全 文 ：甘肃省紫花苜蓿种带促生多粘类
芽孢杆菌的分离与鉴定
张振粉，南志标
（草地农业生态系统国家重点实验室 兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州７３００２０）
摘要：对来自甘肃省１３个紫花苜蓿种植区的３９份种子样品进行种带细菌分离，经表型特征和Ｂｉｏｌｏｇ鉴定，将 ＨＴ
ＢＲＣ１、ＨＴＢＲＣ２、ＨＴＢＲＣ３、ＨＴＢＲＣ４、ＨＴＢＲＣ５、ＨＴＢＲＣ６、ＨＴＢＲＣ７和 ＨＴＢＲＣ８初步鉴定为多粘类芽孢杆菌。
通过菌种浸种发芽试验发现多粘类芽孢杆菌 ＨＴＢＲＣ１对紫花苜蓿具有促进生长的作用。试验探明了多粘类芽孢
杆菌在甘肃省不同紫花苜蓿种植区所收获种子上的分布；发现分离于紫花苜蓿种子表皮及内部的多粘类芽孢杆菌
具有较高耐盐性；为苜蓿生产提供了优质菌种资源及其理论基础。
关键词：甘肃省；紫花苜蓿；种带细菌；多粘类芽孢杆菌
中图分类号：Ｓ８１６；Ｓ５４１＋．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１４）０５０２５６０７
犇犗犐：１０．１１６８６／ｃｙｘｂ２０１４０５３０
多粘类芽孢杆菌（犘犪犲狀犻犫犪犮犻犾犾狌狊狆狅犾狔犿狔狓犪）原属于多粘芽孢杆菌（犅犪犮犻犾犾狌狊狆狅犾狔犿狔狓犪），Ａｓｈ等［１］于１９９３年
将其新归于类芽孢杆菌属。多粘类芽孢杆菌是一种植物非致病性产椭圆形芽孢的革兰氏阳性细菌，可以从土壤、
小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）和牧草根际中分离得到［１］。多粘类芽孢杆菌是一种功能性极强的微生物，具有分泌植
物激素（如细胞分裂素、吲哚乙酸等）和提供氮素等特性，促进植物生长［２５］；Ｚｈａｏ等［６］从黄瓜（犆狌犮狌犿犻狊狊犪狋犻狏狌狊）
根际土壤中分离的多粘类芽孢杆菌 ＢＭＰ１１菌株提取了可以抗真菌，抗虫和除草活性的挥发性化学物质；Ｌａｉ
等［７］研究发现，从越南槐（犛狅狆犺狅狉犪狋狅狀犽犻狀犲狀狊犻狊）分离得到的多粘类芽孢杆菌ＳＧ６菌株同样具有防止柑橘（犆犻狋狉狌狊
狉犲狋犻犮狌犾犪狋犪）采后发霉的作用；同时它还能产生肽类［８９］、蛋白质类［１０］、核苷类［１１］、吡嗪类［１２］和酚类［２，１３］等多种抗菌
物质，防治多种植物病害［１４１９］。童蕴慧等［２０］将多粘类芽孢杆菌 Ｗ３、Ｙ２菌株和地衣芽胞杆菌（犅犪犮犻犾犾狌狊犾犻犮犺犲狀犻
犳狅狉犿犻狊）Ｗ１０菌株接种致病番茄（犔狔犮狅狆犲狉狊犻犮狅狀犲狊犮狌犾犲狀狋狌犿）后，诱导其植株对灰霉病菌（犅狅狋狉狔狋犻狊犮犻狀犲狉犲犪）产生系
统抗性。此外，由于出色的固氮能力，多粘类芽孢杆菌还可被应用于消除油菜（犅狉犪狊狊犻犮犪犮犪犿狆犲狊狋狉犻狊）体内的有害
硝酸盐，从而提高油菜品质［２１］。多粘类芽孢杆菌是被美国环境保护署（ＥＰＡ）列为可商业应用的微生物种类之
一，我国农业部也将其列为免做安全鉴定的一级菌种，目前报道该菌可用于农业、工业和水处理等方面［２２］。
紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）在我国已有２０００多年的栽培历史，是重要的多年生豆科牧草，以其产量高，具
有保持水土和改善土壤结构的功能，是北半球温带地区最主要的牧草、草田轮作的首选豆科牧草，在农牧业生产
中有着不可替代的作用［２３２４］。李春杰和南志标［２５］系统研究了苜蓿种带真菌的区系及其致病性。郭玉霞等［２６］对
黄土高原区苜蓿与小麦轮作系统根部入侵真菌进行了详细研究。有关紫花苜蓿种带细菌区系的研究在国内尚属
空白，本研究以甘肃省不同紫花苜蓿产地的种子为材料，分离其细菌区系，经发芽试验筛选了一种促进苜蓿生长
