全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第4期
收稿日期:2008-01-29
基金项目:2007年公益性行业(农业)科研专项经费资助(nyhyzx07-024)
作者简介:朱辉(1981-),女,在读硕士,研究方向分子微生物学;E-mail:hzhu2005@126.com
通讯作者:杜秉海,Tel:86-0538-8242908;E-mail:bhdu@sdau.edu.cn
木聚糖和 β-1,3-1,4-葡聚糖是植物细胞壁结构性非淀粉多糖,木聚糖的基本结构单元是由 β-1,4或
β-1,3糖苷键连接的多聚木糖链[1],β-1,3-1,4-葡聚糖以 β-1,3和 β-1,4混合糖苷键连接形成 D-葡萄糖
聚合物。很多细菌、真菌和酵母菌具有木聚糖或(和)β-1,3-1,4-葡聚糖水解活性 [2,3]。β-1,4-木聚糖酶(β-
1,4-xylanases,EC3.2.1.8)是木聚糖水解酶系中最关键的酶组分,能够水解木聚糖主链骨架的 β-1,4-木糖
苷键,对降解自然界大量存在的半纤维素起着重要作用,在饲料、造纸、食品、能源等工业中有广阔的应用
前景[4,5];β-1,3-1,4-葡聚糖酶(β-1,3-1,4-glucanase,EC3.2.1.73,又称地衣酶)是高效、专一分解 β-葡聚糖
的主要酶,对 β-1,3-葡聚糖和 β-1,4-葡聚糖都有作用,在饲料和酿酒工业中添加 β-葡聚糖酶可以有效消
多粘类芽孢杆菌SC2xynD和gluB的克隆及序列分析
朱辉 1 丁延芹 1 田方 1 姜远茂 2 杜秉海 1
(1山东农业大学生命科学学院,泰安 271018;2山东农业大学园艺科学与工程学院,泰安 271018)
摘 要: β-1,4-木聚糖酶和β-1,3-1,4-葡聚糖酶活性检测结果表明,多粘类芽孢杆菌(Paenibaciluspolymyxa)
SC2能同时产生β-1,4-木聚糖酶和 β-1,3-1,4-葡聚糖酶。以菌株SC2的基因组DNA为模板,通过TAIL-PCR方法克
隆到4807bp的DNA片段。DNAMAN软件分析,该DNA片段包含2个开放阅读框(ORF),ORF1长度为1908bp,编
码含 635个氨基酸、分子量为67.8kD的蛋白;ORF2长度为 714bp,编码含 237个氨基酸、分子量为 26.8kD的蛋白。
BLAST分析结果表明,ORF1与已报道的 P.polymyxaATCC 842的 xynD基因相似性为 94%,ORF2与 P.polymyxa
WY110的gluB基因相似性为99%。基因序列的系统发育分析进一步说明,ORF1和ORF2分别为β-1,4-木聚糖酶基因
xynD和β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因gluB。
关键词: 多粘类芽孢杆菌 β-1,4-木聚糖酶基因 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因 克隆 序列分析
CloningandSequenceAnalysisofxynDandgluBof
PaenibaciluspolymyxaSC2
ZhuHui1 DingYanqin1 TianFang1 JiangYuanmao2 DuBinghai1
(1ColegeofLifeSciencesShandongAgriculturalUniversity,Taian271018;2ColegeofHorticultureScienceand
Engineering,ShandongAgriculturalUniversity,Taian271018)
Abstract: Detectionofβ-1,4-xylanaseandβ-1,3-1,4-glucanaseactivityrevealedthatPaenibaciluspolymyxa
SC2couldproduceβ-1,4-xylanaseandβ-1,3-1,4-glucanase.A4807bpDNAfragmentwasclonedbyTAIL-PCR
withgenomicDNA ofP.polymyxaSC2astemplate.DNAMAN analysisoftheDNA fragmentrevealedthatthe
sequencecontainedtwoopenreadingframes,includingORF1,1908bp,encodingaproteinof635aminoacidswitha
molecularmasof67.8kD,andORF2,714bp,encodingaproteinof237aminoacidswithamolecularmasof26.8kD.
