重组
后的质粒命名为 责匀粤晕鄄孕源缘园杂鄄孕源缘园粤遥 利用酶切鉴定
重组质粒遥
员郾 圆郾 缘摇 砸晕粤蚤表达载体的构建摇 本实验室保存的表达
载体 责月陨鄄员圆员 质粒用 杂葬糟 陨 和 载遭葬 陨 进行双酶切处理袁
回收 责月陨鄄员圆员 质粒大片段袁利用 栽源 阅晕粤连接酶将回收
的 责月陨鄄员圆员 质粒大片段和中间载体 责匀粤晕鄄孕源缘园杂鄄
孕源缘园粤 员远益过夜连接遥 连接反应体系如下院圆 伊 砸葬责蚤凿
蕴蚤早葬贼蚤燥灶 月怎枣枣藻则 猿滋造袁责匀粤晕鄄孕源缘园杂鄄孕源缘园粤 源滋造袁 责月陨鄄员圆员
圆滋造袁栽源 阅晕粤 蕴蚤早葬泽藻渊猿哉 辕 滋造冤员滋造袁反应总体积 员园滋造遥 构
建好的 砸晕粤蚤 表达载体命名为 责月陨鄄孕源缘园鄄砸晕粤蚤遥 利用
载遭葬 陨和 杂葬糟 陨双酶切鉴定重组质粒遥
员郾 圆郾 远摇 转基因工程菌液的制备摇 提取 载遭葬 陨 和 杂葬糟 陨
酶切鉴定为阳性的 责月陨鄄孕源缘园鄄砸晕粤蚤 质粒袁利用冻融法
将 责月陨鄄孕源缘园鄄砸晕粤蚤 表达载体质粒转化到农杆菌菌株
蕴月粤源源园源 感受态细胞中袁获得用于转基因操作的农杆
菌菌液遥
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 孕源缘园 正反向片段的克隆与序列分析
蓖麻 孕源缘园 正反向片段电泳结果见图 员袁以 孕源缘园
正向上下游引物扩增出的目的条带大小为 缘猿怨遭责袁以
孕源缘园 反向上下游引物扩增出的目的条带大小为
源圆苑遭责袁扩增长度与设计相符遥
图 员摇 孕源缘园杂和 孕源缘园粤 孕悦砸结果
云蚤早援 员摇 孕悦砸 则藻泽怎造贼泽 燥枣 孕源缘园杂 葬灶凿 孕源缘园粤
酝院阅晕粤分子标记曰员院正向片段产物曰圆院反向片段产物
酝院阅晕粤 酝葬噪藻则曰员院泽藻灶泽藻 枣则葬早皂藻灶贼曰圆院葬灶贼蚤鄄泽藻灶泽藻 枣则葬早皂藻灶贼
菌液的测序结果经 阅晕粤酝粤晕比对分析表明院本研
究所克隆的 孕源缘园杂 和 孕源缘园粤 与 郧藻灶月葬灶噪 渊 载酝 赃
园园圆缘圆缘愿远猿郾 员冤 上的蓖麻 孕源缘园杂 和 孕源缘园粤 分别有
怨愿郾 愿缘豫和 怨怨郾 缘员豫的同源性袁证明所克隆的序列是正
确的遥 正义序列中包含反义序列袁正反义片段序列相
同的部分转录后可形成发夹结构遥 正义片段和反义片
段的核苷酸序列如下院
摇 摇 孕源缘园杂核苷酸序列院
缘苑愿
核摇 农摇 学摇 报 圆远 卷
摇 摇 粤郧粤郧粤郧粤粤郧郧郧悦粤栽悦粤粤粤援 郧粤粤粤悦悦悦粤栽粤粤粤郧粤悦粤栽郧悦栽栽郧郧栽栽郧悦悦栽悦粤栽郧粤粤粤粤悦栽郧粤栽郧粤粤粤粤悦粤郧粤栽粤悦鄄
粤粤粤悦栽悦粤粤栽郧粤栽郧粤栽郧粤郧粤栽粤粤栽栽郧粤栽悦粤粤粤栽悦粤栽悦粤悦粤粤栽栽栽栽粤栽粤栽栽悦栽郧郧郧栽粤悦郧粤粤粤悦粤郧栽悦栽悦粤粤悦粤粤悦栽栽悦粤鄄
