全 文 ：核 农 学 报　 ２０１５，２９（１）：００４０ ～ ００４８
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
收稿日期：２０１３⁃０８⁃２９　 接受日期：２０１４⁃０８⁃２７
基金项目：国家牧草产业技术体系专项（ＣＡＲＳ⁃３５），牧草种质资源保护与利用（ＮＢ２１３０１３５），青藏高原甘肃甘南社区生态畜牧业关键技术集成
与模式示范（２０１２０３０１０），甘肃牧区优质饲草生产技术研究与示范（２０１００３０２３）
作者简介：李玉珠，女，讲师，主要从事牧草和草坪草种质资源保护与育种的研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｌｉｙｚ＠ ｇｓａｕ． ｅｄｕ． ｃｎ
通讯作者：师尚礼，男，教授，主要从事牧草和草坪草育种与栽培的研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｓｈｉｓｈｌ＠ ｇｓａｕ． ｅｄｕ． ｃｎ
文章编号：１０００⁃８５５１（２０１５）０１⁃００４０⁃０９
紫花苜蓿与百脉根原生质体培养
及不对称体细胞杂交
李玉珠　 师尚礼
（甘肃农业大学草业学院 ／草业生态系统教育部重点实验室 ／甘肃省草业工程实验室 ／
中美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州　 ７３００７０）
摘　 要：本研究拟通过原生体培养和不对称细胞杂交实现白脉根与苜蓿种间基因重组，为改良苜蓿饲用
品质提供新的技术手段，用酶解法分离清水紫花苜蓿（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ Ｌ． ｃｖ． ‘Ｑｉｎｇｓｈｕｉ’）及里奥百脉根
（Ｌｏｔｕｓ ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ Ｌ． ｃｖ． ‘Ｌｅｏｎ’）愈伤组织来源的原生质体，研究了酶解时间、酶液组合、甘露醇浓度、
预处理条件、继代时间及培养方法等对原生质体分离和培养效果的影响。 采用改良的 ＰＥＧ⁃高 Ｃａ２ ＋ ⁃高
ｐＨ法进行了不对称体细胞杂交，通过荧光染色鉴别异核体并测定融合率。 结果表明，采用继代培养第
８ ～ １２ 天的苜蓿和百脉根愈伤组织，０􀆰 ５５ ｍｏｌ·Ｌ － １ ＣＰＷ溶液中预处理 １ｈ或预暗培养 ２４ ｈ，甘露醇浓度
为 ０􀆰 ５５ ～ ０􀆰 ６ ｍｏｌ·Ｌ － １时，清水紫花苜蓿在 ２％纤维素酶 ＋ ０􀆰 ５％果胶酶 ＋ ０􀆰 ３％崩溃酶的酶液中酶解
１０ ｈ，里奥百脉根在 ２％纤维素酶 ＋ ０􀆰 ５％果胶酶 ＋ ０􀆰 ３％半纤维素酶的酶液中酶解 １２ ｈ，经 ２ ～ ３ 个月
的固液 ＋固体培养模式可分别获得较好的原生质体分离效果及愈伤组织再生植株。 清水紫花苜蓿原生
质体经 ３ ｍｍｏｌ·Ｌ － １ ＩＯＡ 处理 １０ ｍｉｎ，里奥百脉根经 ５０ μｇ·ｍＬ － １ Ｒ⁃６Ｇ 处理 １０ ｍｉｎ 后融合，ＰＥＧ
（６０００）最适浓度为 ３５％ ，异源融合率为 ３􀆰 １％ ，最终获得了苜蓿与百脉根的杂种愈伤组织，为进一步培
育抗臌胀病型苜蓿种质提供了新的材料。
关键词：紫花苜蓿；百脉根；原生质体；培养；不对称体细胞杂交
ＤＯＩ：１０􀆰 １１８６９ ／ ｊ． ｉｓｓｎ． １００⁃８５５１􀆰 ２０１５􀆰 ０１． ００４０
　 　 紫花苜蓿号称“牧草之王”，不仅适应性强、产草
量高，而且营养丰富，还能形成根瘤进行固氮［１］，是全
世界栽培最悠久、面积最大、利用最广泛的豆科牧
草［２］，但其仍有一些品质尚待改良，如青饲易造成家
畜臌胀病，耐寒性不强，耐酸性和耐牧性差等。 而百脉
根耐酸性强，号称“瘠地苜蓿” ［３］，又因其植株及叶片
富含缩合单宁（ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ ｔａｎｎｉｎ），能防止反刍动物臌
胀病的发生。 因此，利用生物技术把百脉根细胞中控
制单宁缩合的遗传基因转移至紫花苜蓿，就有机会获
得抗臌胀病的新型苜蓿种质。
植物体细胞杂交（ ｓｏｍａｔｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）即原生质
体融合可利用人工诱导使双亲不经有性过程而进行遗
传物质的重组以获得新的体细胞杂种［４］。 其中，将融
合亲本进行物理或化学处理使其细胞质或细胞核在一
定程度上失活的不对称体细胞杂交因可提高远缘杂交
成功的几率，增加可育再生植株的可能性而成为体细
胞杂交研究的趋势和热点［５ － ７］。 然而由于原生质体培
养及融合技术操作复杂，不对称体细胞杂交在豆科牧
草育种中的应用仍十分有限，融合方法和技术有待进
一步完善。
清 水 紫 花 苜 蓿 （ Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ Ｌ． ｃｖ．
‘Ｑｉｎｇｓｈｕｉ’）是新近育成的我国第一个刈牧兼用型野
生栽培品种，其适宜于我国西北地区海拔 １ １００ ～ ２
６００ ｍ半湿润、半干旱区种植，可作为刈割兼用草地或
水土保持利用的根茎型野生栽培品种［８］。 里奥百脉
根（Ｌｏｔｕｓ ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ Ｌ． ｃｖ． ‘ Ｌｅｏｎ’）为半匍匐型，具
０４
　 １ 期 紫花苜蓿与百脉根原生质体培养及不对称体细胞杂交
早春生长势强、抗寒、种子产量高的特点［９］，是我国具
有较强适应性和较高生产性能的半匍匐型品种。 本研
究选取清水紫花苜蓿及里奥百脉根作为亲本材料进行
原生质体培养和融合，以改良苜蓿饲用品质为目标，建
立原生质体分离培养的高效再生体系，探索不对称体
