全 文 ：书!核 农 学 报!"#$%!"&"$## $$’(’ )$’%(
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收稿日期!"#$(*$$*#&!接受日期!"#$%*#(*($
基金项目!国家自然科学基金"($"’$&"&# !国家科技支撑项目""#$$+,-"(+#.#
作者简介!闫冬!女!主要从事食品生物技术方面的研究% /*0123$"#$$$#&##$4561789:78;5
通讯作者!别小妹!女!教授!主要从事食品微生物及生物技术方面的研究% /*0123$<=0%(4561789:78;5
文章编号!$###*&..$""#$%#$#*$’(’*#’
多粘类芽孢杆菌 >?1@A 高产 BC*D类抗菌
脂肽突变株的选育
闫!冬!别小妹!陆兆新!吕凤霞!赵海珍!张!充
"南京农业大学食品科技学院!江苏 南京!"$##A.#
摘!要!为了提高多粘类芽孢杆菌 >?1@A 产 BC*D类抗菌脂肽的产量!本研究采用亚硝基胍"EFG#$H#IJ*
!射线和低能 EK离子注入 ( 种不同诱变方法!确定了 EFG最佳诱变浓度为 .#"L%0B@$!H#IJ*!射线最
佳诱变剂量为 "##GM&当低能 EK离子注入能量为 $#N9O!最佳注入时间为 H# P!当注入能量为 "#N9O!最
佳注入时间为 (# P’ 最终从 (## 株突变株中筛选得到 $ 株苯丙氨酸缺陷型菌株 E$ @(’ 和 $ 株组氨酸
缺陷型菌株 E" @"’!均由 EFG诱变获得’ 以金黄色葡萄球菌为指示菌进行抑菌试验!E$ @(’ 和 E" @
"’ 抑菌圈直径比出发菌株 >?1@A 分别增加 %.Q.%R和 ("Q(.R’ 通过高效液相色谱确定 BC*D类抗菌
脂肽产量!结果表明!E$ @(’ 和 E" @"’ 产 BC*D类抗菌脂肽的产量是原始菌株 >?1@A 的 $Q’$ 倍和 $Q%
倍!经连续传代 $# 代!试验表明 " 菌株遗传稳定性良好!不仅可以应用于工业生产上!还可以作为亲本
菌株进行细胞融合研究’
关键词!多粘类芽孢杆菌&BC*D类抗菌脂肽&诱变育种&营养缺陷型
-SC$$#Q$$&HAT682PP58$##*&..$Q"#$%Q$#8$’(’
!!多粘类芽孢杆菌 "2&+%.3&*.’#14"’5657&#原名多
粘芽孢杆菌"8&*.’#14"’5657&#!是一种产芽孢的革兰
氏阳性细菌!在早期研究中以形态学为分类基础被归
入芽孢杆菌属% $AA% 年!,PU 等 &$’根据其表型特征!
并利用 VIW探针法分析其 $H?XWE,序列!发现此类菌
与典型的芽孢杆菌菌种枯草芽孢杆菌有显著的区别!
因此成立类芽孢杆菌属!并将多粘类芽孢杆菌设立为
类芽孢杆菌属的模式菌种 &"’ % 多粘类芽孢杆菌在其
生长代谢过程中能产生多种抗菌物质!对植物具有防
病和促生作用!常作为生防菌被广泛应用于农业生产
中 &( @H’ % 此外多粘类芽孢杆菌还能够产生多种具有医
学价值的抗菌物质!多粘菌素 +" YJ3M0M=25P+! VZ+#
和多粘菌素 /";J32P[25 # 已在临床上用于抗细菌感
染 &"’ % 由于多粘类芽孢杆菌应用前景广阔!美国国家
环境保护署"95\2XJ5095[13YX9[9;[2J5 1L95;M! /V,#将
其列为可商业化应用的微生物之一 &’’ % 我国农业部
更是将其作为免做安全鉴定的一级菌种%
-95L等 &&’在土壤中分离得到 $ 株具有广谱抑菌
作用的多粘类芽孢杆菌 >?1@A!经鉴定其产生的一类
抑菌物质为 BC*D类脂肽% 已有研究表明!该类物质对
黑曲霉 ",14+$-.’#1%.-+$#( 尖孢 镰 刀 菌 "9#1&$.#6
"7514"$#6#(米曲霉 ",14+$-.’#1"$5:&+#和黄海葵附生
真菌"2+%.*.’.#6/;"6.#等真菌具有显著的拮抗作用!
