全 文 ：摇 核 农 学 报摇 圆园员源袁圆愿渊怨冤院员缘怨苑 耀 员远园缘允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
收稿日期院圆园员猿鄄员圆鄄圆猿摇 接受日期院圆园员源鄄园缘鄄员猿
基金项目院国家自然科学基金渊猿员园园园苑源猿冤袁吉林省农业科学院创新工程项目渊悦源圆园苑园缘园苑冤
作者简介院蒋滢袁女袁主要从事植物生物反应器方向研究遥 耘鄄皂葬蚤造院 贼蚤葬灶泽澡蚤曾蚤葬燥造蚤葬灶岳 员远猿援 糟燥皂
通讯作者院杨向东袁男袁副研究员袁主要从事植物生物反应器及叶绿体转基因方面研究遥 耘鄄皂葬蚤造院 曾凿赠葬灶早园圆园怨员愿岳 员圆远援 糟燥皂
文章编号院员园园园鄄愿缘缘员渊圆园员源冤园怨鄄员缘怨苑鄄园怨
基于种子生产植物源重组药物蛋白研究进展
蒋摇 滢员 摇 杨摇 静圆 摇 齐广勋圆 摇 邢国杰圆 摇 马莲菊员 摇 杨向东圆
渊员 沈阳师范大学化学与生命科学学院袁辽宁 沈阳摇 员员园园猿源曰
圆吉林省农业科学院农业生物技术研究所袁吉林 长春摇 员猿园园猿猿冤
摘摇 要院种子作为植物重要储藏器官之一袁为高效表达外源重组药物蛋白提供了理想的载体遥 与其他植
物生产系统相比袁植物种子反应器具有多方面的优势袁如表达水平较高袁重组蛋白活性稳定袁易于储藏和
运输以及便于加工尧分离和纯化等遥 在过去的 圆园 年中袁利用植物种子作为反应器表达了一系列重组药
物蛋白袁部分药物蛋白已进入商业化生产阶段遥 本文对种子生物反应器的特点及利用袁就近年来基于种
子生产植物源重组药物蛋白的研究进展进行了综述袁并对植物种子生物反应器研究中的几个问题及未
来的发展方向进行了探讨遥
关键词院植物源重组药物蛋白曰种子曰植物反应器曰研究进展
阅韵陨院员园郾 员员愿远怨 辕 躁援 蚤泽泽灶援 员园园鄄愿缘缘员郾 圆园员源郾 园怨援 员缘怨苑
摇 摇 目前袁全球蛋白类药物市场达 员 缘园园 多亿美元袁且
以每年 员圆豫 耀 圆园豫的速度快速增长遥 巨大的市场需
求给蛋白类药物的规模化尧低成本和安全性提出了更
高的要求遥 与传统的微生物生产系统渊细菌尧酵母生
产系统等冤和动物生产系统相比袁植物生产系统具有
生产成本低尧易实现规模化生产和安全性能好等诸多
优点遥 植物生产系统的生产成本分别是微生物发酵系
统和哺乳动物细胞生产系统的 员园豫及 园郾 员豫 咱员 原 圆暂 遥 另
外与微生物发酵系统不同袁植物细胞内可以进行广泛
的翻译后修袁饰包括糖基化尧酰胺化尧磷酸化等袁通常不
需要对重组药物蛋白进行体外修饰和加工袁其生理生
化特性和生物活性与天然产物相近遥 此外袁植物生产
系统克服了微生物和动物细胞生产系统内毒素尧热原尧
病毒污染等方面的问题袁因而更安全咱猿暂 遥 自 月葬则贼葬
等咱源暂首次利用烟草成功表达重组人类生长激素
渊澡怎皂葬灶 早则燥憎贼澡 澡燥则皂燥灶藻袁 匀郧匀冤 以来袁目前利用植物表
达的各类重组药物蛋白已超过 员园园 种袁包括各类医用
蛋白尧疫苗抗原尧抗体等咱缘 原 苑暂 遥 种子作为植物重要的蛋
白合成和储藏器官之一袁具有高蛋白合成能力尧低蛋白
酶活性水平尧和低含水量等特点袁为重组药物蛋白的高
表达及稳定储藏提供了理想的载体咱愿暂 遥 近年来袁基于
植物种子生产植物源重组药物蛋白的研究受到世界各
国研究者的重视遥 本文主要就近年来基于种子生产植
物源重组药物蛋白的研究进展进行综述遥
员摇 种子表达系统的特点
种子作为植物重要的储藏器官之一袁为高效表达
外源重组药物蛋白提供了理想的载体遥 重组蛋白在种
子中的积累方式与内源蛋白相类似袁种子的高蛋白合
成和积累能力为外源重组蛋白的高水平表达提供了较
大空间咱愿暂 遥 在澡葬灶早等咱怨暂报道了重组人铁转运蛋白在种
子的表达水平达 源园豫 栽杂孕渊 贼燥贼葬造 泽燥造怎遭造藻 责则燥贼蚤藻灶冤袁而在
叶片中仅为 园郾 圆缘豫 栽杂孕遥 利用拟南芥种子表达的 陨 型
糖尿病自体抗原 郧粤阅远缘渊谷氨酸脱羧酶异构体冤表达
水平达 苑郾 苑豫 栽杂孕袁 而在叶片中表达水平仅为 园郾 园园苑豫
栽杂孕遥 种子表达系统的另外一个显著特点是外源重组
蛋白稳定性高袁便于储藏和运输遥 由于处于休眠期的
种子含水量较低渊 约 员园豫 冤袁种子中蛋白水解酶活性维
持在极低的水平袁储藏在种子中的重组蛋白可以保持
较长时间的活性遥 如油菜种子中表达的重组水蛭素
渊澡蚤则怎凿蚤灶冤在储存 猿 年后仍具有活性咱员园暂 遥 利用水稻种
苑怨缘员
核摇 农摇 学摇 报 圆愿 卷
子表达的重组疫苗抗原 悦栽月渊糟澡燥造藻则葬 贼燥曾蚤灶 月 泽怎遭怎灶蚤贼冤
在常温下放置 圆 年以上仍保持较高的活性水平咱员员暂 遥
种子表达系统的这一特点实现了重组药物蛋白生产与