细胞杂交技术，为苜蓿抗臌胀病育种新途径提供技术
支持。
１　 材料和方法
１􀆰 １　 材料
清水紫花苜蓿和里奥百脉根种子均由甘肃农业大
学草业生态系统教育部重点实验室提供。
１􀆰 ２　 方法
１􀆰 ２􀆰 １　 愈伤组织的诱导与继代　 剪取供试材料无菌
苗下胚轴（０􀆰 ５ ｃｍ长）及子叶（０􀆰 ５ ｍｍ宽）分别接种于
ＭＳ（ｍｕｒａｓｈｉｎｇ ａｎｄ ｓｋｏｏｇ）愈伤组织诱导培养基上，添
加的植物生长调节剂为：清水紫花苜蓿 ０􀆰 ５ ｍｇ·Ｌ － １
２，４⁃Ｄ ＋ １ ｍｇ·Ｌ － １ ＮＡＡ ＋１ ｍｇ·Ｌ － １ ＢＡ，里奥百脉根
２ ｍｇ·Ｌ － １ ２，４⁃Ｄ ＋ ２ ｍｇ·Ｌ － １ ＫＴ。 每 １５ ～ ２０ ｄ 进行
选择继代，继代 ４ ～ ５ 次后，获得质地良好、结构致密的
淡绿色愈伤组织，用于原生质体的酶解。
表 １　 酶处理组合
Ｔａｂｌｅ １　 Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ／ ％
酶液处理编号
Ｎｏ． ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ
ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
纤维素酶
Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ Ｏｎｏｚｕｋａ Ｒ⁃１０
（Ｙａｋｕｌｔ， Ｊａｐａｎ）
果胶酶
Ｐｅｃｔｉｎａｓｅ Ｙ⁃２３
（Ｗａｋｏ， Ｊａｐａｎ）
半纤维素酶
Ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｅ
（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）
离析酶
Ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ
（Ｙａｋｕｌｔ， Ｊａｐａｎ， ＵＳＡ）
崩溃酶
Ｄｒｉｓｅｌａｓｅ
（Ｓｉｇｍａ， ＵＳＡ）
１ ２ ０􀆰 ５ ０􀆰 ０ ０􀆰 ０ ０􀆰 ０
２ ２ ０􀆰 ５ ０􀆰 ３ ０􀆰 ０ ０􀆰 ０
３ ２ ０􀆰 ５ ０􀆰 ０ ０􀆰 ３ ０􀆰 ０
４ ２ ０􀆰 ５ ０􀆰 ０ ０􀆰 ０ ０􀆰 ３
５ ２ ０􀆰 ５ ０􀆰 ３ ０􀆰 ３ ０􀆰 ３
１􀆰 ２􀆰 ２　 原生质体的分离与纯化　 选择继代培养第 １２
天、未经预处理的愈伤组织，在甘露醇浓度为 ０􀆰 ５５
ｍｏｌ·Ｌ － １的 １ 号酶液组合下（表 １），进行酶解，通过测
定原生质体的产量和活力，确定最佳分离条件。 酶解
时间设为 ４、６、８、１０、１２、１４、１６ ｈ；甘露醇浓度设为
０􀆰 ４、０􀆰 ４５、０􀆰 ５、０􀆰 ５５、０􀆰 ６ ｍｏｌ·Ｌ － １；预处理措施包括
４℃放置 ２４ ｈ的预低温处理（Ⅰ）、２５ ± １℃黑暗条件下
放置 ２４ ｈ 的预暗培养（Ⅱ）、０􀆰 ５５ ｍｏｌ·Ｌ － １蔗糖溶液
及 ０􀆰 ５５ ｍｏｌ·Ｌ － １ ＣＰＷ溶液分别浸泡 １ ｈ 的预质壁分
离（Ⅲ、Ⅳ）等共 ４ 种；愈伤组织继代天数设为 ４、６、８、
１０、１２、１４、１６ ｄ。
　 　 将 １ｇ左右愈伤组织放入装有约 １０ ｍＬ 混合酶液
的三角瓶（５０ ｍＬ）中，在 ２５ ± １℃黑暗条件下，３０ ～ ５０
ｒｐｍ 的摇床上震荡。 经过一定时间的酶解，取酶解材
料分别经 １００、４００ 目无菌尼龙网筛过滤，除去未酶解
完全的组织和细胞团，滤液经 ５０ ｒ·ｍｉｎ － １离心 １０ ～ １２
ｍｉｎ收集原生质体。 收集到的原生质体用 ＣＰＷ⁃１０ 酶
溶剂悬浮，再离心，重复 １ ～ ２ 次。 最后用原生质体培
养液洗涤 １ 次，得到纯化的原生质体。
１􀆰 ２􀆰 ３　 原生质体的培养　 将经洗涤的原生质体重新
悬浮于液体培养基中，调整密度为 ２􀆰 ０ × １０５个·Ｌ － １左
右。 吸取 ２ ～ ３ ｍＬ 悬浮液于直径为 ６０ ｍｍ 的培养皿
中，分别进行液体浅层静置培养［１０］和固液 ＋ 固体培
养。 液体培养基采用 ＫＭ８Ｐ（ｋａｏ ａｎｄ ｍｉｃｈａｙｌｕｋ）培养
基，附加相应的激素组合、１００ ｍｇ·Ｌ － １水解酪蛋白、
１００ ｍｇ·Ｌ － １水解乳蛋白、１％蔗糖、０􀆰 ４ ｍｏｌ·Ｌ － １甘露
醇，ｐＨ值 ５􀆰 ８，经 ０􀆰 ２２μｍ微孔滤膜过滤灭菌。 固液 ＋
固体培养时先在培养皿底部浅铺一薄层 ＭＳ 固体培养
基，再将悬浮于 ＫＭ８Ｐ 液体培养基中的原生质体滴于
其上进行暗培养。 依生长情况逐渐降低甘露醇浓度。
待形成肉眼可见的培养物时，立即将其转入 ＭＳ 培养
基，置于 １２ ｈ光照 １２ ｈ黑暗的条件下培养。
１􀆰 ２􀆰 ４　 原生质体的融合
１􀆰 ２􀆰 ４􀆰 １　 亲本原生质体的制备和钝化处理　 参照本
实验室已摸索出的条件［１１］，选用 ＩＯＡ⁃Ｒ⁃６Ｇ 互补代谢
抑制系统对融合的双亲进行处理。 其中，清水紫花苜
蓿原生质体悬浮于 ３ ｍｍｏｌ·Ｌ － １的 ＩＯＡ 溶液中，里奥
百脉根原生质体悬浮于 ５０ μｇ·ｍＬ － １的 Ｒ⁃６Ｇ溶液中，
在 ２５℃ ± １℃ 分别处理 ５ｍｉｎ，然后离心 ５ ｍｉｎ （５０
ｒ·ｍｉｎ － １），收集原生质体，用 ＣＰＷ⁃１０ 酶溶剂洗涤 ２
次，再用各自的液体培养基洗涤 １ 次。
１􀆰 ２􀆰 ４􀆰 ２　 改良的 ＰＥＧ⁃高 Ｃａ２ ＋ ⁃高 ｐＨ法诱导融合及培
１４
核　 农　 学　 报 ２９ 卷
养　 经钝化的亲本原生质体均悬浮于 ＣａＣｌ２ 洗液中，
密度均调至 ２􀆰 ０ × １０５ 个·Ｌ － １。 先将 ＰＥＧ 融合液小
心滴加到直径 ６ ｃｍ 的培养皿底部，呈分隔开的小液
滴。 将 ２ 种原生质体等体积混合，在相邻小液滴之间