的细菌。Ｂｉｏｌｏｇ及生理生化分析确定该菌株属于多粘类芽孢杆菌，紫花苜蓿种子发芽试验测定结果显示该菌株
具有促进苜蓿苗生长的作用。该菌株的分离与鉴定对于探讨甘肃省不同紫花苜蓿种植区有益菌多粘类芽孢杆菌
的生态分布提供了理论基础，并为紫花苜蓿在草地早期建植的应用提供了新的菌种资源。
２５６－２６２
２０１４年１０月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第２３卷 第５期
Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．５
收稿日期：２０１２０６１４；改回日期：２０１２０７０９
基金项目：９７３项目课题（２０１４ＣＢ１３８７０４）和国家牧草产业技术体系（病虫害防控室主任、病害防控岗位科学家）资助。
作者简介：张振粉（１９８４），男，福建霞浦人，博士。Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｚｆ＿１０＠ｌｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｚｈｉｂｉａｏ＠ｌｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
１ 材料与方法
１．１ 材料
１）种样
供试种样源自农业部牧草与草坪草种子质量监督检验测试中心（兰州）低温种质资源库的１３种不同产地和
不同收获年限的紫花苜蓿种子，每种各３份，共计３９份（表１）。
表１ 紫花苜蓿种子收获年份和地点及其地理气候信息
犜犪犫犾犲１ 犎犪狉狏犲狊狋狋犻犿犲犪狀犱犺犪狉狏犲狊狋犾狅犮犪狋犻狅狀狅犳犕．狊犪狋犻狏犪狊犲犲犱狊犪犿狆犾犲狊犪狀犱狋犺犲犻狉犵犲狅犵狉犪狆犺犻犮犪犾犪狀犱犮犾犻犿犪狋犻犮犻狀犳狅狉犿犪狋犻狅狀
地点
Ｌｏｃａｔｉｏｎ
年份
Ｙｅａｒ
地理坐标
Ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ
年均温
Ａｖｅｒａｇｅａｎｎｕａｌｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（℃）
年降水量
Ａｎｎｕａｌｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ（ｍｍ）
酒泉ＪｉｕｑｕａｎＣｉｔｙ ２００３ ９８．４８３°Ｅ，３９．７６７°Ｎ ７．２ ８７．６
临泽ＬｉｎｚｅＣｏｕｎｔｙ ２００２ １００．１６７°Ｅ，３９．１５°Ｎ ７．７ １１４．５
肃南ＳｕｎａｎＣｏｕｎｔｙ ２００８ １００．４３３°Ｅ，３８．９３３°Ｎ ７．０ １２７．５
武威 ＷｕｗｅｉＣｉｔｙ ２００２ １０２．６６７°Ｅ，３７．９１７°Ｎ ７．７ １６３．９
景泰ＪｉｎｇｔａｉＣｏｕｎｔｙ ２００８ １０４．０５°Ｅ，３７．１８３°Ｎ ８．３ １８５．７
会宁 ＨｕｉｎｉｎｇＣｏｕｎｔｙ ２００６ １０５．０８３°Ｅ，３５．６８３°Ｎ ６．４ ４３５．４
定西ＤｉｎｇｘｉＣｏｕｎｔｙ ２００４ １０４．６１７°Ｅ，３５．５８３°Ｎ ６．４ ４１３．９
通渭ＴｏｎｇｗｅｉＣｏｕｎｔｙ ２００９ １０５．２３３°Ｅ，３５．２１７°Ｎ ６．６ ４２７．１
玛曲 ＭａｑｕＣｏｕｎｔｙ ２００９ １０２．９°Ｅ，３５°Ｎ ２．１ ５４５．７
环县 ＨｕａｎｘｉａｎＣｏｕｎｔｙ ２００４ １０７．３°Ｅ，３６．５８３°Ｎ ８．６ ４２０．０
庆阳ＱｉｎｇｙａｎｇＣｉｔｙ ２００６ １０７．９°Ｅ，３５．９８３°Ｎ ９．４ ５３５．０
西峰ＸｉｆｅｎｇＣｏｕｎｔｙ ２００４ １０７．６３３°Ｅ，３５．７３３°Ｎ ８．３ ５７３．０
灵台ＬｉｎｇｔａｉＣｏｕｎｔｙ ２００９ １０７．６５°Ｅ，３５．０１°Ｎ ８．２ ３７６．０