加工环节的脱离袁为后期重组蛋白的分离和纯化提供
了十分便利的条件遥 对于重组口服疫苗来说袁种子生
产系统也有效解决了冷链运输环节及运输过程中的污
染及人工注射等方面的问题咱员员暂 遥 此外袁由于种子体积
较小袁外源重组蛋白浓度较高袁种子中的蛋白酶活性较
低曰同时袁种子中的储藏蛋白类型较少袁通常不含生物
碱尧酚类化合物等影响下游加工纯化过程的化合物袁因
而便于进行分离和纯化咱愿暂 遥 另外种子也可以进行适
当的表面消毒袁降低有害微生物的污染袁这一点对于重
组生物制剂的生产安全性非常重要遥
圆摇 基于种子系统生产的重组药物蛋白
类型
摇 摇 自 员怨怨苑 年 匀燥燥凿 等咱员圆暂首次利用玉米种子表达重
组卵白素渊 葬增蚤凿蚤灶冤以来袁利用种子表达的重组药物蛋
白已有几十种渊表 员尧表 圆冤遥 表达宿主也从拟南芥尧烟
草等模式植物进一步拓展到玉米尧谷物尧大豆尧油菜等
作物咱员员暂 遥 利用植物种子既能表达小分子多肽袁又能表
达一些复杂多亚基蛋白如抗体等遥 体内和体外实验进
一步表明袁基于种子表达的重组药物蛋白具有相应的
生物学功能遥
圆郾 员摇 重组医用蛋白
利用种子生产重组医用蛋白或多肽是植物生物反
应器研究的一个重要领域遥 孕则燥凿蚤郧藻灶藻 公司首次利用
玉米种子表达了重组亲和素渊 葬增蚤凿蚤灶冤袁其生产成本较
微生物生产系统降低 员园 倍以上咱员圆暂 遥 随后该公司利用
玉米种子生产的重组胰蛋白酶渊遭燥增蚤灶藻 贼则赠责泽蚤灶冤进入商
业化生产袁其市场规模预计达 员郾 圆 亿美元咱苑暂 遥 匀藻
等咱员猿暂利用水稻种子表达的重组人血清蛋白渊 澡怎皂葬灶
泽藻则怎皂 葬造遭怎皂蚤灶袁 韵泽则匀杂粤冤表达水平为 员园郾 缘愿豫 栽杂孕遥 进
一步研究表明袁重组 韵泽则匀杂粤 具有与人 匀杂粤 相同的生
物学功能袁具有促进细胞生长和治疗肝硬化的作用遥
目前重组 韵泽则匀杂粤已进入大规模商业化生产阶段遥 美
国 灾藻灶贼则蚤葬 月蚤燥泽糟蚤藻灶糟藻公司利用水稻种子生产的重组人
乳铁蛋白渊造葬糟贼燥枣藻则则蚤灶冤及重组溶菌酶渊造赠泽燥扎赠皂藻冤表达量
分别为 圆缘豫 栽杂孕 和 员猿豫 耀 员源豫 栽杂孕咱员源暂 袁目前这两种重
组蛋白已完成临床试验阶段遥 此外袁重组胃脂酶
渊早葬泽贼则蚤糟 造蚤责葬泽藻冤和人胰岛素渊 蚤灶泽怎造蚤灶冤分别在玉米种子
和红花种子中已完成临床 陨陨 期试验咱员缘暂 遥 除上述已进
入临床试验或商业化生产阶段的植物源重组医用蛋白
外袁 在澡燥灶早 等咱员远暂 利用玉米种子表达了重组抑肽酶
渊葬责则燥贼蚤灶蚤灶冤袁其表达水平为 园郾 园苑豫 栽杂孕遥 功能分析表
明袁重组抑肽酶具有较强的胰蛋白酶抑制活性遥
阅燥憎灶蚤灶早等咱员苑暂利用拟南芥种子表达了重组艾杜糖醛酸
酶渊蚤凿怎则燥灶葬泽藻冤袁活性分析表明袁重组蛋白能够有效水解
粘多糖遥 再葬灶早等咱员愿暂和 再葬皂葬凿葬 等咱员怨暂分别利用水稻和
大豆种子表达了重组降压肽渊灶燥增燥噪蚤灶蚤灶 冤遥 口服饲喂
试验小鼠结果表明袁重组降压肽有效降低了实验小鼠
的血压水平遥 载蚤藻等咱圆园暂利用水稻种子表达的重组人生
长因子渊澡怎皂葬灶 蚤灶泽怎造蚤灶鄄造蚤噪藻 早则燥憎贼澡 枣葬糟贼燥则 员袁 匀陨郧云 原 员冤
积累水平达 远郾 愿豫 栽杂孕遥 口服饲喂小鼠表明袁试验小鼠
的血糖水平比对照小鼠显著下降袁重组 匀陨郧云 原 员 增加
了体内胰岛细胞的数量和胰岛素的分泌水平遥
圆郾 圆摇 重组疫苗抗原 辕抗体
疫苗接种免疫是目前最有效的控制传染性疾病传
播的方式遥 植物种子表达系统为实现重组亚基疫苗和
抗体的生产提供了一条有效的技术途径遥 云蚤藻造凿藻则
等咱圆苑暂利用烟草种子表达单链抗体 云增 片段 渊 泽蚤灶早造藻
糟澡葬蚤灶 云增袁 泽糟云增冤袁重组 泽糟云增 表达量为 猿郾 园豫 耀 源郾 园豫
栽杂孕遥 抗原结合试验表明袁重组抗体能够和抗原进行
特异性结合遥 蕴葬皂责澡藻葬则 等咱圆愿暂利用玉米种子表达大肠
杆菌热敏毒素 月亚基渊蕴栽鄄月冤袁通过口服饲喂试验小鼠
表明袁重组亚基疫苗能够有效激发小鼠体内产生免疫
性保护反应遥 蕴葬皂责澡藻葬则 等咱圆怨暂利用玉米种子表达猪传
染性肠胃炎病毒突刺蛋白渊杂 蛋白冤袁口服免疫研究表
明袁重组疫苗能够激发猪机体血清中产生高水平的中
和抗体遥 郧怎藻则则藻则燥 等咱猿园暂利用玉米种子表达鸡新城疫
亚基疫苗抗原 云 蛋白袁攻毒试验表明袁重组抗原能够
激发机体产生保护性抗体袁其保护效果与商业化鸡新
城疫疫苗一致遥 匝蚤葬灶 等咱猿员暂利用水稻种子表达乙型肝
炎病毒表面抗原 匀月泽粤早袁重组 匀月泽粤早 在种子中表达水
平达 猿员郾 缘 灶早窑早 原员遥 免疫学研究表明袁重组抗原能够激
发试验小鼠体内产生免疫性保护反应遥