AccordingtotheresultofBLAST analysis,ORF1wasidenticaltoxynD ofP.polymyxaATCC 842atthelevelof
94%,andORF2wasidenticaltogluBofP.polymyxaWY110atthelevelof99%.Furthermore,basedonphylogenetic
analysis,itwasshownthatORF1andORF2couldbexynD thatcanbeabletoencodeβ-1,4-xylanase,andgluBthat
encodeβ-1,3-1,4-glucanase,respectively.
Keywords: Paenibaciluspolymyxa β-1,4-xylanasegene β-1,3-1,4-glucanasegene Cloning Sequenceanalysis
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
除 β-葡聚糖的抗营养特性。
多粘类芽孢杆菌(Paenibaciluspolymyxa)的某些菌株具有分解木聚糖和葡聚糖的能力,揭示这些菌株
的水解分子机制,对于其在农业、工业等领域的应用具有重要意义[6,7]。Priest[8]对P.polymyxa(Baciluspolymyxa)
的研究表明,该菌株具有纤维素酶和(或)半纤维素酶活性。Gosalbes等[9]对 P.polymyxaATCC842的 β-1,4-
木聚糖酶基因xynD和β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因gluB进行了克隆、表达及序列分析。姚乌兰等[10]从P.polymyxa
WY110克隆到 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因 gluB,并证实其表达产物具有抗真菌活性。
P.polymyxaSC2是分离自辣椒根际的一株高效生防菌株。在以前的研究中,发现其具有分解木聚糖和
葡聚糖的能力。本文采用 TAIL-PCR方法,克隆了 P.polymyxaSC2的 β-1,4-木聚糖酶基因 xynD和 β-1,3-
1,4-葡聚糖酶基因 gluB,并对其进行了序列分析和系统发育分析。
1 材料与方法
1.1 菌株和载体
实验中所用菌株和载体见表 1。
1.2 培养基及主要试剂
细菌培养用 LB培养基,β-1,4-木聚糖
酶活性检测用培养基[11](oatspeltxylan0.7%,
yeastextract0.2%,NaCl0.25%,NH4Cl0.5%,
KH2PO41.5%,Na2HPO43%,MgSO4·7H2O0.025%,pH7.0),β-1,3-1,4-葡聚糖酶活性检测用含有 0.2%地衣
多糖的 LB平板。分子生物学试剂购买于 TaKaRa公司,配制参阅文献[12]。
1.3 β-1,4-木聚糖酶和 β-1,3-1,4-葡聚糖酶活性检测
β-1,4-木聚糖酶和 β-1,3-1,4-葡聚糖酶活性的检测,参照文献[13]进行。将 P.polymyxaSC2点种在木聚
糖酶活性检测培养基平板上,37℃培养 24h后,观察是否出现水解圈。将 P.polymyxaSC2点种在含有 0.2%
地衣多糖的 LB平板上,于 37℃培养 24h后,用 0.1%的刚果红溶液染色 5min,倒去染色液并用清水冲洗,
观察是否出现透明水解圈。
1.4 细菌基因组 DNA的提取
以 P.polymyxaSC2的 LB培养液提取基因组 DNA,方法参阅文献[14]。
1.5 gluB保守区域的克隆和序列测定
根据已报道的 P.polymyxaATCC842和 P.polymyxaWY110的 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的同源序列,
设计引物,上游引物为 gluB1:5-TTGCGAATGTGTTCTGGGAACC-3、下游引物为 gluB6:5-TACTAATTGCTCG
TATATTTTACCCA-3,以基因组 DNA为模板进行 PCR扩增。PCR反应体系(50μl)为:10×PCRbufer(w/Mg)
5μl,dNTPs(10mmol/L)1μl,gluB1(10μmol/L)5μl,gluB6(10μmol/L)5μl,TaqDNA聚合酶(5U/μl)1μl,基因组
DNA0.5μl,DEPCtreatedH2O32.5μl。PCR扩增条件为 98℃预变
性 5min;94℃变性 30s;56℃退火 50s,72℃延伸 1min,循环次数为
30次;72℃终延伸10min。扩增产物连接在pMD18-T上,转化E.coli