滴加混合液，使液滴之间连通，室温下静置 １０ ｍｉｎ 诱
导融合。 在液滴边沿缓慢加入 １ｍＬ 高 ｐＨ 高 Ｃａ２ ＋洗
液，１０ ｍｉｎ 后缓慢吸出所有液体，如此操作 ４ ～ ５ 次。
培养皿底部沉积的原生质体先用 ＣａＣｌ２ 洗液轻轻洗涤
２ 次，再用选择培养基洗涤 ２ 次，最后加入 ２ ｍＬ 新鲜
液体培养基，进行固液 ＋固体培养。 培养基中添加的
植物激素浓度为 １􀆰 ０ ｍｇ·Ｌ － １ ２，４⁃Ｄ ＋ ０􀆰 ５ ｍｇ·Ｌ － １
ＮＡＡ ＋ ２ ｍｇ·Ｌ － １ ＫＴ，继代并诱导分化。 ＰＥＧ 浓度设
为：３０％ 、３５％ 、４０％ ，统计异源融合率以确定最适的融
合剂浓度。
１􀆰 ２􀆰 ５　 指标测定
１􀆰 ２􀆰 ５􀆰 １　 原生质体产量与活力的测定
原生质体产量利用血球计数板在倒置显微镜下观
察计数，重复 ４ ～ ５ 次。 原生质体活力采用荧光素双醋
酸酯（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ，ＦＤＡ）法在荧光倒置显微镜
下进行染色鉴定。 随机选取 ５ ～ ６ 个视野分别统计荧
光下和普光下原生质体的数量。 计算公式如下［１２］：
１ ｍＬ 悬浮液中的原生质体数 ＝ １ 个大方格悬浮
液（０􀆰 １ｍｍ３，即 ０􀆰 １μＬ）中的细胞数 × １０ × １０００
原生质体活力 ＝ （有活力的原生质体数 ／原生质
体总数） × １００％
１􀆰 ２􀆰 ５􀆰 ２　 原生质体异源融合率的测定
Ｒ⁃６Ｇ钝化的里奥百脉根原生质体在荧光下细胞
质呈红色［１４］，另一亲本清水紫花苜蓿原生质体用 ＦＤＡ
标记，在荧光下其细胞质呈绿色，进行融合处理后，异
核体将显示 ２ 种荧光。 在 ＯＬＹＭＰＵＳ ＤＡ６１ 荧光倒置
显微镜下观察并照相。
异源融合率 ＝ （同时发两种荧光的原生质体数 ／
观察的原生质体总数） × １００％
１􀆰 ２􀆰 ６　 统计分析 　 用 ＳＰＳＳ １６􀆰 ０ 进行差异显著性分
析。
２　 结果与分析
２􀆰 １　 原生质体的分离和培养
２􀆰 １􀆰 １　 酶解时间对紫花苜蓿和百脉根原生质体分离
效果的影响　 由图 １ 可知，随着酶解时间的延长，２ 种
豆科牧草原生质体的产量均呈先增大后降低的趋势，
里奥百脉根的产量总高于清水紫花苜蓿，而清水紫花
苜蓿的活力总高于里奥百脉根。 酶解 １０ ｈ，清水紫花
苜蓿的产量和活力均达最大值，分别为 ９􀆰 ８０ × １０５
个·ｇ － １和 ８４􀆰 ２％ 。 酶解 １２ ｈ，里奥百脉根的产量达
最大值，为 ３􀆰 １４ × １０６个·ｇ － １，活力为 ６０􀆰 ０％ ；酶解 １４
ｈ，活力达最大值为 ６５％ ，但产量较 １２ ｈ 降低 １２􀆰 ９％ 。
综合考虑原生质体的分离效果，适宜清水紫花苜蓿和
了里奥百脉根的最佳酶解时间分别为 １０ ｈ和 １２ ｈ。
图 １　 酶解时间对紫花苜蓿和百脉根原
生质体产量与活力的影响
Ｆｉｇ． １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ ｔｉｍｅ ｏｎ ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ
ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ ａｎｄ
Ｌｏｔｕｓ ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ
２􀆰 １􀆰 ２　 酶液组合对紫花苜蓿和百脉根原生质体分离
效果的影响　 如表 ２ 所示，对于 ２ 种牧草原生质体的
分离效果而言，并不是酶种类越多越好，５ 号酶组合
下，百脉根的产量较高，但活力下降明显。 清水紫花苜
蓿的产量在 ４ 号酶液组合下最高，里奥百脉根的产量
在 ２ 号酶液组合下最高，且此时的活力值均较高。 因
此，适宜这 ２ 个牧草品种最佳的酶液组合分别为 ４ 号
和 ２ 号。
２􀆰 １􀆰 ３　 渗透压稳定剂浓度对紫花苜蓿和百脉根原生质
体分离效果的影响　 由图 ２可知，随着甘露醇浓度的增
加，２种牧草原生质体的产量均呈先增加后降低的趋
势，清水紫花苜蓿的活力总高于里奥百脉根。 甘露醇浓
度为 ０􀆰 ５５ ｍｏｌ·Ｌ －１时，里奥百脉根的产量和活力均达
最大，为 ２􀆰 ５８ ×１０６个·ｇ －１和 ６７􀆰 ４％，此时清水紫花苜蓿
的产量也达最高值（１􀆰 ６１ × １０６个·ｇ －１），甘露醇浓度为
０􀆰 ６ ｍｏｌ·Ｌ －１时，其活力达最大为 ９３􀆰 １％。 综合考虑原
生质体的产量和活力，清水紫花苜蓿和里奥百脉根最适
的甘露醇浓度分别为：０􀆰 ５５ ～０􀆰 ６和 ０􀆰 ５５ ｍｏｌ·Ｌ －１。
２４
　 １ 期 紫花苜蓿与百脉根原生质体培养及不对称体细胞杂交
表 ２　 酶液组合对紫花苜蓿和百脉根原生质体产量和活力的影响
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅｓ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｏｎ ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ ａｎｄ Ｌｏｔｕｓ ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ
酶液组合
Ｅｎｚｙｍｅｓ
ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ
原生质体产量 × １０６
Ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ／ （个·ｇ － １）
原生质体活力
Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ／ ％
清水紫花苜蓿
Ｍ． ｓａｔｉｖａ Ｌ． ｃｖ． ‘Ｑｉｎｇｓｈｕｉ’
里奥百脉根
Ｌｏｔｕｓ ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ Ｌ． ｃｖ． ‘Ｌｅｏｎ’
清水紫花苜蓿
Ｍ． ｓａｔｉｖａ Ｌ． ｃｖ． ‘Ｑｉｎｇｓｈｕｉ’
里奥百脉根
Ｌｏｔｕｓ ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ Ｌ． ｃｖ． ‘Ｌｅｏｎ’
１ １􀆰 ００ ± ０􀆰 ３２ａ ２􀆰 ７８ ± １􀆰 ３０ｂ ７９􀆰 ５ ± ６􀆰 ３４ａ ６９􀆰 ９ ± ３􀆰 ４８ｃ
２ １􀆰 ２０ ± ０􀆰 ３２ｂ ３􀆰 ７６ ± １􀆰 ３４ｄ ７８􀆰 ８ ± ７􀆰 ００ａ ６７􀆰 ４ ± ３􀆰 ５６ｂｃ
３ １􀆰 ４１ ± ０􀆰 ３３ｃ ２􀆰 ０２ ± １􀆰 ７９ａ ７８􀆰 ２ ± ４􀆰 ９６ａ ６９􀆰 １ ± ４􀆰 ０３ｃ
４ １􀆰 ８８ ± ０􀆰 ２６ｅ ２􀆰 ９６ ± ２􀆰 ４１ｂ ７８􀆰 ８ ± ６􀆰 ０６ａ ６３􀆰 ２ ± ３􀆰 ０５ｂ
５ １􀆰 ８０ ± ０􀆰 １７ｄ ３􀆰 ４４ ± １􀆰 ８２ｃ ７８􀆰 ８ ± ６􀆰 １８ａ ５４􀆰 ５ ± ２􀆰 ７２ａ
　 　 注：图中不同小写字母表示 ２ 个品种各处理间的差异显著（ｐ ＜ ０􀆰 ０５）。 下同。
Ｎｏｔｅ： Ｂａｒｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｍａｌｌ ｌｅｔｔｅｒｓ ａｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｔ ｔｈｅ ０􀆰 ０５ ｌｅｖｅｌ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｏｆ ２ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ． Ｔｈｅ ｓａｍｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ．
表 ３　 不同预处理条件对紫花苜蓿和百脉根原生质体产量及活力的影响
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｎ ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ ａｎｄ Ｌｏｔｕｓ ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ
预处理条件
Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ
ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ
原生质体产量 × １０６
Ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ（ｇ Ｆｒｅｓｈ ｗｅｉｇｈｔ） ／ （个·ｇ － １）
原生质体活力
Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ／ ％
清水紫花苜蓿
Ｍ． ｓａｔｉｖａ Ｌ． ｃｖ． ‘Ｑｉｎｇｓｈｕｉ’
里奥百脉根
Ｌｏｔｕｓ ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ Ｌ． ｃｖ． ‘Ｌｅｏｎ’
清水紫花苜蓿
Ｍ． ｓａｔｉｖａ Ｌ． ｃｖ． ‘Ｑｉｎｇｓｈｕｉ’
里奥百脉根
Ｌｏｔｕｓ ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ Ｌ． ｃｖ． ‘Ｌｅｏｎ’
ＣＫ １􀆰 ０２ ± ０􀆰 ２０ｃ ２􀆰 ４４ ± ２􀆰 ０７ａ ８２􀆰 １ ± １􀆰 ６５ａ ６０􀆰 ６ ± ２􀆰 ０７ａ
Ⅰ １􀆰 ４２ ± ０􀆰 ３３ｃ ２􀆰 ５４ ± １􀆰 １４ａ ８１􀆰 ６ ± ０􀆰 ４４ｂ ６３􀆰 ４ ± ２􀆰 ０７ａｂ
Ⅱ １􀆰 ３２ ± ０􀆰 ２４ｃ ２􀆰 ８６ ± １􀆰 １４ｂ ７４􀆰 ０ ± １􀆰 ６１ｃ ６８􀆰 ７ ± ３􀆰 ０８ｃ
Ⅲ １􀆰 ４２ ± ０􀆰 ２６ｂ ２􀆰 ６０ ± ２􀆰 ００ａ ８４􀆰 ６ ± ３􀆰 １７ｂｃ ６２􀆰 ８ ± ２􀆰 ８６ａｂ
Ⅳ １􀆰 ４５ ± ０􀆰 １１ａ ３􀆰 ０６ ± ２􀆰 ３０ｂ ８７􀆰 ３ ± １􀆰 ３３ｂ ６４􀆰 ４ ± ２􀆰 ８８ｂ
图 ２　 甘露醇浓度对紫花苜蓿和百脉
根原生质体产量与活力的影响
Ｆｉｇ． ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍａｎｎｉｔｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｙｉｅｌｄ ａｎｄ
ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ ａｎｄ
Ｌｏｔｕｓ ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ
２􀆰 １􀆰 ４　 预处理条件对紫花苜蓿和百脉根原生质体分
离效果的影响　 本研究表明，与 ＣＫ 相比，４ 种预处理
措施均可提高 ２ 个牧草品种原生质体的产量（表 ３），
除Ⅰ号处理外，其它所有处理的活力均比对照有所增
加。 Ⅳ号处理下，清水紫花苜蓿的产量和活力均达最
大值，分别比对照增加了 ４２􀆰 ２％和 ６􀆰 ３％ ，Ⅱ号处理
下，里奥百脉根的产量较高，活力最大，分别比对照增
加了 １７􀆰 ２％和 １３􀆰 ４％ 。 因此，最适于清水紫花苜蓿和