对 革 兰 氏 阳 性 细 菌 特 别 是 金 黄 葡 萄 球 菌
"0/&4;5’"*"**#1&#$+#P#有很高的杀菌活性!且能有效
地抑制白色念珠菌 "<&%=.=& &’3.*&%1#和酿酒酵母菌
"0&**;&$"65*+1*+$+>.1.&+# &A @$#’ !说明 BC*D类抗菌脂肽
有很大的应用价值和广阔应用前景% 本试验前期研究
结果表明!2?4"’5657& >?1@A 次级代谢产物脂肽 BC*D
对小麦赤霉病菌的拮抗效果明显而稳定持久!能有效
地抑制小麦赤霉病菌菌丝的生长和孢子萌发!特别是
在脂肽 BC*D浓度仅为 (#"L)0B@$时!其能完全抑制赤
霉病菌分生孢子的萌发!对小麦赤霉病的有效控制具
有很好的应用价值 &$$!$A’ %
从自然界中分离出来的野生菌产生次级代谢产物
产量一般都很低!通过微生物人工诱变育种不仅可以
’(’$
核!农!学!报 "& 卷
提高野生菌株的产量!还能改造野生菌株的代谢功能!
由于它操作简便(速度快(收效大而且手段多样!所以
是实验室及工业生产上最为常用的高产菌株育种方
式!其按诱导突变类型可分为化学诱变(物理诱变和生
物诱变 ( 大类 &$"’ % 亚硝基胍"EFG#是烷化剂的一种!
而烷化剂是一类相当有效的化学诱变剂!具有 $ 个或
多个活性烷基!易使 -E,分子上的碱基及磷酸部分被
烷化!导致碱基配对错误而引发突变 &$(’ % EFG对每一
细胞具有诱发一次至多次突变的效力!有超级诱变剂
之称!在合适的条件下!死亡率低而诱变突变率高% 离
子注入是 "# 世纪 &# 年代兴起的一种表面处理技术!
其原理是利用离子注入设备产生离子束注入生物体引
起遗传物质的永久改变% 离子注入具有诱变谱广(正
突变率高等特点!同时对生物体的生理损伤较轻!在抗
生素育种上的应用正逐渐增多 &$%’ %H#IJ*!射线可直接
氧化脱氧核糖的碱基或脱氧核糖的化学键!间接使水
或有机分子产生自由基!导致 -E,损伤!造成基因突
变!从而改变微生物遗传性状 &$. @$H’ % 采用该诱变技术
不但能获得高突变率和宽突变谱!而且还有利于新突
变型的筛选% 本研究的目的就是利用上述理化诱变技
术获得有营养型标记的高产菌株!提高其产 BC*D类抗
菌脂肽的产量!为其今后的基因遗传分析(抗菌机理研
究和工业化应用奠定基础%
!"材料与方法
!#!"材料
$Q$Q$!菌种!2&+%.3&*.’#14"’5657& >?1@A$系本实
验室自江苏南京紫金山土样中分离!并已保藏于中国
普通微生物菌种保藏管理中心"IGZIIEJ8%($%#%
指示菌株$金黄色葡萄球菌& 0/&4;5’"*"**#1&#$+#1
IZII"+#"H##(’
$Q$Q"!培养基!营养琼脂培养基!B15:M培养基!B+
培养基!基本培养基!完全培养基%
$Q$Q(!主要试剂!磷酸缓冲液" Y]值 ’Q##*磷酸缓
冲液"Y]值 HQ##*亚硝基胍"EFG#(丙酮(青霉素(各
种氨基酸(维生素%
!#$"方法
$Q"Q$!菌体活化!将斜面菌种 >?1@A 经活化后接入
B+液体培养基中!(#^($&#X)025 @$培养 "" )"% U 至
对数期%
$Q"Q"!诱变方法!亚硝基胍"EFG#诱变$将 $0B活
化好的菌悬液与 "0L)0B@$ EFG母液按照一定比例混
合!使 EFG的终浓度分别为 #(.#(’.($##($.#("##(
""."L)0B@$!(#^下水浴处理 (#025!稀释终止反应!