DH5α感受态细胞,采用蓝白筛选法和质粒快速检测法筛选重组子,
选取阳性重组子送上海英俊生物技术有限公司进行测序。
1.6 xynD和 gluB基因簇的克隆
用 TAIL-PCR[15](ThermalasymmetricinterlacedPCR)方法,以
P.polymyxaSC2的基因组 DNA为模板,根据已知的序列向两端
设计特异性引物,结合随机的兼并引物扩增已知序列的侧翼序
列,所用特异性引物(表 2)。将第 3轮产物回收测序。
表 1 菌株和载体
表 2 TAIL-PCR使用的特异性引物
172
2008年第4期
1.7 xynD和 gluB序列分析和系统发育分析
用 DNAMAN软件分析开放阅读框,将所得序列提交 NCBI用 BLAST(htp:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)
进行序列相似性分析。用 clustalX软件进行序列比对,缺口用“-”补齐,然后用 TREECONW建树程序建立系
统发育树。
2 结果
2.1 β-1,4-木聚糖酶和 β-1,3-1,4-葡聚糖酶活性检测
将 P.polymyxaSC2点种在木聚糖酶活性检测培养基平板上,培养 24h后,在菌落周围出现了水解圈
(图 1),说明 P.polymyxaSC2能产生 β-1,4-木聚糖酶。将 P.polymyxaSC2点种在含有地衣多糖的 LB平板
上,培养 24h,然后,用刚果红溶液染色、清水冲洗后,观察到菌落周围出现透明水解圈(图 2),说明 P.
polymyxaSC2能产生 β-1,3-1,4-葡聚糖酶;因为刚果红能与地衣多糖反应呈现红色,如果 P.polymyxaSC2
能产生 β-1,3-1,4-葡聚糖酶,则能分解其周围的地衣多糖,出现透明水解圈,而背景被染成红色。
图 2 PaenibaciluspolymyxaSC2的 β-1,
3-1,4-葡聚糖酶活性检测
图 1 PaenibaciluspolymyxaSC2的 β-1,
4-木聚糖酶活性检测
2.2 gluB保守区域的克隆
以 P.polymyxaSC2的基因组 DNA为模板,以 gluB1和 gluB6为引物进行 PCR扩增,PCR产物 1%琼脂
糖凝胶电泳检测显示,菌株 SC2在约 600bp处出现单一条带(图 3),与预期的片段大小一致。将该片段测
序,结果表明为 gluB的保守区域。
2.3 xynD和 gluB基因簇的克隆
采用 TAIL-PCR方法,以 P.polymyxaSC2的基因组 DNA为模板,分别用特异性引物 LG1、LG2、LG3和
随机兼并引物,扩增 gluB保守片段的左侧序列(图 4),回收第 3轮产物,连接 pMD18-T,进行序列测定。根
据第 1次 TAIL-PCR所得 gluB保守片段左侧序列,设计特异性引物 LXP1、LXP2、LXP3,继续向左扩增。将第
3轮 PCR产物连接 pMD18-T,进行序列测定。分别用特异性引物 RG1、RG2、RG3和随机兼并引物,扩增 gluB
保守片段的右侧序列。将保守区域序列和 3次 TAIL-PCR所得序列拼接,得到长度为 4807bp的完整序列。
图 4 SC2基因组 LG的 TAIL-PCR产物电泳图
图 3 PaenibaciluspolymyxaSC2gluB保守
区域产物电泳图
M:DNAmarkerDL2,000;1:ProductsofSC2
朱辉等:多粘类芽孢杆菌SC2xynD和gluB的克隆及序列分析 173
生物技术通报Biotechnology Bulletin2008年第4期
2.4 xynD和 gluB基因簇序列分析
用 DNAMAN软件对从 P. polymyxa SC2中克隆到的 4 807bp DNA片段进行开放阅读框架分析。该片段
包含 2个开放阅读框(ORF)。ORF1长度为 1 908 bp,编码含 635个氨基酸、分子量为 67.8kD的蛋白,以
ATG为起始密码子,TGA为终止密码子,ORF2长度为 714 bp,编码含 237个氨基酸、分子量为 26.8kD的蛋
白,以 ATG为起始密码子,TAG为终止密码子。BLAST分析结果表明,ORF1与 P. polymyxa ATCC 842的
xynD基因相似性为 94%,ORF2与 P. polymyxa WY110的 gluB基因相似性为 99%。将该 DNA序列提交
GenBank,所得收录号为 EU410619。
2.5 xynD和 gluB的系统发育分析
以 P. polymyxaSC2的2个ORF的序列在GenBank中分别进行序列比对,把相似性较高的序列用ClustalX
软件进行分析,用邻接法自展 1 000次,
TREECONW建树程序做成系统发育树。结果表
明,在系统发育树中,ORF1的 序列与 P.