粤栽郧粤栽郧郧悦栽粤栽栽粤粤郧栽粤栽栽栽郧悦粤栽郧粤援 悦粤悦悦悦栽悦粤粤粤栽悦悦栽栽悦粤粤郧粤粤悦栽粤粤郧粤粤粤粤郧粤粤悦粤郧栽栽粤郧悦粤粤栽栽粤郧粤郧粤鄄
粤粤粤郧粤粤粤粤栽郧悦悦栽郧粤郧郧粤栽悦悦粤粤栽栽粤粤悦栽栽粤粤粤悦郧粤悦栽栽援 援 粤粤粤栽郧粤栽郧栽郧栽栽栽栽粤悦栽悦郧栽郧悦郧郧栽郧粤栽栽栽栽栽郧粤郧粤悦鄄
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悦栽郧粤粤郧郧粤栽郧郧粤郧粤粤栽悦栽粤栽郧栽栽栽粤栽粤悦栽粤郧郧郧粤郧粤栽粤粤粤悦栽粤栽郧粤栽悦悦悦栽粤悦栽栽郧栽粤悦悦悦粤郧粤栽悦悦粤栽栽郧栽悦栽栽栽悦粤鄄
粤悦悦悦援 栽郧郧粤郧粤栽郧郧粤栽郧郧粤栽粤郧粤粤郧栽栽栽郧郧粤郧栽悦栽悦粤粤粤粤悦栽粤栽悦栽悦栽栽悦粤栽栽栽栽栽郧郧粤郧郧郧
孕源缘园粤核苷酸序列院
悦栽粤郧栽粤栽粤粤粤悦粤栽粤郧粤栽栽悦栽悦悦粤栽悦悦栽栽悦粤郧郧粤粤栽悦粤悦粤粤粤栽悦悦粤栽栽栽粤栽栽栽悦悦粤栽栽栽悦栽栽栽粤郧栽粤郧栽悦栽栽栽悦栽悦粤鄄
郧粤粤悦悦悦悦粤栽栽粤粤悦栽粤栽栽郧栽粤郧悦栽粤粤栽悦栽栽郧粤郧郧栽悦栽悦粤粤粤粤粤栽悦粤悦悦郧悦粤悦郧粤郧栽粤粤粤粤悦粤悦粤栽悦郧粤栽栽栽粤粤郧郧栽悦郧栽鄄
栽栽粤粤郧栽栽粤粤栽栽郧郧葬栽悦悦栽悦粤郧郧悦粤栽栽栽栽悦栽栽栽栽悦栽悦栽粤粤栽栽郧悦栽粤粤粤栽郧栽栽悦栽栽栽栽悦栽栽粤郧栽栽悦栽栽郧粤粤郧郧粤栽栽栽郧粤郧郧郧栽鄄
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图 圆摇 责月陨鄄孕源缘园鄄砸晕粤蚤载体构建流程及验证
云蚤早援 圆摇 悦燥灶泽贼则怎糟贼蚤燥灶 葬灶凿 增藻则蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 责月陨鄄孕源缘园鄄砸晕粤蚤 增藻糟贼燥则
粤院责匀粤晕鄄孕源缘园杂质粒双酶切检测曰月院责匀粤晕鄄孕源缘园杂鄄孕源缘园粤 质粒 孕悦砸 检测曰悦院责匀粤晕鄄 孕源缘园杂鄄孕源缘园粤 质粒双酶切检测曰阅院双酶切检测 责月陨鄄
孕源缘园鄄砸晕粤蚤质粒曰耘院责月陨鄄孕源缘园鄄砸晕粤蚤载体质粒的检测遥 酝院阅晕粤标准分子量 阅蕴圆园园园 和 阅蕴员园园园曰员袁圆院杂葬糟 陨和 运责灶玉双酶切 责匀粤晕鄄孕源缘园杂质
粒曰猿院杂葬糟 陨和 载遭葬 陨双酶切 责匀粤晕鄄 孕源缘园泽鄄 孕源缘园葬质粒曰源院正向片段产物曰缘院反向片段产物曰远院杂葬糟 陨和 载遭葬 陨双酶切 责匀粤晕鄄 孕源缘园杂鄄 孕源缘园粤质
粒曰苑院杂葬糟 陨和 载遭葬 陨双酶切 责月陨鄄孕源缘园鄄砸晕粤蚤 表达载体质粒 辕 允酝员园怨曰愿院杂葬糟 陨 和 载遭葬 陨 双酶切 责月陨鄄孕源缘园鄄砸晕粤蚤 表达载体质粒 辕 蕴月粤源源园源曰怨院
责月陨鄄孕源缘园鄄砸晕粤蚤表达载体质粒