采用涂布分离法吸取 #Q$0B稀释好的种子液涂布到
营养琼脂平板上!每个稀释梯度涂 ( 块平板!置于
(#^培养箱中培养 %&U% 待平皿长出菌落后!进行菌
落计数以未经过 EFG处理的菌悬液制成的平皿为对
照!计算致死率*挑取单菌落平板点样培养 %& U!采用
琼脂块法做抑菌试验!计算正突变率%
H#IJ*!射线诱变$将活化好的种子液分装至无菌
玻璃容器里接受辐照!辐照剂量分别为 $##("##(%##(
H## GM% 诱变后的种子液用无菌生理盐水进行梯度稀
释% 然后吸取 #Q$0B稀释好的种子液涂布营养琼脂
固体平板!每个稀释梯度涂 ( 块平板!置于 (#^培养
箱中培养 %&U% 待平皿长出菌落后!进行菌落计数以
未经过辐照处理的菌悬液制成的平皿为对照!计算致
死率*挑取单菌落平板点样培养 %& U!采用琼脂块法做
抑菌试验!计算正突变率%
低能 EK离子注入诱变$吸取 #Q$ 0B活化好的种
子液!均匀涂布于直径 A ;0的无菌平皿中!无菌风吹
干制成菌膜% 将需离子注入的样品平皿放入离子注入
机靶室!打开上方平皿盖!靶室抽真空% 用能量为 $#
和 "#N9O离子束处理!注入时间分别为 #((#(H# 和 A#
P% 注入后用 $ 0B无菌水浸泡 $#025!充分洗下菌体
后!吸取 #Q$0B稀释好的种子液涂布营养琼脂固体平
板!每个稀释梯度涂 ( 块平板!置于 (#^培养箱中培
养 %&U% 待平皿长出菌落后!进行菌落计数以未经过
离子注入处理的菌悬液制成的平皿为对照!计算致死
率*挑取单菌落平板点样培养 %& U!采用琼脂块法做抑
菌试验!计算正突变率%
致死率和正突变率计算公式如下$
致死率 _",*+#T,‘$##R
正突变率 _IT,‘$##R
式中$,为对照平皿上的单菌落数*+为诱变平皿
上单菌落数*I为抑菌透明圈直径 -与菌落直径 : 的
比值高于原始菌株的突变株总数%
$Q"Q(!营养缺陷型菌株的筛选
诱变处理$诱变方法同 $Q"Q"!选择最佳诱变处理
浓度或剂量%
中间培养$将 $ 0B诱变处理过的菌液!转入装有
"# 0B完全液体培养基的 ".# 0B锥形瓶中!(#^!$&#
X)025 @$摇床振荡培养 $"U%
青霉素法淘汰野生型$取 $# 0B上述中间培养液!
. ### X)025 @$ 离心 $#025!弃上清液!用无菌生理盐水
洗涤菌体 ( 次!加到无氮源的基本液体培养基中!
(#^!$&# X)025 @$振荡饥饿培养 $" U% 将上述经饥饿
&(’$
!$# 期 多粘类芽孢杆菌 >?1@A 高产 BC*D类抗菌脂肽突变株的选育
培养的菌液!. ### X)025 @$离心 $#025!弃上清液!用无
菌生理盐水洗涤菌体 ( 次!加到含二倍氮源的 "# 0B
基本液体培养基中!(#^振荡培养 $" U!加入终浓度为
.#a)0B@$的青霉素溶液!同时!加入无菌的 "#R蔗糖
和 #Q"R ZL?S%!再继续培养 $" U!达到淘汰野生型(
浓缩缺陷型目的%
营养缺陷型的检出$各取 #Q$ 0B上述菌悬液!分
别涂布于完全培养基平板上!置于 (#^培养箱中培养
%&U% 在完全培养基上长出菌落后用点植对照法 &$’’检
出营养缺陷型% 制备完全培养基平板和基本培养基平
板!用灭菌牙签从完全培养基平板上逐个挑取菌落!对
应点接种在基本培养基平板和完全培养基平板上!置
于 (#^培养箱中培养 "% )(HU!在完全培养基平板上
生长!而在基本培养基平板的对应位置不长的菌落!作
为营养缺陷型鉴定用菌株%
营养缺陷型的鉴定$参照文献&$&’!取 #Q$0B待鉴
定营养缺陷型菌悬液!涂布于基本培养基上!采用生长
谱法&$#’进行鉴定!即用蘸有不同氨基酸和维生素混合
液"氨基酸浓度均为 $#0L)0B@$!分组如表 $#的 & 种无
菌滤纸片覆盖其上"图 $#!(#^培养 " )(:!观察滤纸片
表面菌落生长情况!当某一滤纸片周围出现菌落圈时!