猿摇 基于种子生产植物源重组药物蛋白
的几个问题
摇 摇 目前植物生物反应器研究中存在的主要问题包括
重组蛋白表达水平尧重组蛋白的分离和纯化成本及糖
基化修饰等遥 影响这些问题的主要因素包括表达宿主
的选择尧重组蛋白的表达部位尧启动子选择尧转录和翻
译效率袁糖基化修饰等遥 本文就这些问题进行探讨遥
猿郾 员摇 表达宿主选择
合适的宿主是实现重组药物蛋白在种子中高效表
愿怨缘员
摇 怨 期 基于种子生产植物源重组药物蛋白研究进展
表 员摇 利用植物种子表达重组药物蛋白
栽葬遭造藻 员摇 砸藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责澡葬则皂葬糟藻怎贼蚤糟葬造 责则燥贼藻蚤灶泽 藻曾责则藻泽泽藻凿 蚤灶 责造葬灶贼 泽藻藻凿泽
重组药用蛋白
砸藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼
贼澡藻则葬责藻怎贼蚤糟 责则燥贼藻蚤灶泽
启动子
孕则燥皂燥贼藻则
宿主
匀燥泽贼
表达水平
耘曾责则藻泽泽蚤燥灶
造藻增藻造 辕 豫 栽杂孕
生物学功能
云怎灶糟贼蚤燥灶葬造蚤贼赠
参考文献
砸藻枣藻则藻灶糟藻泽
抑肽酶 粤责则燥贼蚤灶蚤灶 泛素启动子
哉遭蚤择怎蚤贼蚤灶 责则燥皂燥贼藻则
玉米
酝葬蚤扎藻
园郾 园苑 抑肽酶抑制胰岛素活性提高 员郾 苑 倍
栽则赠责泽蚤灶 蚤灶澡蚤遭蚤贼蚤燥灶 葬糟贼蚤增蚤贼赠 葬灶凿 员郾 苑 燥枣
葬糟贼蚤增蚤贼赠 则葬贼蚤燥 葬泽 贼澡葬贼 燥枣 灶葬贼蚤增藻 葬责则燥贼蚤灶蚤灶
咱员远暂
人艾杜糖醛酸酶
匀怎皂葬灶 倩鄄蕴鄄
蚤凿怎则燥灶蚤凿葬泽藻
粤砸悦缘 原 陨 启动子
粤砸悦缘 原 陨 责则燥皂燥贼藻则
拟南芥
粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽 员愿郾 园园滋早窑皂早
原员 水解粘多糖
酝怎糟燥责燥造赠泽葬糟糟澡葬则蚤凿藻
澡赠凿则燥造赠扎藻凿
咱员苑暂
抗高血压肽
粤灶贼蚤鄄澡赠责藻则贼藻灶泽蚤增藻
责藻责贼蚤凿藻
水稻蛋白启动子
砸蚤糟藻 早造怎贼藻造蚤灶 责则燥皂燥贼藻则
水稻
砸蚤糟藻
员园郾 园园 缓解心脏收缩压
砸藻凿怎糟蚤灶早 泽赠泽贼燥造蚤糟
遭造燥燥凿 责则藻泽泽怎则藻泽
咱员愿暂
降压肽
晕燥增燥噪蚤灶蚤灶
倩忆启动子
倩忆责则燥皂燥贼藻则
大豆
杂燥赠遭藻葬灶
园郾 缘园 降低鼠的血压
蕴燥憎藻则藻凿 贼澡藻 泽赠泽贼燥造蚤糟 遭造燥燥凿
责则藻泽泽怎则藻 蚤灶 则葬贼泽 咱员怨暂
人胰岛素类生长因子
匀怎皂葬灶 蚤灶泽怎造蚤灶鄄造蚤噪藻
早则燥憎贼澡 枣葬糟贼燥则 员
谷蛋白启动子
郧造怎贼藻造蚤灶 责则燥皂燥贼藻则
水稻
砸蚤糟藻
远郾 愿园 降低血糖浓度
砸藻凿怎糟蚤灶早 遭造燥燥凿 早造怎糟燥泽藻
咱圆园暂
人血清白蛋白
匀怎皂葬灶 泽藻则怎皂 葬造遭怎皂蚤灶
谷蛋白启动子
郧造怎贼藻造蚤灶 责则燥皂燥贼藻则
水稻 辕内质网
砸蚤糟藻 辕 藻灶凿燥责造葬泽皂蚤糟
则藻贼蚤糟怎造怎皂 渊耘砸冤
员园郾 缘愿 促进鼠细胞增殖和治疗肝硬化
孕则燥皂燥贼蚤灶早 糟藻造造 早则燥憎贼澡 葬灶凿
贼则藻葬贼蚤灶早 造蚤增藻则 糟蚤则则澡燥泽蚤泽 蚤灶 则葬贼泽
咱员源暂
牛胰岛素
月燥增蚤灶藻 贼则赠责泽蚤灶
球蛋白启动子
酝葬蚤扎藻 早造燥遭怎造蚤灶 员 责则燥皂燥贼藻则
玉米
酝葬蚤扎藻
猿郾 猿园 与天然胰岛素生物学活性相同
栽澡藻 枣怎灶糟贼蚤燥灶 蚤泽 藻择怎蚤增葬造藻灶贼 贼燥 灶葬贼蚤增藻
遭燥增蚤灶藻 责葬灶糟则藻葬贼蚤糟 贼则赠责泽蚤灶
咱圆员暂
人白介素渊陨蕴冤 原 员园
匀怎皂葬灶
蚤灶贼藻则造藻怎噪蚤灶 渊陨蕴冤 原 员园
水稻谷蛋白启动子
砸蚤糟藻 早造怎贼藻造蚤灶
郧造怎月 原 员 责则燥皂责贼藻则
水稻 辕内质网
砸蚤糟藻 辕 耘砸 源郾 缘园 皂早窑员园园 早
原 员 重组 陨蕴 原 员园 的生物活性比商业
所用的 陨蕴 原 员园 高 员园 倍
员园 贼蚤皂藻泽 澡蚤早澡藻则 葬糟贼蚤增蚤贼赠 贼澡葬灶 凿蚤凿
糟燥皂皂藻则糟蚤葬造造赠 葬增葬蚤造葬遭造藻 澡怎皂葬灶 陨蕴 原 员园
咱圆圆暂
人碱性成纤维细胞
生长因子
匀怎皂葬灶 遭葬泽蚤糟 枣蚤遭则燥遭造葬泽贼
早则燥憎贼澡 枣葬糟贼燥则 渊遭云郧云冤
大豆球蛋白 郧员 启动子
郧造赠糟蚤灶蚤灶 郧员 责则燥皂燥贼藻则
大豆 辕蛋白贮存器
杂燥赠遭藻葬灶 辕 孕杂灾
圆郾 猿园 刺激 月葬造遭 辕 猿栽猿 细胞增殖
栽澡藻 遭云郧云 泽贼蚤皂怎造葬贼藻凿 月葬造遭 辕 糟 猿栽猿
糟藻造造泽 贼燥 责则燥造蚤枣藻则葬贼藻
咱圆猿 原 圆源暂
人类凝血因子 陨载