里奥百脉根原生质体的预处理措施分别是在 ０􀆰 ５５
ｍｏｌ·Ｌ － １ ＣＰＷ溶液浸泡 １ ｈ 的预质壁分离措施及在
黑暗条件下放置 ２４ ｈ的预暗培养。
２􀆰 １􀆰 ５　 继代培养天数对紫花苜蓿和百脉根原生质体
分离效果的影响　 如图 ３ 所示，随着继代天数的增加，
２ 种牧草原生质体的产量和活力均呈先增大后降低的
趋势。 各处理下，里奥百脉根的产量均高于清水紫花
苜蓿，后者的活力总高于前者。 继代第 １２ 天，清水紫
花苜蓿的产量和活力均达最大值，分别为 １􀆰 ９５ × １０６
３４
核　 农　 学　 报 ２９ 卷
个·ｇ － １和 ８９􀆰 ７％ ，百脉根的产量和活力分别在第 ８ 天
和第 １０ 天达最高值，分别为 ３􀆰 ０６ × １０６个·ｇ － １和
７３􀆰 １％ 。 因此，适宜 ２ 个品种的最佳继代时间分别为
第 １２ 天和第 ８ ～ １０ 天。
图 ３　 愈伤组织继代时间对紫花苜蓿和
百脉根原生质产量与活力的影响
Ｆｉｇ． ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅ ｏｎ ｙｉｅｌｄ
ａｎｄ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｇｏ
ｓａｔｉｖａ ａｎｄ Ｌｏｔｕｓ ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ
表 ５　 不同 ＰＥＧ浓度下紫花苜蓿和百脉根原生质体融合情况
Ｔａｂｌｅ ５　 Ｆｕｓｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ ａｎｄ Ｌｏｔｕｓ ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ＰＥＧ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｔｒｅａｍｅｎｔｓ
ＰＥＧ浓度
ＰＥＧ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ／ ％
原生质体总数
Ｔｏｔａｌ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ
ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ
异源融合体数
Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｆｕｓｉｏｎ
ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ
异源融合率
Ｆｕｓｉｏｎ ｒａｔｉｏ ｏｆ
ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ／ ％
存活情况
Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
３０ ７５ ２ ２􀆰 ６ 可存活
３５ １３０ ４ ３􀆰 １ 可存活
４０ １２５ ４ ３􀆰 ２ 停止发育或逐渐褐化死亡
２􀆰 １􀆰 ６　 不同培养方法对紫花苜蓿和百脉根原生质体
培养效果的影响　 本研究采用了液体浅层培养方法和
固液双层培养法对经纯化后的 ２ 种豆科牧草的原生质
体进行前期培养，结果表明，固液双层培养法优于液体
浅层培养法。 培养后第 ２ ～ ３ 天，在倒置显微镜下可观
察到 ２ 种原生质体再生细胞开始发生第 １ 次、第 ２ 次
和多次分裂（图 ４Ａ ～ Ｄ）其中清水紫花苜蓿游离出的
原生质体呈淡黄色，里奥百脉根原生质体则呈绿色。
培养第 ５ ～ ７ 天，可观察到几十个至上百个再生的细胞
团，此时液体培养基中细胞团粘连现象较严重，褐化率
偏高。 培养到第 １０ ～ １５ 天，２ 种牧草原生质体均可形
成肉眼可见的乳白色小愈伤芽。 将长至 ０􀆰 ５ ～ １􀆰 ５ ｍｍ
的小愈伤芽小心挑出转入含相应激素浓度的固体培养
基，经 ２ ～ ３ 次继代后，清水紫花苜蓿原生质体可再生
愈伤组织（图 ４Ｅ － Ｆ），但经多次继代调整，始终不能
形成胚状体，难以分化成植株。 里奥百脉根愈伤组织
在一定的激素浓度下可直接萌发出胚状体，最终获得
再生植株（图 ４Ｇ － Ｈ）。
２􀆰 ２　 原生质体的融合与融合细胞的培养
２􀆰 ２􀆰 １　 改良的 ＰＥＧ⁃高 Ｃａ２ ＋ －高 ｐＨ法对不对称体细
胞杂交效果的影响 　 本研究将 ＰＥＧ⁃高 Ｃａ２ ＋ －高 ｐＨ
法进行了改良，先加入 ＰＥＧ 融合剂，然后再添加混合
的原生质体，在荧光倒置显微镜下发现，发出不同荧光
的原生质体经诱导融合后立即开始接近，融合后的异
核体同时发出 ２ 种颜色的荧光（图 ５）。 将高 ｐＨ 高
Ｃａ２ ＋洗液加入融合液中 １０ ｍｉｎ 后，立即吸出所有液
体，这样重复操作 ４ ～ ５ 次，以保证最大程度上将 ＰＥＧ
融合剂尽快移出，直至倒置显微镜下观察，原生质体恢
复呈球形。 收集经洗涤的培养皿底部沉积的原生质体
后，将融合产物放入固液双层培养基中进行前期培养。
ＰＥＧ浓度对融合效果有显著影响（表 ５）。 ＰＥＧ浓度较
低时，原生质体聚集缓慢，异源融合率低；ＰＥＧ 浓度较
高时，混合在一起的原生质体紧密粘连，质膜受损严
重，破碎比例增大。 ３０％的 ＰＥＧ浓度对清水紫花苜蓿
和里奥百脉根原生质体融合最为适合，异源融合率可
达 ３􀆰 １％ 。
２􀆰 ２􀆰 ２　 融合后原生质体的培养 　 经 ＩＯＡ⁃Ｒ⁃６Ｇ 互补
代谢抑制系统对融合的双亲进行处理后，未经融合的
原生质体和其同源融合的细胞在固液培养基上均不能
再生愈伤组织，只有异源融合后的原生质体可持续分
裂，生长成愈伤组织。 融合后的异核体在培养至第 ３