注：年均温和年降水量数据为２００１－２００９年平均值。
Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅｄａｔａｏｆａｖｅｒａｇｅａｎｎｕａｌｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｎｄａｎｎｕａｌｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎａｒｅｔｈｅｍｅａｎｏｆ２００１－２００９．
２）培养基
分离、纯化及活化分离物的培养基为肉汁胨培养基（ＮＡ）（蛋白胨１０ｇ，牛肉膏３ｇ，氯化钠５ｇ，琼脂１８ｇ，蒸
馏水１Ｌ，１２１℃下灭菌３０ｍｉｎ）和固氮能力测试所用培养基为阿须贝培养基（Ａｓｈｂｙｍｅｄｉｕｍ）（葡萄糖：１０ｇ，
ＫＨ２ＰＯ４０．２ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．２ｇ，ＮａＣｌ０．２ｇ，ＣａＳＯ４·２Ｈ２Ｏ０．２ｇ，ＣａＣＯ３５．０ｇ，蒸馏水１Ｌ，１１３℃下灭菌
３０ｍｉｎ）［２７］。
１．２ 方法
１）细菌的分离
种子表面消毒分离：各产地紫花苜蓿种子称取１ｇ为样品，经７５％乙醇２ｍｉｎ和１％ 次氯酸钠５ｍｉｎ进行表
面消毒，继之以无菌水冲洗４～５次［２８］。将表面消毒后的苜蓿种子置于灭菌的研钵中研碎，转移种子粉末至装有
１００ｍＬ无菌蒸馏水的２５０ｍＬ的三角瓶中于恒温摇床２５℃、１００ｒ／ｍｉｎ震荡５ｍｉｎ，随后取１ｍＬ悬浮液制成不
同浓度梯度（１０－１，１０－２和１０－３），每个梯度取２００μＬ，转置ＮＡ培养基中央涂抹，使之均匀地布满整个培养基，
重复３～４皿，（２８±１）℃下培养３ｄ。
种子发芽分离及冲洗分离：将紫花苜蓿种子样品浸泡于１００ｍＬ无菌蒸馏水的三角瓶（２５０ｍＬ）中，于恒温摇
床２５℃、１５０ｒ／ｍｉｎ震荡１０ｍｉｎ，取１ｍＬ悬浮液制成不同浓度梯度（１０－１，１０－２和１０－３），每梯度取２００μＬ涂板，
重复３～４皿，（２８±１）℃下培养３ｄ。
在上述培养平板上挑取相似细菌分离物单菌落，对其进行编号，纯化后在－８０℃添加甘油的ＮＡ培养基中长
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期保存和４℃下ＮＡ培养基中短期保存。
２）Ｂｉｏｌｏｇ鉴定
纯化得到的８株细菌分离物ＨＴＢＲＣ１～８和购于中国农业微生物菌种保藏管理中心的多粘类芽孢杆菌模
式菌株ＡＣＣＣ１０２５２于ＮＡ平板２８℃活化培养２４ｈ后备用，按照Ｂｉｏｌｏｇ自动快速微生物鉴定系统（ＢｉｏｌｏｇＩｎｃ．，
Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）说明书操作。根据２００６年的数据库显示，Ｂｉｏｌｏｇ能鉴定革兰氏阴性菌５２４种（１０６个属）和革兰
氏阳性菌３５１种（５５个属）。此实验于２０１１年１２月，在草地农业生态系统国家重点实验室草类病理实验室进
行。
３）表型鉴定
纯化得到的８株细菌分离物 ＨＴＢＲＣ１～８和 ＡＣＣＣ１０２５２菌株，参照《常见细菌系统鉴定手册》［２９］和
《Ｂｅｒｇｅｙ’ｓＭａｎｕａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ》［３０］对其进行菌体形态观察并照相（ＢｉｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅＯｌｙｍｐｕｓ
ＢＸ５１），革兰氏染色反应，鞭毛染色反应以及厌氧生长试验、接触酶试验、氧化酶试验、硝酸还原试验、淀粉水解试
验、明胶液化试验、硝酸盐还原试验、Ｖ－Ｐ试验、吲哚试验和糖醇类发酵等生理生化指标测定。