匀怎皂葬灶 糟燥葬早怎造葬贼蚤燥灶
枣葬糟贼燥则 陨载
茁伴大豆球蛋白 倩亚基
倩 原 杂怎遭怎灶蚤贼 燥枣 贼澡藻
茁 原 糟燥灶早造赠糟蚤灶蚤灶
蛋白贮存蛋白器
孕则燥贼藻蚤灶 泽贼燥则葬早藻
增葬糟怎燥造渊孕杂灾冤
园郾 愿园早窑噪早 原员窑泽藻藻凿 具有全部生物功能活性的 澡郧匀耘曾责则藻泽泽蚤灶早 枣怎造造 葬糟贼蚤增蚤贼赠 澡郧匀
咱圆缘暂
韵 原乙酰丝氨酸巯
基水解酶
韵鄄葬糟藻贼赠造泽藻则蚤灶藻 泽怎造枣澡赠凿则赠造葬泽藻
猿缘泽启动子
猿缘泽 责则燥皂燥贼藻则
大豆
杂燥赠遭藻葬灶
圆圆郾 园园 耀 猿圆郾 园园 水解蛋白酶抑制剂
匀赠凿则燥造赠扎藻凿 责则燥贼藻葬泽藻 蚤灶澡蚤遭蚤贼燥则
咱圆远暂
达的关键因素之一遥 目前基于种子生产重组药物蛋白
的表达宿主主要包括拟南芥尧禾谷类作物尧豆科植物尧
油料作物等咱苑暂 遥 阅则燥燥早藻灶遭则燥藻糟噪 等咱猿源暂 研究表明重组
泽糟云增在拟南芥种子中表达量达 猿远豫 栽杂孕袁且重组 泽糟云增
与 陨早郧 具有相同的抗原中和活性遥 杂糟澡怎灶皂葬灶灶 等咱猿缘暂
报道利用大麦种子表达的重组 匀陨灾 抗体表达水平达
员缘园滋早窑早 原员遥 大豆作为高蛋白作物袁其主要特点是蛋白
质含量较高渊约 源园豫 冤袁因而为重组蛋白的高效表达提
供了较大空间遥 目前利用大豆种子表达的重组药物蛋
白包括重组酪蛋白尧人类生长激素尧降压肽和人凝血因
子等咱猿远 原 猿苑暂 遥 油料作物如红花和油菜种子富含丰富的
油脂和蛋白遥 利用油菜尧红花等作物表达的重组药物
蛋白包括重组水蛭素尧载脂蛋白和人生长因子
等咱猿愿 原 猿怨暂 遥 这类表达系统的主要特点是可以利用油体
的亲脂疏水特性袁将重组蛋白与其他植物蛋白组分分
开袁因而为后期重组蛋白的分离和纯化提供了便利的
条件遥 尽管已有多例重组药物蛋白在不同的宿主中获
得成功表达袁但不同植物在蛋白质 辕干重比值尧蛋白储
藏和积累方式存在很大的差异遥 同时袁不同的物种籽
粒产量尧转化率等因素也对重组蛋白的产量有较大的
影响遥
怨怨缘员
核摇 农摇 学摇 报 圆愿 卷
表 圆摇 利用植物种子表达的重组疫苗抗原和抗体
栽葬遭造藻 圆摇 砸藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 增葬糟糟蚤灶藻 葬灶贼蚤早藻灶泽 葬灶凿 葬灶贼蚤遭燥凿蚤藻泽 藻曾责则藻泽泽藻凿 蚤灶 责造葬灶贼 泽藻藻凿泽
免疫抗原 辕抗体
灾葬糟糟蚤灶藻 葬灶贼蚤早藻灶 辕 粤灶贼蚤遭燥凿赠
启动子
孕则燥皂燥贼藻则
宿主
匀燥泽贼
表达水平
耘曾责则藻泽泽蚤燥灶
造藻增藻造 辕 豫 栽杂孕
生物学功能
云怎灶糟贼蚤燥灶葬造蚤贼赠
参考文献
砸藻枣藻则藻灶糟藻泽
霍乱毒素 月亚基疫苗
悦澡燥造藻则葬 贼燥曾蚤灶 月 增葬糟糟蚤灶藻
郧造怎月启动子
郧造怎月 原 员 责则燥皂燥贼藻则
水稻 辕蛋白体
砸蚤糟藻 辕 孕月
猿园滋早 燥枣
悦栽月 责藻则 泽藻藻凿
中和粘膜 陨早粤抗体活性
匀葬增藻 贼澡藻 灶藻怎贼则葬造蚤扎蚤灶早 葬糟贼蚤增蚤贼赠
咱员员暂
单链抗体
杂蚤灶早造藻 糟澡葬蚤灶 云增 渊泽糟云增冤
葬灶贼蚤遭燥凿蚤藻泽
猿缘泽启动子
猿缘杂 责则燥皂燥贼藻则
烟草 辕内质网
栽燥遭葬糟糟燥 辕 耘砸
猿郾 园园 耀 源郾 园园 与抗原特异性结合
砸藻糟燥皂遭蚤灶蚤灶早 泽责藻糟蚤枣蚤糟葬造造赠 憎蚤贼澡 葬灶贼蚤早藻灶
咱圆苑暂
肠毒素杆菌热敏肠
毒素 月亚基
月鄄泽怎遭怎灶蚤贼 燥枣 耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬
糟燥造蚤 澡藻葬贼鄄造葬遭蚤造藻 藻灶贼藻则燥贼燥曾蚤灶
组成型启动子
悦燥灶泽贼蚤贼怎贼蚤增藻 责则燥皂燥贼藻则
玉米
酝葬蚤扎藻
园郾 愿园 抗 蕴栽
粤早葬蚤灶泽贼 蕴栽 咱圆愿暂
猪传染性胃肠炎 杂
蛋白质渊栽郧耘冤
杂憎蚤灶藻 贼则葬灶泽皂蚤泽泽蚤遭造藻
早葬泽贼则燥藻灶贼藻则蚤贼蚤泽
渊栽郧耘冤 杂 孕则燥贼藻蚤灶
组成型启动子
糟燥灶泽贼蚤贼怎贼蚤增藻 责则燥皂燥贼藻则
玉米
酝葬蚤扎藻
园郾 员园 增强中和抗体的能力
月燥燥泽贼蚤灶早 灶藻怎贼则葬造蚤扎蚤灶早 葬灶贼蚤遭燥凿赠 造藻增藻造泽
咱圆怨暂
乙型肝炎病毒
表面抗原
粤 皂燥凿蚤枣蚤藻凿 澡藻责葬贼蚤贼蚤泽 月 增蚤则怎泽
泽怎则枣葬糟藻 葬灶贼蚤早藻灶 渊匀月泽粤早冤
种子特异性 郧造怎遭 原 源 启动子
杂藻藻凿鄄泽责藻糟蚤枣蚤糟 郧造怎遭 原 源 责则燥皂燥贼藻则
水稻
砸蚤糟藻 猿员郾 缘园 灶早窑早
原员 激发体内的免疫反应
陨灶增燥噪蚤灶早 责则燥贼藻糟贼蚤增藻 蚤皂皂怎灶燥早藻灶蚤糟 则藻泽责燥灶泽藻泽
咱猿员暂
单链抗体