即说明是某一氨基酸(维生素或核苷酸的缺陷型%
表 !"营养成分分组
%&’()!"*+,-./,01-2+3)12/
组别
GXJ7Y
组分
IJ0YJP2[2J5
# 赖氨酸(精氨酸(甲硫氨酸(半胱氨酸(胱氨酸
$ 组氨酸(精氨酸(苏氨酸(谷氨酸(天冬氨酸
% 丙氨酸(甲硫氨酸!苏氨酸(羟脯氨酸(甘氨酸(丝氨酸
& 亮氨酸(半胱氨酸!谷氨酸(羟脯氨酸(异亮氨酸(缬氨酸
’ 苯丙氨酸(胱氨酸(天冬氨酸(甘氨酸(异亮氨酸(酪氨酸
( 色氨酸(丝氨酸(缬氨酸(酪氨酸
) 脯氨酸
* 硫胺素(核黄素(吡哆醇(泛酸(对氨基苯甲酸(烟碱酸(生物素
$Q"Q%!营养缺陷型菌株发酵液对金黄色葡萄球菌的
抑菌活性!将生长到对数期的营养缺陷型菌株种子液
按照 $#R的接种量接种于 .#0BB15:M液体发酵培养
基中!(#^($&# X)025 @$摇床震荡培养 ’"U&$A’ % ’"U 之
后将发酵培养液于 $" ### X)025 @$离心 "#025!取上清
液!经 #Q%."0孔径的细菌滤器过滤% 抑菌平板制作$
将金黄色葡萄球菌接种于营养琼脂斜面上!置于 (’^
培养箱培养过夜!用 .0B生理盐水洗涤斜面制成菌悬
图 !"生长谱法示意图
4356!"789):&238;3&5+&: ,029)5+,<29/.)82+-::)29,;
液!混入融化的 $##0B营养琼脂固体培养基中!倾倒
平板待其冷却后!用 %Q.00直径的无菌打孔器打取平
板上的琼脂块!取发酵上清液 .#"B注入琼脂孔中!将
指示菌平板置于 (’^培养箱中培养 $"U!通过游标卡
尺测其抑菌圈的直径!以抑菌圈的直径表示发酵液的
抗菌活性!测定发酵液的抗菌活性%
$Q"Q.!高效液相色谱"]VBI#测定 BC*D类脂肽产量
!将菌株的 B15:M发酵培养液于 $" ### X)025 @$离心
"#025!取上清液!以 $b$的比例加入乙酸乙酯!在摇床
中 " )% U 震荡混匀!放入分液漏斗中静置过夜!充分
萃取% 取上层有机相保存!将下层水相以相同的方法
进行第二次萃取% 将 " 次得到的有机相 .# )..^旋
蒸至粉末!以发酵液与甲醇 .#b$的比例加入甲醇复
溶!复溶后离心去除不溶的杂质!样品用 #Q%."0孔径
的细菌滤器过滤!用高效液相色谱系统检测% 高效液
相色谱检测条件为$I$& 液相柱! .I$& @V,c! %QH
00+‘".#00*柱温 (.^*进样量 "#"B*检测波长$
"$#50*洗脱条件见表 " &&’ %
表 $"=>?@梯度洗脱条件
%&’()$"*+&;3)12)(-23,18,1;323,1,0=>?@
时间
F209T
025
乙腈T#Q$RFD,
,;9[J52[X239T
"#Q$R FD,#
水T#Q$RFD,
d1[9XT
"#Q$R FD,#
流速 D3JeX1[9T
"0B)025 @$ #
# $# A# #Q.
"# %# H# #Q.
(# H# %# #Q.
%# ’# (# #Q.
.# ’# (# #Q.
&# A# $# #Q.