４）发芽试验
将ＮＡ平板２８℃培养２４ｈ后的代表细菌分离物 ＨＴＢＲＣ１制成１０８ｃｆｕ／ｍＬ菌悬液。取１ｇ紫花苜蓿种子
（阿尔冈金品种）浸泡于ＨＴＢＲＣ１的悬浮液中５ｍｉｎ后，设种子浸泡于无菌水为对照，取出后于无菌滤纸上自然
晾干。将晾干的种子参照ＧＢ／Ｔ２９３０．４２００１进行发芽，４ｄ后开始统计发芽率，测量根长和苗长，并观察真菌侵
染种子发芽现象。整个试验重复２次。
１．３ 统计分析
采用ＳＰＳＳ１３．０软件进行方差分析和显著性测定，试验中的发芽率数据是经反正弦转换所得，方差分析采用
独立样本Ｔ检验。
２ 结果与分析
２．１ 细菌的分离
试验从１３个不同苜蓿种子产地的８个中，分离得到在ＮＡ培养基上形成粉红色，隆起，粘稠状，具有很强的
粘性，表面湿润光滑边缘整齐的细菌分离物（图１Ａ）；革兰氏染色阳性，菌体杆状，大小为０．５～２．５μｍ×１．２～１０
μｍ（图１Ｂ）。我们将这８个产地分离得到的代表性分离物进行编号后备用，它们分别为 ＨＴＢＲＣ１、ＨＴＢＲＣ２、
ＨＴＢＲＣ３、ＨＴＢＲＣ４、ＨＴＢＲＣ５、ＨＴＢＲＣ６、ＨＴＢＲＣ７和ＨＴＢＲＣ８（表２）。
图１ 细菌分离物犎犜犅犚犆１～８的形态特征
犉犻犵．１ 犜犺犲犿狅狉狆犺狅犾狅犵狔犮犺犪狉犪犮狋犲狉犻狊狋犻犮狅犳犫犪犮狋犲狉犻犪犾犻狊狅犾犪狋犲狊犎犜犅犚犆１－８
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２．２ Ｂｉｏｌｏｇ鉴定
８株分离自苜蓿的细菌分离物ＨＴＢＲＣ１～８和在ＢｉｏｌｏｇＧＰ２鉴定板上培养４～６ｈ时与Ｂｉｏｌｏｇ数据库比对
结果显示为“ＮＯＩＤ”，培养２０ｈ时它们与Ｂｉｏｌｏｇ数据库中的多粘类芽孢杆菌相似度为０．５３３～０．８８０。根据Ｂｉ
ｏｌｏｇ自动快速微生物鉴定系统（ＢｉｏｌｏｇＩｎｃ．，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）说明，相似度于菌株培养４～６ｈ时≥０．７５，鉴定结
果可靠；相似度于菌株培养１６～２４ｈ时≥０．５，鉴定结果可靠。表２结果显示与培养２０ｈ时它们在Ｂｉｏｌｏｇ数据
库中的多粘类芽孢杆菌相似度均大于０．５，说明结果可靠。因此，根据Ｂｉｏｌｏｇ鉴定结果，ＨＴＢＲＣ１～８均初步鉴
定为多粘类芽孢杆菌。
表２ 紫花苜蓿种带细菌分离物和犃犆犆犆１０２５２菌株来源及其犅犻狅犾狅犵鉴定结果
犜犪犫犾犲２ 犛狅狌狉犮犲狅犳犕．狊犪狋犻狏犪狊犲犲犱犫狅狉狀犲犫犪犮狋犲狉犻犪犾犻狊狅犾犪狋犲狊犪狀犱犃犆犆犆１０２５２狊狋狉犪犻狀犪狀犱狋犺犲犻狉狉犲狊狌犾狋狊狅犳犅犻狅犾狅犵犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀
菌种编号
Ｓｔｒａｉｎｃｏｄｅ
菌株Ｓｏｕｒｃｅｏｆｓｔｒａｉｎｓ
地点Ｌｏｃａｔｉｏｎ 分离方式Ｉｓｏｌａｔｅｍｅｔｈｏｄ
Ｂｉｏｌｏｇ鉴定
Ｂｉｏｌｏｇｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｂｉｏｌｏｇ相似度（培养２０ｈ后）
Ｂｉｏｌｏｇｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ（Ｃｕｌｔｕｒｅｄａｆｔｅｒ２０ｈ）
ＡＣＣＣ１０２５２ 中国农业微生物菌种保藏管理中心
ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｅｃｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ
多粘类芽孢杆菌犘．狆狅犾狔犿狔狓犪 ０．８８
ＨＴＢＲＣ１ 玛曲 ＭａｑｕＣｏｕｎｔｙ ＮＳ＆Ｓ 多粘类芽孢杆菌犘．狆狅犾狔犿狔狓犪 ０．６８