杂蚤灶早造藻鄄糟澡葬蚤灶 增葬则蚤葬遭造藻
枣则葬早皂藻灶贼泽 渊泽糟云增泽冤
球蛋白 月源 启动子
造藻早怎皂蚤灶 月源 渊蕴藻月源冤
烟草
栽燥遭葬糟糟燥
圆缘郾 园园 与天然蛋白具有相似的功能活性
杂蚤皂蚤造葬则 责则燥责藻则贼蚤藻泽 贼燥 贼澡藻 糟燥则则藻泽责燥灶凿蚤灶早 泽糟云增泽
咱猿圆暂
栽细胞表位多肽
栽鄄糟藻造造 藻责蚤贼燥责藻 责藻责贼蚤凿藻泽
猿缘泽启动子
猿缘泽 责则燥皂燥贼藻则
水稻
砸蚤糟藻
员缘郾 园园 抑制 栽匀圆介导的特异性过敏原的免疫 陨早耘反应
杂怎责责则藻泽泽蚤灶早 葬造造藻则早藻灶鄄泽责藻糟蚤枣蚤糟 栽澡圆 原 皂藻凿蚤葬贼藻凿
蚤皂皂怎灶燥早造燥遭怎造蚤灶 耘 渊陨早耘冤 则藻泽责燥灶泽藻泽
咱猿猿暂
猿郾 圆摇 重组蛋白表达部位
细胞中合成的重组蛋白一般存在于细胞质或是通
过分泌途径渊内质网尧高尔基体尧蛋白运输嚢泡等冤定
位到各类细胞器或质外体遥 重组蛋白在细胞中的定位
不仅影响其表达水平和稳定积累咱源园 原 源员暂 曰同时也影响到
重组蛋白的翻译后修饰渊组装与折叠尧二硫键的形成尧
多亚基组装等冤及生物学功能咱源圆暂 遥 特别是在核糖体
渊 藻灶凿燥责造葬泽皂蚤糟 则藻贼蚤糟怎造怎皂袁 耘砸 冤 和 高 尔 基 体 渊 郧燥造早蚤
葬责责葬则葬贼怎泽冤内进行的糖基化修饰对于重组蛋白结构尧生
物学功能及免疫原性等具有极为重要的影响咱源猿暂 遥 另
外袁重组药物蛋白的定位表达有利于降低对细胞正常
代谢活动影响和后期分离和纯化咱源源暂 遥
猿郾 圆郾 员摇 内质网摇 内质网腔内的氧化环境尧多种分子伴
侣的存在及低蛋白酶活性水平为重组蛋白的正确折
叠尧组装和转录后修饰过程提供了有利的环境咱源缘 原 源远暂 遥
粤增藻泽葬灶蚤等咱源员暂研究表明通过 悦 末端的四肽 匀 辕 运阅耘蕴袁
重组蛋白能够实现在 耘砸 中的驻留袁促进重组蛋白在
耘砸中的积累遥 杂贼燥早藻则 等咱源苑暂在水稻和小麦种子中表达
了癌胚抗原渊 糟葬则糟蚤灶燥藻皂遭则赠燥灶蚤糟 葬灶贼蚤早藻灶袁 悦耘粤冤单链抗
体遥 定位于 耘砸 的重组抗体表达水平达 猿园滋早窑早 原员种
子袁显著高于质外体表达水平遥 云蚤藻凿造藻则 等咱圆苑暂研究表明
定位于 耘砸的重组抗体 泽糟云增在转基因烟草种子中的表
达水平达 苑郾 园豫 栽杂孕袁而在细胞质中表达水平则低于
园郾 员豫 栽杂孕遥 其原因可能是由于 耘砸 中低水平蛋白酶活
性及分子伴侣促进了重组抗体的正确组装和稳定积
累遥 另外袁再葬灶早等咱源愿暂研究表明袁在转基因拟南芥种子
中表达丝蛋白 杂蕴孕 时袁定位于 耘砸 的重组蛋白表达水
平显著高于液泡和质外体遥
猿郾 圆郾 圆摇 蛋白体 摇 蛋白体渊责则燥贼藻蚤灶 遭燥凿赠袁 孕月冤是由 耘砸
衍生形成的一类蛋白储藏细胞器遥 禾谷类作物种子中
的醇溶蛋白渊责则燥造葬皂蚤灶袁 在藻蚤灶 蛋白冤主要以致密的蛋白
体形式存在袁栽燥怎泽 等咱源怨暂研究表明袁在藻蚤灶 蛋白不含有核
糖体保留信号袁但其 晕 原末端区可以有效促进蛋白质
在内质网中的积累和蛋白体的形成遥 栽燥则则藻灶贼 等咱缘园暂研
究表明袁重组人表皮生长因子渊澡怎皂葬灶 藻责蚤凿藻则皂葬造 早则燥憎贼澡
枣葬糟贼燥则袁 耘郧云冤在 孕月 中的积累水平比细胞质中提高 员园
耀 圆园 倍袁达 园郾 缘早窑噪早 原员种子鲜重遥 其原因一方面可能
与重组蛋白在 孕月 中的分室化表达有关遥 另一方面袁
园园远员
摇 怨 期 基于种子生产植物源重组药物蛋白研究进展
重组蛋白形成的高致密性蛋白体袁绕开了液泡或内质
网蛋白降解路径渊耘砸鄄葬泽泽燥糟蚤葬贼藻凿 凿藻早则葬凿葬贼蚤燥灶 责葬贼澡憎葬赠袁
耘砸粤阅冤袁从而利于重组蛋白的积累咱缘员暂 遥 阅藻 等咱缘圆暂研究
表明袁融合 酌 原 在藻蚤灶 蛋白的 匀陨灾 疫苗抗原 晕藻枣 在转基
因烟草细胞中形成了 孕月袁重组融合蛋白在细胞中的积
累水平达 员郾 缘豫 栽杂孕孕月的另外一个特点是高致密性和
高密度袁因此通过常规的密度梯度离心袁就可以将含有
重组蛋白的蛋白体从细胞裂解液中分离出来袁从而加
快了后期重组蛋白的分离和纯化咱缘园暂 遥
猿郾 圆郾 猿摇 油体摇 油体渊燥蚤造 遭燥凿赠袁 韵月冤是植物种子中贮存
油脂的亚细胞器袁具有亲脂疏水的特性遥 韵月周围覆盖
了一层高密度的低分子量渊员缘 耀 圆远 噪阅葬冤疏水油体蛋
白渊燥造藻燥泽蚤灶冤袁通过与油体蛋白的融合可以实现重组蛋
白油体表面的靶向定位咱缘猿暂 遥 晕赠噪蚤枣燥则怎噪 等咱猿怨暂通过油体
蛋白融合袁在红花种子中表达了重组载脂蛋白
渊葬责燥造蚤责燥责则燥贼藻蚤灶 粤陨 皂蚤造葬灶燥袁 粤责燥粤陨酝蚤造葬灶燥 冤袁其表达水平达