!!收集 ". )(#025 之间的样品!用旋转蒸发浓缩旋
干至粉末!用甲醇溶解过膜后!再用旋转蒸发蒸干后用
水溶解过膜后!冻干!即得 BC*D相对纯品% 将标准品
配制成母液!并梯度稀释进行高效液相检测!重复 (
A(’$
核!农!学!报 "& 卷
次!以 BC*D相对纯品的浓度与对应峰面积作为横纵坐
标绘制标准曲线%
用相同处理方法处理突变株发酵液!进行 ]VBI
检测!得到相应峰面积!代入标准曲线方程中计算 BC*D
类抗菌脂肽产量%
$Q"QH!传代稳定性的考察!将营养缺陷型突变株连
续传代 $# 代并进行液体摇瓶发酵培养!进行 ]VBI测
定!考察突变菌株的遗传稳定性%
$"结果与分析
$#!"最佳诱变剂确定
"Q$Q$!亚硝基胍诱变!按照 $Q"Q" 方法!用平板计数
法得到经过不同浓度 EFG处理和对照的平板菌落数!
再用打琼脂块法初筛!通过计算!致死率和正突变率见
图 "% 由图 " 中可知$当 EFG浓度低于 $.#"L)0B@$
时!致死率明显上升*浓度高于 "##"L)0B@$时!致死率
达到 $##R% EFG浓度在 .#"L)0B@$和 ’."L)0B@$的
低浓度时!正突变率较高!而高浓度时正突变率保持在
较低水平% 当 EFG浓度为 .#"L)0B@$时!致死率为
AAQ"(R!出现正突变率的最大值 HHQH’R!此时不但
利于筛选工作的进行!而且正突变率高更易获得高产
突变菌株!说明 EFG在该浓度下对多粘类芽孢杆菌
>?1@A 诱变效果最佳% 因此!选择终浓度为 .#"L)
0B@$的 EFG进行后续筛选营养缺陷型菌株%
图 $"亚硝基胍浓度对 !"#$%&"’%()*+,(-.-/"
A7& BC 诱变效应的影响
4356$"D-2&5)138)00)82/,0;300)+)128,18)12+&23,1
,0E%* ,1!"#$%&"’%()*+,(-.-/" A7& BC
"Q$Q"!H#IJ*!射线诱变!本实验选择 $##("##(%##(
H## GM的H# IJ*!射线剂量对多粘类芽孢杆菌 >?1@A
进行辐照诱变!结果如图 (% 由图 ( 可见!随着辐照剂
量的增大!射线对菌株的致死率逐渐升高!正突变率呈
现先上升后下降的趋势% 在剂量为 H##GM时!致死率
接近 $##R!正突变率达到最小值 (%R!而辐照剂量为
"## GM时!致死率为 AAQ%AR!正突变率达到最大值
H’Q($R!试验结果表明在该辐照剂量下可获得大量高
产菌株!因此后续试验将该剂量作为最佳诱变剂量%
图 F"GH@,I!辐照剂量对 !"#$%&"’%()*
+,(-.-/" A7& BC 诱变效应的影响
4356F"D-2&5)138)00)82/,0J++&;3&23,1;,/),0
GH@,!,1!"#$%&"’%()*+,(-.-/" A7& BC
图 K"低能 EL离子注入时间对 !"#$%&"’%()*
+,(-.-/" A7& BC 诱变效应的影响
4356K"D-2&5)138)00)82/,0?,J:.(&12&23,123:),1!"#$%&"’%()*+,(-.-/" A7& BC
"Q$Q(!低能 EK离子注入诱变!本试验采用低能 EK离
子注入诱变方法!得到致死率和正突变率如图 %% 结果
表明!致死率均随着注入时间的增长而变大% 当离子注
入能量为 $# N9O!注入时间为 H# P时!致死率为
AAQ.(R!此时正突变率达到最大 ."Q$(R!利于筛选工
作的进行且易获得高产突变株!因此最佳注入时间为 H#
P% 当离子注入能量为 "# N9O!注入时间为 (# P时!致死
率为 AAQH(R!此时正突变率达到最大 .’Q"AR!同理!最
佳注入时间为 (# P% $#N9O(H#P与 "#N9O((#P相比较可
知!"#N9O((#P诱变条件下!获得正突变株的概率更大!
因此选择该诱变条件进行后续试验%
#%’$
!$# 期 多粘类芽孢杆菌 >?1@A 高产 BC*D类抗菌脂肽突变株的选育
$#$"高产营养缺陷型菌株的筛选鉴定
本研究采用亚硝基胍诱变(H# IJ*!射线诱变和低
能EK离子注入诱变等 ( 种不同的诱变方式!每种诱变
方式筛选 $## 株突变株!采用点植对照法比对!获得 "
株供营养缺陷型鉴定菌株"表 (#% 生长谱法鉴定结果
见表 "!E$ @(’ 在第 OCCC组的滤纸片周围长出菌落!