ＨＴＢＲＣ２ 环县 ＨｕａｎｘｉａｎＣｏｕｎｔｙ Ｓ 多粘类芽孢杆菌犘．狆狅犾狔犿狔狓犪 ０．７３
ＨＴＢＲＣ３ 西峰ＸｉｆｅｎｇＣｏｕｎｔｙ Ｓ 多粘类芽孢杆菌犘．狆狅犾狔犿狔狓犪 ０．８６
ＨＴＢＲＣ４ 会宁 ＨｕｉｎｉｎｇＣｏｕｎｔｙ Ｓ 多粘类芽孢杆菌犘．狆狅犾狔犿狔狓犪 ０．５３
ＨＴＢＲＣ５ 定西ＤｉｎｇｘｉＣｏｕｎｔｙ Ｓ 多粘类芽孢杆菌犘．狆狅犾狔犿狔狓犪 ０．７６
ＨＴＢＲＣ６ 通渭ＴｏｎｇｗｅｉＣｏｕｎｔｙ Ｓ 多粘类芽孢杆菌犘．狆狅犾狔犿狔狓犪 ０．８０
ＨＴＢＲＣ７ 庆阳ＱｉｎｇｙａｎｇＣｉｔｙ Ｓ 多粘类芽孢杆菌犘．狆狅犾狔犿狔狓犪 ０．７３
ＨＴＢＲＣ８ 临泽ＬｉｎｚｅＣｏｕｎｔｙ Ｓ 多粘类芽孢杆菌犘．狆狅犾狔犿狔狓犪 ０．５７
ＮＳ表示未经表面消毒，Ｓ表示经表面消毒。
ＮＳｍｅａｎｓ犕．狊犪狋犻狏犪ｓｅｅｄｓｗｅｒｅｎｏｔｓｕｒｆａｃｅｓｔｅｒｉｌｅｄ，Ｓｍｅａｎｓ犕．狊犪狋犻狏犪ｓｅｅｄｓｗｅｒｅｓｕｒｆａｃｅｓｔｅｒｉｌｅｄ．
２．３ 生理生化鉴定
８株分离自苜蓿的细菌分离物ＨＴＢＲＣ１～８和ＡＣＣＣ１０２５２菌株的生理生化指标详见表３。这８个细菌分
离物与ＡＣＣＣ１０２５２菌株生理生化指标基本相似，其最大的特点是较模式菌株具有更高的盐耐受性和固氮能力，
它们可在添加５％ ＮａＣｌ的ＮＡ平板上生长并在阿须贝无氮培养基连续生长３代以上。根据《常见细菌系统鉴定
手册》［２９］和《Ｂｅｒｇｅｙ’ｓＭａｎｕａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ》［３０］初步鉴定ＨＴＢＲＣ１～８为多粘类芽孢杆菌。
２．４ 发芽试验
用代表菌株 ＨＴＢＲＣ１菌悬液浸种后，苜蓿种子的发芽率和发芽势较未浸泡过的显著增加，根长均具有显著
提高（犘＜０．０５），苗长有小幅增长，但差异不显著（犘＞０．０５）（图２）。此外，经菌悬液浸泡过的种子在发芽过程中
肉眼未见种带致病真菌危害苜蓿芽的生长，相反未经菌悬液浸泡过的种子在发芽过程中有真菌侵染现象。
３ 讨论
本研究首次于紫花苜蓿种子上分离得到多粘类芽孢杆菌，发现了该菌可于种子表面及内部存活，新记录了该
菌的生境。这些紫花苜蓿种子分别是２００２，２００４，２００６和２００９年入库的，来自位处河西走廊的临泽，黄土高原的
环县和西峰等，以及青藏高原的玛曲。由此可知，该菌可在紫花苜蓿种子上存活达１０年之久，它在甘肃省不同紫
花苜蓿种植区的分布与年降水量和年均温没有明显的关系。该菌可以从土壤、小麦和牧草根际中分离得到［１］，因
此它的分布可能与当地土壤类型或牧草与小麦等农作物轮作，套作等方式相关。
本试验８个细菌分离物的生理生化鉴定与Ｂｉｏｌｏｇ鉴定结果一致，初步鉴定ＨＴＢＲＣ１～８菌株均为多粘类芽
孢杆菌。该试验结果验证了Ｂｉｏｌｏｇ自动快速微生物鉴定系统相似度于菌株培养４～６ｈ时≥０．７５时或菌株培养
９５２第２３卷第５期 草业学报２０１４年
图２ 多粘类芽孢杆菌浸种１４犱后的紫花苜蓿种子
发芽势和发芽率（犃）以及根长和苗长（犅）
犉犻犵．２ 犌犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀犻狀犱犲狓犪狀犱狆犲狉犮犲狀狋狅犳狊犲犲犱犵犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀（犃）
犪狀犱狊犺狅狅狋犪狀犱狉狅狅狋犾犲狀犵狋犺（犅）狅犳犾狌犮犲狉狀犲狊犲犲犱狊犪犳狋犲狉
狊狅犪犽犲犱狑犻狋犺犘．狆狅犾狔犿狔狓犪犪犳狋犲狉１４犱
Ｐ＋：多粘类芽孢杆菌 ＨＴＢＲＣ１拌种处理；ＣＫ：无菌水对照处理；不同
小写字母表示处理间差异显著（犘＜０．０５）。Ｐ＋：犘．狆狅犾狔犿狔狓犪ＨＴＢＲＣ１