polymyxa ATCC 842的 β-1,4-木聚糖酶基因
xynD聚在最近的分支内,说明两者亲源关系
较 近 (图 5);ORF2的 序 列 与 P. polymyxa
WY110的 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因 gluB聚在
最近的分支内,说明两者亲源关系较近(图6)。
3 讨论
多粘类芽孢杆菌 SC2能同时产生 β-1,4-
木聚糖酶和 β-1,3-1,4-葡聚糖酶。以 SC2的
基因组 DNA为模板,采用 TAIL-PCR方法,克
隆到 β-1,4-木聚糖酶基因 xynD和 β-1,3-
1,4-葡聚糖酶基因 gluB。对 SC2的 β-1,4-木
聚糖酶基因 xynD和 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基
因 gluB的克隆和分析,从分子水平上证实,
该菌株能利用 β-1,4-木聚糖和 β-1,3-1,4-葡
聚糖。P. polymyxa SC2能以环境中的 β-1,4-
木聚糖或 β-1,3-1,4-葡聚糖为唯一碳源,意
味着其具有广泛的环境适应性。姚乌兰等[10]
研究发现,P. polymyxa WY110的 β-1,3-1,4-
葡聚糖酶基因 gluB的编码产物具有抗真菌活
性;据此推测,P. polymyxa SC2的 β-1,3-1,4-
葡聚糖酶基因 gluB也可能与其抗真菌能力有
关。
β-1,4-木聚糖酶和 β-1,3-1,4-葡聚糖酶具有广泛的应用领域,P. polymyxa SC2的 ynD和 gluB基因的
克隆与分析为构建相应的高效产酶基因工程菌株奠定了基础。
参考 文献
1 HenryRJ. Journal ofthe Science ofFood and Agriculture,1985,36(12):1243~1253.
2 BielyP. Trends in Biotechnology,1985,3(11):286~290.
3 Coughlan MP. Biotechnology&Genetic EngineeringReviews,1985,3:39~109.
图 5 几个细菌的 β-1, 4-木聚糖酶基因序列的系统发育分析
图 6 几个细菌的 β-1, 3-1, 4-葡聚糖酶基因序列的系统发育分析
基于 β-1, 4-木聚糖酶基因序列的系统发育树,自展 1000次,只显示自
展值大于 50%的数值,横线代表核酸的距离,括号内为该基因的收录号
基于 β-1, 3-1, 4-葡聚糖酶基因序列的系统发育树,自展 1 000次,只显示
自展值大于 50%的数值,横线代表核酸的距离,括号内为该基因的收录号
(下转第184页)
174
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
(上接第174页)
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
4 ColinsT,GerdayC,FelerG.FEMSMicrobiologyReviews,2005,29(1):3~23.
5 怀文辉,何秀萍,郭文洁,等.微生物学通报,2000,27(2):137~139.