粤院凿藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣 责匀粤晕鄄孕源缘园杂 责造葬泽皂蚤凿 憎蚤贼澡 凿燥怎遭造藻 凿蚤早藻泽贼蚤燥灶曰月院孕悦砸 凿藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣 责匀粤晕鄄孕源缘园泽鄄孕源缘园粤 责造葬泽皂蚤凿曰 悦院 凿藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣 责匀粤晕鄄 孕源缘园杂鄄
孕源缘园粤 责造葬泽皂蚤凿 憎蚤贼澡 凿燥怎遭造藻 凿蚤早藻泽贼蚤燥灶曰阅院凿藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣 责月陨鄄孕源缘园鄄砸晕粤蚤 责造葬泽皂蚤凿 憎蚤贼澡 凿燥怎遭造藻 凿蚤早藻泽贼蚤燥灶曰耘院凿藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣 责月陨鄄孕源缘园鄄砸晕粤蚤 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼
责造葬泽皂蚤凿援 酝院阅晕粤 酝葬噪藻则 阅蕴圆园园园 葬灶凿 阅蕴员园园园曰员袁圆院责匀粤晕鄄孕源缘园杂 责造葬泽皂蚤凿 憎葬泽 凿蚤早藻泽贼藻凿 憎蚤贼澡 杂葬糟 陨 葬灶凿 运责灶玉曰 猿院责匀粤晕鄄 孕源缘园杂鄄 孕源缘园粤 责造葬泽皂蚤凿
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圆郾 圆摇 中间载体的构建
对 责匀粤晕鄄 孕源缘园杂 质粒进行 杂葬糟 陨 和 运责灶 陨 双酶切
处理袁鉴定重组质粒 责匀粤晕鄄孕源缘园杂 的正确性遥 结果如
图 圆鄄粤所示袁双酶切产物为 缘圆缘遭责 的 孕源缘园杂 片段和载
体 责匀粤晕晕陨月粤蕴片段袁表明已将 孕源缘园杂 片段连入载体
责匀粤晕晕陨月粤蕴遥 责匀粤晕鄄孕源缘园杂鄄孕源缘园粤 质粒 孕悦砸 鉴定结
果见图 圆鄄月袁从图 圆鄄月 可以看出袁中间载体出现了
缘圆缘遭责 和 源圆员遭责 的目的条带遥 对 责匀粤晕鄄孕源缘园杂鄄孕源缘园粤
质粒进行 杂葬糟 陨和 载遭葬 陨双酶切处理袁电泳检测结果如
图 圆鄄悦所示袁双酶切产物出现 员远远远遭责 的目的片段渊目
的片段包括 缘圆缘遭责的正向片段 孕源缘园杂袁苑圆园遭责的内含子
和 源圆员遭责的反向片段 孕源缘园粤冤袁说明 孕源缘园粤也已连接到
责匀粤晕鄄孕源缘园杂遥 酶切鉴定和 孕悦砸 鉴定结果均证明成功
构建了中间载体遥
圆郾 猿摇 责月陨鄄孕源缘园鄄砸晕粤蚤表达载体的构建
对 责月陨鄄孕源缘园鄄砸晕粤蚤质粒进行 杂葬糟 陨和 载遭葬 陨双酶切
处理袁 结果如图 圆鄄阅 所示遥 双酶切产物有 员远远远遭责 的
目的基因片段袁与预期结果相符袁说明已成功构建了
责月陨鄄孕源缘园鄄砸晕粤蚤表达载体遥
圆郾 源摇 责月陨鄄孕源缘园鄄砸晕粤蚤表达载体在农杆菌中的转化与