ｓｏａｋｅｄｔｒｅａｔｍｅｎｔ；ＣＫ：Ｓｔｅｒｉｌｅｗａｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ；Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｏｗｅｒｃａｓｅｓｉｎｄｉ
ｃａｔｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｔｒｅａｔｍｅｎｔ（犘＜０．０５）．
１６～２４ｈ时≥０．５时，鉴定结果可靠。表型鉴定进一
步验证了Ｂｉｏｌｏｇｙ鉴定的可靠性。Ｂｉｏｌｏｇ技术因其数
据库容量大，种类齐全；鉴定结果准确率高；鉴定周期
短，最快４个小时出结果；操作简单，对操作者技术要
求不高等特点。已在临床、食品、植物病理、微生物生
态、兽医等领域得到广泛应用［３１３２］。
分离于紫花苜蓿种子的多粘类芽孢杆菌 ＨＴＢＲＣ
１～８具有比多粘类芽孢杆菌ＡＣＣＣ１０２５２更强的耐
盐性。但使用多粘类芽孢杆菌 ＨＴＢＲＣ１等浸泡的紫
花苜蓿种子，是否将更能适应盐渍地帮助紫花苜蓿度
过较高盐浓度的胁迫，有待进一步的研究。在试验过
程中用代表菌株多粘类芽孢杆菌 ＨＴＢＲＣ１浸泡过的
种子比未浸泡的种子具有更好的发芽率，发芽势，根长
和苗长，这将有助于紫花苜蓿在自然生态环境下形成
建植优势。本试验证明了多粘类芽孢杆菌可以促进紫
花苜蓿生长，该实验结果与国内外报道的多粘类芽孢
表３ 紫花苜蓿种带菌株犎犜犅犚犆１～８和多粘类芽孢杆菌
犃犆犆犆１０２５２的表型特征
犜犪犫犾犲３ 犘犺犲狀狅狋狔狆犻犮犮犺犪狉犪犮狋犲狉犻狊狋犻犮狊狅犳犎犜犅犚犆１－８犳狉狅犿
犕．狊犪狋犻狏犪狊犲犲犱狊犪狀犱犘．狆狅犾狔犿狔狓犪犃犆犆犆１０２５２
特征
Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ
多粘类芽孢杆菌
ＡＣＣＣ１０２５２
犘．狆狅犾狔犿狔狓犪
ＡＣＣＣ１０２５２
ＨＴＢＲＣ１－８
苜蓿种带
犕．狊犪狋犻狏犪ｓｅｅｄ
ｂｏｒｎｅｓｔｒａｉｎ
革兰氏染色Ｇｒａｍｓｔａｉｎ ＋ ＋
芽孢形状Ｓｐｏｒｅｓｈａｐｅ ｏｖａｌ ｏｖａｌ
孢子囊肿胀Ｓｗｏｌｅｎｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ＮＤ ＮＤ
伴胞晶体Ｐａｒａｓｐｏｒａｌｃｒｙｓｔａｌ ＮＤ ＮＤ
厌氧生长Ａｎａｅｒｏｂｉｃｇｒｏｗｔｈ ＋ ＋
接触酶Ｃａｔａｌａｓｅ ＋ ＋
氧化酶Ｏｘｉｄａｓｅ ｖ －
硝酸盐还原Ｎｉｔｒａｔｅｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ＋ ＋
Ｖ－Ｐ反应Ｖｏｇｅｓ－Ｐｒｏｋａｕｅｒ ＋ ＋
水解 Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｏｆ：
酪蛋白Ｃａｓｅｉｎ ＋ ＋
淀粉Ｓｔａｒｃｈ ＋ ＋
明胶Ｇｅｌａｔｉｎ ＋ ＋
七叶灵Ｅｓｃｕｌｉｎ ＋ ＋
尿素Ｕｒｅａ － －
降解酪氨酸Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｔｙｒｏｓｉｎｅ － －
产吲哚Ｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｉｎｄｏｌｅ － －
利用柠檬酸 Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｃｉｔｒａｔｅ
（ｓｉｍｍｏｎｓ）
－ －
最佳生长温度Ｏｐｔｉｍａｌｇｒｏｗｔｈ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（℃）