苑 早援 噪早 原员遥 活性分析表明袁重组 粤责燥粤陨酝蚤造葬灶燥具有内源粤责燥粤陨酝蚤造葬灶燥相同的功能遥猿郾 圆郾 源摇 载体蛋白融合摇 除亚细胞靶向定位策略外袁通
过重组蛋白与载体蛋白分子的融合也可以有效提高外
源蛋白的表达水平或是加快后期分离纯化过程咱源源暂 遥
如融合类弹性蛋白多肽渊 藻造葬泽贼蚤灶鄄造蚤噪藻 责燥造赠责藻责贼蚤凿藻泽袁耘蕴孕
含重复五肽序列 灾孕郧载郧冤的重组蛋白可以在细胞中形
成类似蛋白体的结构遥 悦燥灶造藻赠等咱缘源暂发现袁融合 耘蕴孕的
的绿色荧光蛋白 郧云孕 在细胞中的积累水平和稳定性
显著提高袁融合蛋白可以通过多次可逆相变循环
渊蚤灶增藻则泽藻 贼则葬灶泽蚤贼蚤燥灶 糟赠糟造蚤灶早袁陨栽悦冤进行有效分离和纯化遥
最近袁允燥藻灶泽怎怎 等咱缘缘暂和 悦燥灶造藻赠 等咱缘远暂利用真菌疏水蛋白
渊澡赠凿则燥责澡燥遭蚤灶泽袁匀云月陨袁分子量约 员园 噪阅葬冤作为载体蛋白
分子袁通过靶蛋白和载体蛋白分子 匀云月陨 的融合袁可以
在细胞中形成蛋白体遥 并显著提高重组蛋白表达水平
和稳定性遥 因此袁载体蛋白融合技术也是提高重组蛋
白表达水平的有效策略之一遥
猿郾 猿摇 启动子选择
不同植物种子中的蛋白质储藏部位存在很大的差
异袁因此袁进行启动子选择时需要充分考虑这一因素遥
在早期的研究中袁一般选用组成型启动子如 怎遭蚤择怎蚤贼蚤灶
和 猿缘泽启动子等咱缘苑 原 缘愿暂 遥 然而在很多情况下袁重组蛋白
的组成型表达通常会影响植物的正常生长发育袁其表
达水平也较低遥 因此袁对基于种子表达系统生产重组
药物蛋白研究来说袁利用种子特异性启动子更为合
适咱缘怨暂 遥 单子叶植物蛋白储存部位主要位于胚乳袁因此
利用胚乳特异性启动子效果较好遥 如水稻谷蛋白
郧造怎粤 原圆 启动子渊郧贼 原 员冤袁能够在水稻和玉米中胚乳特
异性表达咱远园暂 遥 匝怎等咱远员暂对 员园 种水稻种子特异性启动
子活性进行比较研究表明袁其中表达效率最强的 源 个
启动子谷蛋白启动子 郧造怎月 原 源袁 圆远 噪阅 球蛋白启动子
及 员园噪阅 和 员远噪阅 醇溶蛋白启动子均为胚乳特异性启
动子遥 双子叶植物常用的种子特异性启动子包括大豆
凝集素渊 造藻糟贼蚤灶冤尧大豆 茁 原伴大豆球蛋白 倩 亚基渊茁 原
糟燥灶早造赠糟蚤灶蚤灶 倩 鸳 泽怎遭怎灶蚤贼 冤袁 菜豆 葬则糟藻造蚤灶 原 缘 启动子
等咱猿远袁远圆 原 远猿暂 遥 如利用菜豆 葬则糟藻造蚤灶 原 缘 启动子驱动单链抗
体基因 泽糟云增的表达时袁重组蛋白表达水平分别可以达
到 员圆郾 缘豫 栽杂孕咱远猿暂 遥 可见袁启动子效率对于重组蛋白表
达水平具有非常明显的影响遥
猿郾 源摇 转录和翻译效率
影响重组蛋白表达水平的另外一个重要因素是靶
基因的转录和翻译效率遥 利用植物表达外源基因时袁
一些非植物源 皂砸晕粤序列中的不稳定序列如富含 粤哉
序列通常会严重影响 皂砸晕粤 的稳定性遥 利用种子表
达的重组药物蛋白基因通常来源于原核生物或动物袁
因此袁去除靶基因序列中的不稳定序列以及根据植物
偏爱型密码子对靶基因进行优化设计袁对于提高基因
表达和翻译效率具有重要的作用咱苑暂 遥 有研究表明袁靶
基因内含子对于提高重组蛋白表达水平具有重要的影
响咱源园暂 遥 灾葬蚤灶 等咱远源暂报道袁来源于双子叶植物 粤阅匀员尧
杂匀员尧哉月陨员 和 粤悦栽员 内含子以及来源于单子叶植物的
悦匀杂 粤可以显著提高外源基因的表达效率袁而且在双
子叶植物中这一效果更为明显遥 其原因可能是由于内
含子的存在可以提高 皂砸晕粤 的稳定性或是增强了启
动子的转录效率遥 另外袁缘忆哉栽砸泽对于靶基因的转录效
率也有明显影响遥 蕴蚤怎等咱远缘暂研究了 远 个水稻种子储藏
蛋白基因 缘忆哉栽砸泽区对基因表达效率的影响遥 结果表
明袁远 个 缘忆哉栽砸泽 区均提高了报告基因 早怎泽 的表达效
率袁其中袁融合 郧造遭 原 员 和 郧造怎粤 原 员 基因 缘忆哉栽砸泽 区的
早怎泽表达效率分别提高了 猿郾 猿远 和 猿郾 员员 倍遥
还有研究发现袁外源转录因子不仅可以通过影响
植物生化通路来影响内在基因的表达袁也可以有效提
高重组蛋白的表达水平咱远远暂 遥 再葬灶早 等咱远苑暂研究表明袁在
水稻中导入 遭在陨孕转录因子时袁可以显著提高启动子表
达效率袁其中无论是利用水稻自身启动子尧郧造遭 启动子
还是 粤糟贼启动子袁都使得 郧哉杂 蛋白的表达量分别提高
圆郾 源猿尧圆郾 园员 和 员郾 怨愿 倍袁最终提高了重组人溶菌酶基因
的表达水平遥 运藻则皂燥凿藻 等咱远愿暂的研究也表明袁转录因子
粤月陨猿 的异位表达可以有效提高重组艾杜糖醛酸酶在
烟草中的高水平表达遥
猿郾 缘摇 糖基化修饰
糖基化修饰对于维持重组药用蛋白的稳定性尧药
员园远员
核摇 农摇 学摇 报 圆愿 卷