对照表 $ 分组得知该营养缺陷类型为苯丙氨酸缺陷
型*而 E" @"’ 在第 CC组的滤纸片周围形成菌落!对照
表 $ 鉴定该菌株为组氨酸营养缺陷型突变株%
表 F"生长谱法鉴定突变株营养缺陷类型
%&’()F"J;)123038&23,1,029)&-O,2+,.9382N.),029)
:-2&12/2+&31/’N -/315 5+,<29/.)82+-:
突变株
Z7[15[
P[X125P
组别 GXJ7Y
# $ % & ’ ( ) *
E$ @(’ @ @ @ @ K @ @ @
E" @"’ @ K @ @ @ @ @ @
!!注$+ K,表示在滤纸片周围有菌落形成*+ @,表示无菌落形成%
EJ[9$ + K, X9YX9P95[P[U1[[U9;J3J5M2PfJX09: 1XJ75: [U9f23[9XY1Y9X*
g@gX9YX9P95[P5J;J3J5MfJX01[2J58
$#F"突变株发酵液抑菌活性及 ?JI4类抗菌脂肽产量
测定
多粘类芽孢杆菌对革兰氏阳性菌有显著抑菌活
性!因此本试验选择金黄色葡萄球菌作为指示菌!突变
株发酵液对其抑制效果如表 % 所示% 从表 % 可以看
出!经诱变获得的 " 株营养缺陷型菌株 E$ @(’ 和 E"
@"’ 发酵液对金黄色葡萄球菌的抑制效果显著高于
野生菌 >?1@A!抑菌圈直径分别增大了 %.Q.%R和
("Q(.R!之后进一步采用 ]VBI方法测定其产量%
表 K"突变株发酵液对金黄色葡萄球菌的抑制效果
%&’()K"%9)3193’323,+N )00)82,029)’+,29,029)
:-2&2);/2+&31/,101"+2-(,’,’’)*")3#)*
指示菌
C5:2;1[JX
P[X125
野生菌
>?1@A
d23:
P[X125 >?1@A
突变株
E$ @(’
Z7[15[
P[X125 E$ @(’
突变株
E" @"’
Z7[15[
P[X125 E" @"’
金黄色葡萄球菌
0/&4;5’"*"**#1&#$+#1 $%Q.H h#Q"’ "$Q$A h#Q". $AQ"’ h#Q($
$#K"?JI4类抗菌脂肽标准曲线绘制
收集得到的样品旋转蒸发蒸干后!水溶解(过膜
后!冻干!得到 BC*D相对纯品 $#0L% 配制母液浓度为
. 0L)0B@$!稀释到 %("Q.($(#Q’.0L)0B@$!重复 (
次!经 ]VBI检测其对应峰面积见表 .%
根据表 . 绘制标准曲线"图 %#%
表 P"不同浓度的 ?JI4相对纯品液相检测结果
%&’()P"=>?@&1&(N/3/,0;300)+)128,18)12+&23,1
,0+)(&23Q)(N .-+)?JI4.+,;-823,1
浓度
IJ5;95[X1[2J5 "i#T"0L)0B@$ #
峰面积平均值
,\9X1L9Y91N 1X91"j#T0,7
. $HA$"QA
% $(#""Q%
"Q. &(#A
$ ("#$
#Q’. ""$"Q.
图 K"?JI4相对纯品标准曲线
4356K"72&1;&+;8-+Q),0+)(&23Q)(N .-+)?JI4.+,;-823,1
!!由图 % 得出标准曲线方程为 5_(%#$7@"&#QA!@"
_#QAAA$!线性关系良好!可以用于计算多粘类芽孢杆
菌 >?1@A 及其突变株产 BC*D类抗菌脂肽的产量%
$#P"突变株 ?JI4类抗菌脂肽产量测定
将多粘类芽孢杆菌 >?1@A(E$ @(’ 和 E" @"’ 的
发酵液按照 $Q"Q. 方法处理后!进行 ]VBI得到的峰
面积按照标准曲线方程计算 BC*D类抗菌脂肽的产量!