～ ４ ｄ可见再生细胞的第 １ 次和第 ２ 次细胞分裂，１ 周
左右，可观察到多个再生的小细胞团（图 ６Ａ ～ Ｃ），２ 周
后持续分裂的细胞团形成肉眼可见的黄绿色小愈伤组
４４
　 １ 期 紫花苜蓿与百脉根原生质体培养及不对称体细胞杂交
注：Ａ： 清水紫花苜蓿原生质体再生细胞的第一次分裂（ × １００）；Ｂ： 清水紫花苜蓿原生质体再生细胞的第二次分裂
（ × １００）；Ｃ： 里奥百脉根原生质体再生细胞的第一次分裂（ × １００）；Ｄ： 里奥百脉根原生质体再生细胞的第二次分
裂（ × １００）；Ｅ： 清水紫花苜蓿原生质体再生的微愈伤组织；Ｆ： 清水紫花苜蓿原生质体再生的淡黄色愈伤组织；
　 　 　 Ｇ： 里奥百脉根原生质体再生的绿色胚性愈伤组织；Ｈ： 里奥百脉根原生质体的再生植株。
Ｎｏｔｅ：Ａ：Ｆｉｒｓｔ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｆｒｏｍ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ Ｍ． ｓａｔｉｖａ Ｌ． ｃｖ． Ｑｉｎｇｓｈｕｉ（ × １００） ． Ｂ：Ｓｅｃｏｎｄ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ
ｆｒｏｍ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ Ｑｉｎｇｓｈｕｉ（ × １００） ． Ｃ：Ｆｉｒｓｔ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｆｒｏｍ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ Ｌ． ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ（ ×
１００）． Ｄ： Ｓｅｃｏｎｄ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｆｒｏｍ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ Ｌ． ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ （ × １００）． Ｅ：Ｍｉｎｉ Ｃａｌｌｉ ｆｏｒｍｅｄ ｆｒｏｍ
ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ Ｑｉｎｇｓｈｕｉ；． Ｆ： Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｃａｌｌｉ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ Ｑｉｎｇｓｈｕｉ；． Ｇ： Ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｆｏｒｍｅｄ ｆｒｏｍ
　 　 　 　 ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｃａｌｌｉ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ Ｌ． ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ． Ｈ：Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｐｌａｎｔ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ Ｌ． ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ．
图 ４　 苜蓿和百脉根原生质体的分离和再生
Ｆｉｇ． ４　 Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｆｒｏｍ ａｌｆａｌｆａ ａｎｄ Ｌ． ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ
注：Ａ： 苜蓿和百脉根原生质体开始融合； Ｂ： 苜蓿和百脉根原生质
体融合产生的异核体。
Ｎｏｔｅ：Ａ：Ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｆｕｓｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｌｆａｌｆａ ａｎｄ Ｌ． ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ．
Ｂ： ｓｏｍａｔｉｃ ｈｙｂｒｉｄ ｆｏｒｍｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｓｏｍａｔｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ
　 　 　 ｂｅｔｗｅｅｎ ａｌｆａｌｆａ ａｎｄ Ｌ． ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ．
图 ５　 苜蓿和百脉根原生质体的融合
Ｆｉｇ． ５　 Ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｆｒｏｍ ａｌｆａｌｆａ ａｎｄ Ｌ． ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ
织芽。 １ 个月左右，愈伤组织直径可达 ０􀆰 ５ ｃｍ，此时将
这些愈伤组织转入含 ２，４⁃Ｄ，ＮＡＡ 和 ＫＴ 的培养基上