３０ ３０
生长于５０℃ Ｇｒｏｗｔｈａｔ５０℃ － －
耐盐性ＧｒｏｗｔｈｉｎＮａＣｌ：
２％ ｖ ＋
５％ － ＋
７％ － －
产酸Ａｃｉｄｆｒｏｍ：
阿拉伯糖ＬＡｒａｂｉｎｏｓｅ ＋＋ ＋＋
葡萄糖ＤＧｌｕｃｏｓｅ ＋＋ ＋＋
甘油Ｇｌｙｃｅｒｏｌ ＋＋ ＋＋
甘露醇ＤＭａｎｎｉｔｏｌ ＋＋ ＋＋
木糖ＤＸｙｌｏｓｅ ＋＋ ＋＋
固氮Ｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘａｔｉｏｎｂ ＮＤ ＋
注：＋，≥９０％菌株为阳性；－，≥９０％菌株为阴性；＋＋，产酸和产
气；ｖ，菌株间不稳定的反应；ＮＤ，未测定；ｏｖａｌ，卵圆形的。ｂ：采用阿须贝
无氮培养基连续培养３代以上。
Ｎｏｔｅ：＋，ｐｏｓｉｔｉｖｅｒｅａｃｔｉｏｎｆｏｒａｌｏｒｍｏｒｅｔｈａｎ９０％ｏｆｔｈｅｓｔｒａｉｎｓ
ｔｅｓｔｅｄ；－，ｎｅｇａｔｉｖｅｒｅａｃｔｉｏｎｆｏｒａｌｏｒｌｅｓｓｔｈａｎ１０％ｏｆｔｈｅｓｔｒａｉｎｓｔｅｓｔ
ｅｄ；＋＋，ａｃｉｄａｎｄｇａｓｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ；ｖ，ｖａｒｉａｂｌｅ；ＮＤ，ｎｏｔｄａｔａ．ｂ：Ｕ
ｓｉｎｇｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｃｕｌｔｕｒｅｆｏｒｍｏｒｅｔｈａｎｔｈｒｅｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ
ｏｎＡｓｈｂｙｍｅｄｉｕｍ．
０６２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．５
杆菌具有促进植物生长的结果一致［４，１３，１７，３３］；并在试验过程发现未经多粘类芽孢杆菌菌悬液浸泡过的苜蓿种子
在发芽试验中有真菌侵染苜蓿芽，影响其发芽的现象，但未鉴定其苜蓿芽侵染真菌的种类，有待后续研究多粘类
芽孢杆菌对病原真菌的拮抗作用及其机制。
本研究首次明确了多粘类芽孢杆菌在甘肃省不同紫花苜蓿种植区所收获种子上的分布。分离自紫花苜蓿种
子表皮及内部的多粘类芽孢杆菌具有较高耐盐性和促进紫花苜蓿生长的新特性。本研究为苜蓿生产提供了菌种
资源及其理论基础。
致谢：承蒙兰州大学草地农业科技学院王彦荣教授惠赠紫花苜蓿种子资源和曾彦军副教授在种子选择时给予的
有益建议，甘肃农业大学陈秀蓉教授和杨成德及兰州大学草地农业科技学院段廷玉副教授在技术方面，兰州大学
草地农业科技学院王玮和邹德福在气象数据方面提供的帮助，谨此一并致谢。
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犿狔狓犪ｓｔｒａｉｎｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｒｏｘｉｍｉｔｙｔｏｐｌａｎｔｒｏｏｔｓ［Ｊ］．ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＥｃｏｌｏｇｙ，１９９７，２２：３２５３３４．
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ｇｒｏｗｔｈｐｒｏｍｏｔｉｎｇｒｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉａ犘犪犲狀犻犫犪犮犻犾犾狌狊狆狅犾狔犿狔狓犪ａｎｄ犘．犿犪犮犲狉犪狀狊ｉｎｔｈｅｍｙｃｏｒｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅｏｆ犆狌犮狌犿犻狊狊犪狋犻狏狌狊［Ｊ］．