物动力学活性或免疫学活性等均有非常重要的作用遥
目前已批准进入商业化生产的药物蛋白中袁大约有 员 辕
猿 都是糖蛋白遥 尽管植物表达系统也具有相应的糖基
化修饰过程袁但与动物中的糖基化过程存在一定的差
异咱缘暂 遥 晕 原聚糖的生物合成开始于内质网随后在高尔
基体内加工遥 在寡糖前体合成及向正在增长的肽链的
转移阶段袁所有真核生物都采用相同的策略遥 随后 晕
原聚糖经高尔基体中糖链修饰酶加工为成熟的 晕 原聚
糖遥 由于植物和动物中的糖链修饰酶不同袁因此产生
的不同形式的 晕 原聚糖遥 如在植物细胞中糖蛋白携带
茁 原员袁圆 原木糖和 琢 原员袁猿 原果糖袁但缺乏动物糖蛋白中
的 茁 原员袁源 原半乳糖和唾液酸咱缘暂 遥 因此袁通过阻止目标
蛋白表面添加致免疫抗原决定簇袁控制植物特异性 晕
端聚糖的成熟袁从而利用植物的 晕 链聚糖结构生产具
有医疗功能的糖蛋白遥 最理想方法之一是直接突变天
冬氨酰和丝氨酸位点袁这是蛋白表面糖基化主要位点遥
这种方法很适合抗原和简单医药蛋白的生产袁这些蛋
白不需要很高的活性和耐久的保质期袁但不适合更复
杂蛋白的糖基化咱远怨暂 遥 另外袁还有一种在植物中获得人
类抗体同源糖基化的高效方法袁通过插入突变和利用
砸晕粤干涉的方法袁抑制 琢 原员袁猿 原岩藻糖转移酶和 茁 原
员袁圆 原木糖基转移酶基因的活性袁从而抑制植物特异的
高尔基糖基转移酶袁最终可以成功阻止重组药用蛋白
表面糖表位的增加遥 巴西农科院已经将转基因大豆中
四种不同的糖基转化酶结合敲除袁通过这种方法能使
种子中积累的重组蛋白表面形成类似人体蛋白糖基化
的位点咱苑园暂 遥
重新改造生物合成的途径是另一个能够将植物中
晕端聚糖实现与人类同源的方法遥 通过增加额外的酶
反应途径袁获得特殊的代谢产物遥 实现植物重组蛋白
与人体同源的最好办法袁是在植物中表达哺乳动物中
糖基转移酶袁能在新合成的酶与 晕 糖基化的内源机制
之间形成的竞争反应袁例如通过重组人 茁 原 员袁源 原半乳
糖基转移酶能够在植物 晕 端乙酰氨基葡糖转移酶位
点添加半乳糖残基袁能够对应在植物细胞中得到类似
于哺乳动物细胞的聚糖咱苑员暂 遥
源摇 展望
近年来袁利用植物生产的重组药物蛋白已进入或
正在进入商业化应用阶段袁植物源重组药物蛋白在全
球蛋白类药物市场业的比例逐年增加遥 与其他重组药
用蛋白生产系统相比袁种子表达系统不仅具有表达水
平高袁重组蛋白稳定性好袁便于储藏和运输等特点袁同
时实现了重组药物蛋白生产和加工环节的脱离袁为后
期的重组蛋白的分离和纯化提供了十分便利的条件遥
种子表达系统表达宿主广泛袁表达部位多样化袁使种子
表达重组药物蛋白更加灵活遥 通过重组药物蛋白在种
子亚细胞器的定位表达渊如油体尧蛋白体等冤袁大大简
化了重组蛋白后期的分离和纯化过程袁进一步降低了
生产成本遥 重组蛋白在种子中的高表达和稳定等特点
也为实现重组疫苗的口服袁开辟新的疫苗免疫方式提
供了一条较好的技术途径遥 可以预见袁随着研究的进
一步深入袁种子表达系统将在重组药物蛋白研究领域
展现出更加诱人的发展前景遥
目前种子表达系统仍存在一些不足袁如在重组药
物蛋白的糖基化修饰方式上袁与内源蛋白或动物系统
之间存在的差异遥 对于在 耘砸或是蛋白体中积累的重
组蛋白来说袁由于其绕开了高尔基体中的糖基化修饰
过程袁因此其糖基化修饰过程可能并不完全袁对于这类
重组蛋白的真实性及其生物学功能评价袁特别是在试
验动物模型中的功能评价就显得更为重要遥 此外袁目
前对于异源的 晕端聚糖功能袁尤其是对所有真核系统
中袁蛋白的功能尧稳定以及转运研究很少遥 由于人类对
于蛋白的迫切需要和较高的安全评估袁重组蛋白大规
模的生产还需要很长时间遥 无论在发达国家还是发展
中国家袁资金缺乏是重组蛋白生产医药不可忽视的瓶
颈袁未来应该在经济可行的范围内袁充分利用种子的上
述特点袁使其成为生产大量重组蛋白有效的体系遥 相
信随着研究的深入袁这些问题将会逐步得到解决遥
参考文献院
咱 员 暂摇 栽憎赠皂葬灶 砸 酝袁 杂贼燥早藻则 耘袁 杂糟澡蚤造造遭藻则早 杂袁 悦澡则蚤泽贼燥怎 孕袁 云蚤泽糟澡藻则 砸援
酝燥造藻糟怎造葬则 云葬则皂蚤灶早 蚤灶 孕造葬灶贼泽院 匀燥泽贼 杂赠泽贼藻皂泽 葬灶凿 耘曾责则藻泽泽蚤燥灶
栽藻糟澡灶燥造燥早赠咱允暂 援 栽则藻灶凿泽 月蚤燥贼藻糟澡灶燥造袁 圆园园猿袁 圆员渊员圆冤院 缘苑园 原 缘苑愿
咱 圆 暂摇 郧蚤凿凿蚤灶早泽 郧袁 粤造造蚤泽燥灶 郧袁 月则燥燥噪泽 阅袁 悦葬则贼藻则 粤援 栽则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽 葬泽