进一步进行增殖和分化，部分愈伤出现了绿色的芽状
体（图 ６Ｄ － Ｆ），但始终未能分化长出小苗，个别再生
愈伤则出现水渍化现象，终止发育。
３　 讨论
３􀆰 １　 酶液组合和酶解时间对紫花苜蓿和百脉根原生
质体分离效果的影响
不同植物材料因其细胞壁成分和结构不同，所用
酶的种类、浓度和处理时间均有差异［１５］。 徐子勤
等［１６］将紫花苜蓿胭脂碱型农杆菌转化愈伤组织用
２％纤维素酶、０􀆰 ５％果胶酶及 ０􀆰 ５％半纤维素酶的酶
组合，酶解 ６ ｈ，获得了再生愈伤组织。 刘明志［１７］采用
２％纤维素酶 ＋ １％果胶酶 ＋ ０􀆰 ５％离析酶 ＋ ０􀆰 ３ 半纤
维素酶 ＋ ０􀆰 ２％崩溃酶的组合，酶解里奥百脉根愈伤组
织 ６ ～ １０ ｈ，获得原生质体再生植株。 本研究表明，仅
有纤维素酶和果胶酶时，清水紫花苜蓿和里奥百脉根
原生质体的产量均偏低，５ 种酶制剂共同添加时原生
质体的产量虽提高，但活力均最低。 本研究中 ２ 种牧
５４
核　 农　 学　 报 ２９ 卷
草愈伤组织酶解的最佳时间均较长，分别为 １０ ｈ和 １２
ｈ，这与它们用于酶解的愈伤组织状态有关。 清水紫花
苜蓿为野生栽培品种，其愈伤组织诱导及继代的 ２，４⁃
Ｄ浓度仅为 ０􀆰 ５ ｍｇ·Ｌ － １，低于常见的 ２􀆰 ０ ｍｇ·Ｌ － １，
由此产生的愈伤组织呈淡黄色，质地较致密。 百脉根
是一种再生性能很好的牧草，由其下胚轴及子叶诱导
而来的愈伤组织多呈颗粒状，质地偏硬，且容易萌发出
胚状体。 因此，２ 种愈伤组织较致密的质地造成它们
酶解时需要更长的时间。
３􀆰 ２　 渗透压稳定剂、预处理措施和继代培养天数对紫
花苜蓿和百脉根原生质体分离效果的影响
分离原生质体时，添加适宜浓度的渗透压稳定剂
对原生质体的产出和稳定具有重要意义［１８］。 豆科牧
草酶解时最常用的渗透压稳定剂是甘露醇，浓度通常
为 ０􀆰 ３５ ～ ０􀆰 ８ ｍｏｌ·Ｌ － １。 本研究表明，０􀆰 ５５ ～ ０􀆰 ６ ｍｏｌ
·Ｌ － １的甘露醇浓度范围内，２ 种牧草原生质体的产量
和活力可分别达最大值，此时大部分原生质体呈圆球
形或椭圆形，边缘清晰，碎片少。 这与 Ｏｌｖｅｉｒａ 等［１９］认
为 ０􀆰 ５５ ～ ０􀆰 ６ ｍｏｌ·Ｌ － １的甘露醇浓度最适宜于原生质
体分离和保存的结果相同。
有研究指出酶解前采取适当的预处理措施可促进
原生质体的产出［１８ ，２０］。 本研究所采用的 ４ 种预处理
措施均可提高 ２ 种豆科牧草原生质体的产量，其中，在
０􀆰 ５５ ｍｏｌ·Ｌ － １ ＣＰＷ溶液浸泡 １ ｈ 的措施最适于清水
紫花苜蓿原生质体的游离，这可能是因为预质壁分离
措施可使细胞壁内的原生质部分收缩，细胞膜结构改
变，从而避免酶解时所造成的损伤，促进细胞壁在小面
积破损条件下释放原生质体，提高原生质体产量的缘
故。 里奥百脉根愈伤组织在黑暗条件下放置 ２４ ｈ 后
再进行酶解可显著提高其产量和活力，这是由于预暗
培养促使细胞的分裂同步，生理状态达到一致的缘故。
愈伤组织的状态是影响原生质体分离效果的另一
个关键因素。 赵小强等［２１］在研究草地早熟禾品种新格
莱德愈伤组织原生质体分离条件时发现，继代第 ９ 天的
愈伤酶解时可获得最高的活力。 金红等［２２］发现转入新
鲜培养基上的草木樨黄芪甲硫氨酸变异系愈伤组织在
培养到第 ８天时为用作原生质体分离的最佳时间。 本
研究中 ２种牧草愈伤组织最佳继代时间分别为第 １２ 天
和第 ８ ～１０天，此时愈伤组织处于旺盛生长期，这种状
态有利于原生质体的游离和培养。 在后期的培养中，原
生质体再生细胞的分裂旺盛，再生能力强。
３􀆰 ３　 改良的 ＰＥＧ⁃高 Ｃａ２ ＋ ⁃高 ｐＨ 法对苜蓿和百脉根
原生质体融合效果的影响
ＰＥＧ法自 ２０ 世纪 ７０ 年代诞生以来，已发展成为
一种规范的重要化学融合方法［２３］。 其最大的优点在
于费用低廉，因而被广泛应用于植物体细胞融合中。
但其融合率还是较低的，一般只有 １％ ～ ５％ ，提高
ＰＥＧ浓度或延长处理时间可提高融合率［２４］。 但这将
导致细胞活力的下降［２５］。 甚至导致线粒体严重破
坏［２６］。 本研究将 ＰＥＧ⁃高 Ｃａ２ ＋ ⁃高 ｐＨ法进行了适当调
整和改良，结果表明先添加融合剂再加入原生质体混
合液可缩短融合的时间，在倒置显微镜下可观察到双
亲原生质体融合时保持了较高的活力，融合速度快。
洗涤融合剂时，每添加一次高 Ｃａ２ ＋ ⁃高 ｐＨ 洗液，均要
慢慢吸出，这样的洗涤效果好于添加 ４ ～ ５ 次洗液后一
起移出，可最大程度上消除 ＰＥＧ融合剂的残留。 结果
表明最适 ＰＥＧ浓度下异源融合率为 ３􀆰 １％ ，大部分融
合细胞的细胞质丰富，细胞分裂旺盛。
３􀆰 ４　 培养方法对苜蓿和百脉根原生质体和融合产物
培养效果的影响
常见的原生质体及其融合产物的培养方法有固体
培养法、液体浅层培养法、固液培养法及看护培养法
等。 其中，液体浅层培养因对原生质体的损伤小，且易
于添加新鲜培养基［４］ 而在苜蓿［１５ － １６ ，２７ － ２８］、红豆
草［２９ － ３０］、百脉根［１７］等豆科牧草中得到了广泛的应用。
本研究在原生质体培养的前期分别采用固液双层及液
体浅层培养法，结果发现固液培养基中再生细胞的粘
连现象较液体浅层培养基中少，分裂速度快而褐化率
较低。 这是由于固体培养基中的营养物质可缓慢释放
到液体培养基中，补充消耗，同时又能保持较好湿度的
缘故。 形成肉眼可见的培养物后即转至固体培养基。
２ 种豆科牧草原生质体经 ２ ～ ３ 个月的固液 ＋固体培
养模式即可分别获得再生愈伤组织及再生植株，融合
产物需 ２ 个月左右可形成愈伤组织。 从操作过程和培
养效果看，固液 ＋固体培养模式既可促进培养物的分
裂和再生，缩短再生周期，又能降低褐化率，是更有利
于豆科牧草原生质体及其融合产物培养的方法。