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犘犪犲狀犻犫犪犮犻犾犾狌狊狆狅犾狔犿狔狓犪犻狀犌犪狀狊狌犘狉狅狏犻狀犮犲，犆犺犻狀犪
ＺＨＡＮＧＺｈｅｎｆｅｎ，ＮＡＮＺｈｉｂｉａｏ
（ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＧｒａｓｓｌａｎｄＡｇｒｏｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣｏｌｅｇｅｏｆＰａｓｔｏｒａｌＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＳｃｉｅｎｃｅ
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犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｔｈｉｒｔｙｎｉｎｅｓｅｅｄｓａｍｐｌｅｓｆｒｏｍ１３ｌｕｃｅｒｎｅｇｒｏｗｉｎｇａｒｅａｓｏｆＧａｎｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅｗｅｒｅｃｏｌｅｃｔｅｄａｎｄｉｓｏｌａｔｅｄ
ｆｏｒｓｅｅｄｂｏｒｎｅｂａｃｔｅｒｉａ．ＡｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＨＴＢＲＣ１，ＨＴ
ＢＲＣ２，ＨＴＢＲＣ３，ＨＴＢＲＣ４，ＨＴＢＲＣ５，ＨＴＢＲＣ６，ＨＴＢＲＣ７ａｎｄＨＴＢＲＣ８ｗｅｒｅｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓ
犘犪犲狀犻犫犪犮犻犾犾狌狊狆狅犾狔犿狔狓犪．ＡｇｒｏｗｔｈｐｒｏｍｏｔｉｏｎｆｕｎｃｔｉｏｎｆｏｌｏｗｉｎｇｓｏａｋｉｎｇｗｉｔｈｓｔｒａｉｎｓＨＴＢＲＣ１ｗａｓｆｏｕｎｄｉｎａ
ｌｕｃｅｒｎｅｓｅｅｄｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｔｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｓｃｅｒｔａｉｎｅｄｔｈｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｌｕｃｅｒｎｅｓｅｅｄｂｏｒｎｅ犘．
狆狅犾狔犿狔狓犪ｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｒｅｇｉｏｎｓｏｆＧａｎｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅａｎｄｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ犘．狆狅犾狔犿狔狓犪ｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｅｐ
ｉｄｅｒｍｉｓａｎｄｉｎｔｅｒｎａｌｙｆｒｏｍｌｕｃｅｒｎｅｓｅｅｄｗｉｔｈｈｉｇｈｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ＧａｎｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅ；ｌｕｃｅｒｎｅ（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）；ｓｅｅｄｂｏｒｎｅｂａｃｔｅｒｉａ；犘犪犲狀犻犫犪犮犻犾犾狌狊狆狅犾狔犿狔狓犪
２６２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．５