6 EkaQV,FogartyWM.AppliedMicrobiologyandBiotechnology,1975,1(1):13~23.
7 BairdSD,JohnsonDA,SeligyVL.JournalofBacteriology,1990,172(3):1576~1586.
8 PriestFG.BacteriologicalReviews,1977,41(3):711~753.
9 GosalbesMJ,Perez-GonzalezJA,GonzalezR,etal.JournalofBacteriology,1991,173(23):7705~7710.
10 姚乌兰,王云山,韩继刚,等.遗传学报,2004,31(9):878~887.
11 ItoY,TomitaT,RoyN,etal.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2003,69(12):6969~6978.
12 萨姆布鲁克 J,拉塞尔 DW.分子克隆实验指南(第 3版).北京:科学出版社,2002.
13 CantwelBA,McConnelDJ.Gene,1983,23(2):211~219.
14 奥斯伯 F,布伦特 R,金斯顿 RE,等.精编分子生物学实验指南.北京:科学出版社,1998:39.
15 LiuYG,WhitierRF.Genomics,1995,25:674~681.
时 ITS序列长度适中,序列中有足够的信息,可广泛用于属内种间或种内群体的系统学研究[9]。
以 5.8SrRNA基因和 28SrRNA基因的保守序列设计真菌通用引物,可扩增真菌 5.8SrDNA部分序列、
ITS2全序列、28SrDNA的部分序列。结果表明,本实验设计的引物以及建立的真菌 rRNA基因通用扩增方
法,具有较好的真菌通用性和特异性,对 9种酵母菌以及曲霉菌、毛霉菌进行扩增,一步扩增出各种真菌的
相应基因片断,而临床常见致病性细菌的扩增结果均为阴性。以位于 5.8S和 28SrDNA之间的内转录间隔
区(ITS2)序列设计种特异性探针,制备杂交膜对产物进行杂交验证,用于真菌的鉴别。试验结果显示,所选
用的探针均能检测出相应的靶序列,每张膜上只有与靶序列对应的探针点有阳性结果,其他探针点均为阴
性。9种真菌的 PCR产物与膜 9杂交,在特异性探针位点上均出现杂交斑点,表明此方法可检测几种菌的
混合感染。对 30例临床分离酵母菌菌株鉴定结果与临床常规鉴定结果一致,由于尚未设计霉菌检测探针,
因此,4株曲霉菌和 1株毛霉菌 PCR扩增结果为阳性,杂交结果均为为阴性。另外,40株临床常见细菌检
测结果均为阴性。结果表明,试验中设计使用的探针未有非特异性的交叉反应,可以对真菌进行种间分型
检测,显示了较好的特异性和敏感性。
因此,采用的方法灵敏度高,特异性强,操作简单,且杂交膜可以预先制备待用,可大大缩短检测时间,
从模板制备到完成杂交检测,整个过程当日可完成。不需要特殊仪器设备,适合临床开展。而且还可以根据
检测需要继续添加特异性探针,在通用 PCR扩增的条件下对更多的病原性真菌进行分型诊断。
参考 文献
1 GiamarelouH,AntoniadouA.InfectControlHospEpidemiol,1996,17(8):558~64.
2 Beck-SagueC,JarvisWR.JInfectDis,1993,167(6):1247~1251.
3 李民,王家俊.国外医学:微生物学分册,2002,25(5):34~36.
4 潘继红,韩金祥.生物技术通讯,2003,14(l):12~15.
5 胡晓红,刘昕,黄正根,等.第三军医大学学报,2006,28(7):734~735.
6 ZhuH,QuF,ZhuLH.NecleicAcidsRes,1993,21(22):5279~5284.
7 PfalhrM,DiekemaDJ,JonesRN,etal.JClinMicrobiol,2001,39(9):3254~3259.
8 VazquezJA,SanchezV,DmuchowskiC,etal.JInfectDis,1993,168(1):195~198.
9 IwenPC,HinrichsSH,RuppME.MedMycol,2002,40(1):87~109.
184