结果见表 H% 由表 H 可知!经诱变获得的营养缺陷型
菌株 E$ @(’ 和 E" @"’ 产 BC*D类抗菌脂肽的产量相
比于野生菌 >?1@A 有了显著增加!产量分别为野生菌
表 G"突变株 ?JI4类抗菌脂肽液相检测结果
%&’()G"R)2)823,1,0?JI42N.)&123’3,238/.+,;-8);
’N :-2&12/2+&31/-/315 =>?@&1&(N/3/
菌株
?[X125P
峰面积
V91N 1X91T0,7
BC*D产量
VXJ:7;[2J5 JfBC*DT"0L)B@$ #
>?1@A $%’%$Q’ &&Q$A
E$ @(’ ".(.%Q% $.#Q’.
E" @"’ "#’.’Q& $"(Q’"
$%’$
核!农!学!报 "& 卷
的 $Q’$ 倍和 $Q% 倍!有较高应用价值%
$#G"传代遗传稳定性试验结果
对诱变所得的 " 株营养缺陷型菌株进行遗传稳定
性实验!传 $# 代培养的结果如图 .% 发现 BC*D类抗菌
脂肽的产量波动很小!处于稳定状态!说明筛得的 " 株
菌株具有优良的遗传稳定性!可作为工业化生产菌株
应用%
图 P"突变菌株传代稳定性
4356P"J19)+32&18)/2&’3(32N ,0:-2&12/2+&31/5,22)1
F"讨论
多粘类芽孢杆菌因其能够产生多种促生物质和抗
菌物质已经作为生防菌广泛应用在农业生产中 &""’ !其
中!BC@D类抗菌脂肽对多种镰刀菌具有显著的拮抗
作用!可以作为生防菌应用于小麦赤霉病% 我们研究
室前期研究工作结果表明 &"(’ !2?4"’5657& >?1@A 次
级代谢产物脂肽 BC@D对小麦赤霉病菌的拮抗效果明
显而稳定持久!能有效地抑制小麦赤霉病菌菌丝的生
长和孢子萌发!特别是在浓度仅为 (#"L)0B@$ 时!
BC@D既能完全抑制赤霉病菌分生孢子的萌发!对小
麦赤霉病的有效控制具有很好的应用价值 &"%’ % 此外
多粘类芽孢杆菌还能够产生多种具有医学价值的抗菌
物质!多粘菌素 +"4"’5657.%1+! VZ+# 和多粘菌素 /
";J32P[25#已在临床上用于抗细菌感染 &"("’!% 由于多
粘类芽孢杆菌应用前景广阔!美国国家环境保护署
"/5\2XJ5095[13YX9[9;[2J5 1L95;M! /V,#将其列为可商
业化应用的微生物之一 &".’ !我国农业部更是将其作为
免做安全鉴定的一级菌种%
野生型微生物一般都存在着生长慢(产代谢产物
能力差(效价低等缺点!因此!在实际应用生产之前!首
先要采用适宜的技术手段进行菌种改良% 目前国内尚
未有对多粘类芽孢杆菌诱变育种筛选高产 BC@D抗菌
脂肽营养缺陷型菌株的相关研究!故本研究在该方面
填补了空白!为后续研究奠定了基础%
K"结论
本研究采用了亚硝基胍(H#IJ@!射线和低能 EK
离子注入三种诱变育种方法!确定出各自的最佳诱变
剂量及时间!为今后对多粘类芽孢杆菌诱变育种探索
了方法% 通过生长谱法筛选获得了两株具有营养缺陷
型标记的高产 BC@D抗菌脂肽突变株 E$ @(’ 和 E" @
"’!这两株营养缺陷型菌株均由 EFG诱变获得!说明
EFG更易诱发菌株产生营养缺陷!故在今后营养缺陷
型育种研究中可以选用此方法% E$ @(’ 产 BC@D类
抗菌脂肽的产量是野生菌 >?1@A 的 $8’$ 倍!E" @"’
的产量是其 $8% 倍!且遗传稳定性良好!为其工业化发
酵和实际应用提供了可行性% 此外!营养缺陷型可以
作为亲本菌株用于原生质体融合技术研究!为通过细
胞融合技术进一步提高 BC@D类抗菌脂肽的产量奠定
基础% 本研究为利用多种诱变技术遗传选育高产抗菌
肽菌株提供了新的研究方法和思路%
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