鉴定
将构建好的植物表达载体通过冻融法导人农杆菌
蕴月粤源源园源 中袁 用卡那霉素尧利福平和硫酸链霉素进行
筛选袁 获得抗性菌株遥 对其质粒进行 杂葬糟 陨和 载遭葬 陨双
酶切检测袁结果如图 圆鄄耘所示袁从农杆菌中提取的质粒
与从大肠杆菌提取的质粒双酶切图谱一致遥 表明质粒
远苑愿
摇 远 期 蓖麻细胞色素 孕源缘园 基因片段的克隆及 砸晕粤蚤表达载体的构建
载体已成功转入农杆菌 蕴月粤源源园源 中袁可直接用于后续
的转染工作遥
图 猿摇 责月陨鄄孕源缘园鄄砸晕粤蚤植物表达载体构建流程图
云蚤早援 猿摇 悦燥灶泽贼则怎糟贼蚤燥灶 糟澡葬则贼 燥枣 责月陨鄄孕源缘园鄄砸晕粤蚤 增藻糟贼燥则
圆郾 缘摇 责月陨鄄孕源缘园鄄砸晕粤蚤表达载体构建流程图
责月陨鄄孕源缘园鄄砸晕粤蚤表达载体构建过程如图 猿袁首先利
用 杂葬糟 陨 和 运责灶 陨 双酶切 责匀粤晕晕陨月粤蕴 载体袁将 孕源缘园杂
插入切点袁形成 责匀粤晕鄄 孕源缘园杂遥 然后利用 载遭葬 陨 和
匀蚤灶凿 陨陨陨双酶切 责匀粤晕鄄 孕源缘园杂袁将 孕源缘园粤 插入切点袁形
成 责匀粤晕鄄孕源缘园杂鄄 孕源缘园粤遥 最后利用 杂葬糟 陨 和 载遭葬 陨 双
酶切 责月陨鄄员圆员 载体袁将 责匀粤晕鄄孕源缘园杂鄄 孕源缘园粤 片段插入
切点袁责月陨鄄孕源缘园鄄砸晕粤蚤表达载体构建完毕遥
猿摇 讨论
人工合成基因是获得目的基因的途径之一遥 员怨愿怨
苑苑愿
允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
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年袁匀燥则贼燥灶 等成功建立了重叠延伸 孕悦砸渊早藻灶藻 泽责造蚤糟蚤灶早
遭赠 燥增藻则造葬责 藻曾贼藻灶泽蚤燥灶袁杂韵耘鄄孕悦砸冤技术遥 此技术是根据
目的基因的核苷酸序列袁将目的基因分成多条引物袁利
用相连片段间 圆园 耀 猿园遭责重叠的核苷酸部分互相搭桥尧
互为模板袁通过 孕悦砸 反应将各个片段组合成目的基
因遥 在模板 阅晕粤难以获得或考虑降低试验成本时袁重
叠延伸 孕悦砸技术合成基因不失为一种经济可行的方
法咱员员袁员圆暂 遥 重叠延伸 孕悦砸 技术成功的关键是重叠互补
引物的设计遥 关键点在引物设计的长度和相连引物间
的重叠区域 圆 个方面袁根据合成引物的成本和寡聚核
苷酸拼接反应的要求袁本研究引物长度设计为 缘愿遭责袁
相连片段间重叠 圆园 个碱基遥 通过一次延伸反应得到
目的基因的模板 阅晕粤袁再经过一次 孕悦砸反应即得到目
的基因片段袁省却了常规 孕悦砸 中模板 阅晕粤 的获取和
摸索最适退火温度的过程遥
细胞色素 孕源缘园 在植物生长发育过程中起着十分
重要的作用袁截至 圆园员员 年袁已分离的植物细胞色素
孕源缘园 基因达 缘员园园 个袁但其中已知功能的却很少袁因此