枣葬糟贼燥则蚤藻泽 枣燥则 遭蚤燥责澡葬则皂葬糟藻怎贼蚤糟葬造泽 咱 允暂 援 晕葬贼怎则藻 月蚤燥贼藻糟澡灶燥造燥早赠袁 圆园园愿袁
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粤袁 酝葬贼扎噪藻 粤 允援 栽澡藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 葬 灶燥责葬造蚤灶藻 泽赠灶贼澡葬泽藻鄄澡怎皂葬灶 早则燥憎贼澡
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贼蚤泽泽怎藻咱允暂 援 孕造葬灶贼 酝燥造藻糟怎造葬则 月蚤燥造燥早赠袁 员怨愿远袁 远渊缘冤院 猿源苑 原 猿缘苑
咱 缘 暂摇 蕴蚤藻灶葬则凿 阅袁 杂燥怎则则燥怎蚤造造藻 悦袁 郧燥皂燥则凿 灾袁 云葬赠藻 蕴援 孕澡葬则皂蚤灶早 葬灶凿
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员员缘 原 员源苑
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藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 泽赠泽贼藻皂泽 枣燥则 责造葬灶贼 皂燥造藻糟怎造葬则 枣葬则皂蚤灶早 咱 允 暂 援 孕造葬灶贼
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圆园园苑袁 员园源渊圆远冤院 员园怨愿远 原 员园怨怨员
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悦燥皂皂藻则糟蚤葬造 责则燥凿怎糟贼蚤燥灶 燥枣 葬增蚤凿蚤灶 枣则燥皂 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 皂葬蚤扎藻院
糟澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 贼则葬灶泽枣燥则皂葬灶贼袁 责则燥凿怎糟贼蚤燥灶袁 责则燥糟藻泽泽蚤灶早袁 藻曾贼则葬糟贼蚤燥灶
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咱员缘暂摇 灾蚤葬灶灶葬 郧 砸袁 悦怎灶澡葬 晕 月袁 酝怎则葬凿 粤 酝袁 砸藻糟澡 耘 蕴援 杂燥赠遭藻葬灶泽 葬泽
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咱员远暂摇 在澡燥灶早 郧 再袁 孕藻贼藻则泽燥灶 阅袁 阅藻造葬灶藻赠 阅 耘袁 月葬蚤造藻赠 酝袁 宰蚤贼糟澡藻则 阅 砸袁
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阅袁 酝藻赠藻则 栽袁 匀燥燥凿 耘 耘袁 匀燥憎葬则凿 允 粤援 悦燥皂皂藻则糟蚤葬造 责则燥凿怎糟贼蚤燥灶 燥枣
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缘渊源冤院 猿源缘 原 猿源缘
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酝袁 哉贼泽怎皂蚤 杂袁陨泽澡蚤皂燥贼燥 酝袁 再燥泽澡蚤噪葬憎葬 酝援 粤灶贼蚤鄄澡赠责藻则贼藻灶泽蚤增藻 葬糟贼蚤增蚤贼赠
燥枣 早藻灶藻贼蚤糟葬造造赠 皂燥凿蚤枣蚤藻凿 泽燥赠遭藻葬灶 泽藻藻凿泽 葬糟糟怎皂怎造葬贼蚤灶早 灶燥增燥噪蚤灶蚤灶 咱 允暂 援
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咱圆园暂摇 载蚤藻 栽袁 匝蚤怎 匝袁 在澡葬灶早 宰袁晕蚤灶早 栽袁 再葬灶早 宰袁 在澡藻灶早 悦袁宰葬灶早 悦袁 在澡怎
再袁 再葬灶早 阅援 粤 遭蚤燥造燥早蚤糟葬造造赠 葬糟贼蚤增藻 则澡陨郧云 原 员 枣怎泽蚤燥灶 葬糟糟怎皂怎造葬贼藻凿 蚤灶
贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 则蚤糟藻 泽藻藻凿泽 糟葬灶 则藻凿怎糟藻 遭造燥燥凿 早造怎糟燥泽藻 蚤灶 凿蚤葬遭藻贼蚤糟 皂蚤糟藻 增蚤葬
燥则葬造 凿藻造蚤增藻则赠咱允暂 援 孕藻责贼蚤凿藻泽袁 圆园园愿袁 圆怨渊员员冤院 员愿远圆 原 员愿苑园
咱圆员暂摇 宰燥燥凿葬则凿 杂 蕴袁酝葬赠燥则 允 酝袁 月葬蚤造藻赠 酝 砸袁 月葬则噪藻则 阅 运袁 蕴燥增藻 砸 栽袁
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