鉴定其功能仍然是今后相当长时期的研究热点遥 另
外袁由于 孕源缘园 具有解毒功能袁所以 孕源缘园 解毒功能的开
发和利用也是其研究重点遥
源摇 结论
本研究成功克隆了蓖麻细胞色素 孕源缘园 基因的 圆
个片段袁通过序列测定确定正向片段长度为 缘圆猿遭责袁反
向片段长度为 源员员遭责袁与 郧藻灶月葬灶噪 中的蓖麻细胞色素
孕源缘园 基因的碱基同源性 分 别 达 到 怨愿郾 愿缘豫 和
怨怨郾 缘员豫 遥 通过限制性内切酶尧载体 责匀粤晕晕陨月粤蕴 和植
物表达载体 孕月陨鄄员圆员 成功构建了 责月陨鄄孕源缘园鄄砸晕粤蚤 表达
载体袁将其导入根癌农杆菌 蕴月粤源源园源 菌株中袁为利用
砸晕粤蚤技术抑制蓖麻细胞色素 孕源缘园 基因表达的研究
奠定了基础遥
参考文献院
咱 员 暂 摇 戴素明袁 周成爱袁 谢炳炎袁 冯东昕袁 肖启明援 细胞色素 孕源缘园 表
达在植物防御反应中的作用 咱 允暂 援 石河子大学学报袁 圆园园源袁
渊圆圆冤院 员愿源 原 员愿苑
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氧酶渊悦再孕怨园冤基因的克隆与分析咱允暂 援 遗传学报袁 圆园园缘袁猿圆渊源冤院
猿愿源 原 猿怨圆
咱 缘 暂 摇 杨学文袁 彭镇华援 一个毛竹细胞色素 孕源缘园 基因的克隆与表达研
究咱允暂 援 安徽农业大学学报袁 圆园员园袁 猿苑渊员冤院 员员远 原 员圆员
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咱 怨 暂摇 马摇 超袁 何摇 娟袁 郝青南袁 王摇 蕾袁 鲁晓燕袁 马兵钢援 构建番茄
红素 茁 辕 着环化酶基因 砸晕粤蚤植物表达载体及其表达分析咱允暂 援 核
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咱员园暂摇 刘爱玲袁 邹 摇 杰袁 王文芳袁 周小云袁 张先文袁 陈信波援 水稻
韵泽匀泽枣粤苑 基因 砸晕粤干扰载体的构建及遗传转化研究咱 允暂 援 核农
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咱员苑暂摇 宰藻泽造藻赠 杂 灾袁 匀藻造造蚤憎藻造造 悦 粤袁 杂皂蚤贼澡 晕 粤袁 宰葬灶早 酝 月袁 砸燥怎泽藻 阅 栽袁
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砸燥遭蚤灶泽燥灶 杂 孕袁 郧造藻葬增藻 粤 孕袁 郧则藻藻灶 粤 郧袁 宰葬贼藻则澡燥怎泽藻 孕 酝援 悦燥灶泽贼则怎糟贼
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孕造葬灶贼 允燥怎则灶葬造袁 圆园园造袁 圆苑渊 远冤 院 缘愿员 原 缘怨园
渊责任编辑摇 王媛媛冤
愿苑愿