４　 结论
适于清水紫花苜蓿原生质体酶解的最佳条件为：
２％纤维素酶 ＋ ０􀆰 ５％果胶酶 ＋ ０􀆰 ３％崩溃酶的酶液组
合，酶解 １０ ｈ，酶液渗透压即甘露醇浓度为 ０􀆰 ５５ ～ ０􀆰 ６
ｍｏｌ·Ｌ － １，愈伤继代培养天数为 １２ ｄ，预处理措施为
０􀆰 ５５ ｍｏｌ·Ｌ － １ ＣＰＷ 溶液浸泡 １ ｈ。 最佳酶解条件下
获得的原生质体经 ２ ～ ３ 个月的固液 ＋固体培养模式
可获得再生愈伤组织。
适于里奥百脉根原生质体酶解的最佳条件为：２％
６４
　 １ 期 紫花苜蓿与百脉根原生质体培养及不对称体细胞杂交
注：Ａ： 苜蓿和百脉根原生质体融合产物的第一次分裂： Ｂ： 苜蓿和百脉根原生质体融合产物的第二次分裂 ； Ｃ： 苜蓿和百脉根原生质体融合产物再
生的细胞团 ； Ｄ： 苜蓿和百脉根原生质体融合后再生的小愈伤组织 ；Ｅ： 苜蓿和百脉根原生质体融合后再生的愈伤组织 ；Ｆ： 苜蓿和百脉根融合后再
　 　 　 　 生愈伤组织萌发出胚状体 。
Ｎｏｔｅ：Ａ：Ｆｉｒｓｔ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ Ｍ． ｓａｔｉｖａ Ｌ． ｃｖ． Ｑｉｎｇｓｈｕｉ ａｎｄ Ｌ． ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ． Ｂ：Ｓｅｃｏｎｄ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ Ｍ． ｓａｔｉｖａ Ｌ． ｃｖ． Ｑｉｎｇｓｈｕｉ
ａｎｄ Ｌ． ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ． Ｃ：Ｃｅｌｌ ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｏｆ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ Ｍ． ｓａｔｉｖａ Ｌ． ｃｖ． Ｑｉｎｇｓｈｕｉ ａｎｄ Ｌ． ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ． Ｄ：Ｍｉｎｉ Ｃａｌｌｉ ｆｏｒｍｅｄ ｆｒｏｍ ｆｕｓｉｏｎ
ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ Ｍ． ｓａｔｉｖａ Ｌ． ｃｖ． Ｑｉｎｇｓｈｕｉ ａｎｄ Ｌ． ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ． Ｅ：Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｃａｌｌｉ ｆｒｏｍ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ Ｍ． ｓａｔｉｖａ Ｌ． ｃｖ． Ｑｉｎｇｓｈｕｉ ａｎｄ Ｌ． ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ． Ｆ：
　 　 　 　 Ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｓ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｃａｌｌｉ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ Ｍ． ｓａｔｉｖａ Ｌ． ｃｖ． Ｑｉｎｇｓｈｕｉ ａｎｄ Ｌ． ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ．
图 ６　 苜蓿和百脉根原生质体融合产物的分离和再生
Ｆｉｇ． ６　 Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｆｒｏｍ ａｌｆａｌｆａ ａｎｄ Ｌ． ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ
纤维素酶 ＋ ０􀆰 ５％果胶酶 ＋ ０􀆰 ３％半纤维素酶的酶液
组合，酶解 １２ ｈ，甘露醇浓度为 ０􀆰 ５５ ｍｏｌ·Ｌ － １，愈伤继
代培养天数为 ８ ～ １０ ｄ，预处理措施为黑暗条件下放置
２４ ｈ。 最佳酶解条件下获得的原生质体经 ２ ～ ３ 个月
的固液 ＋固体培养模式可获得再生植株。
清水紫花苜蓿原生质体采用 ３ ｍｍｏｌ·Ｌ － １ ＩＯＡ处
理 １０ ｍｉｎ，里奥百脉根采用 ５０ μｇ·ｍＬ － １ ／ Ｒ⁃６Ｇ 处理
１０ ｍｉｎ，采用改良的 ＰＥＧ⁃高 Ｃａ２ ＋ －高 ｐＨ 法进行不对
称体细胞杂交，ＰＥＧ（６０００）最适浓度为 ３５％ ，异源融
合率为 ３􀆰 １％ ，异核体培养第 ３ ～ ４ 天可见再生细胞的
第 １ ～ ２ 次分裂，经 ２ ～ ３ 个月的固液 ＋固体培养模式
最终获得苜蓿与百脉根的杂种愈伤组织。
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ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ
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Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｅｔｗｅｅｎ
Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ ａｎｄ Ｌｏｔｕｓ ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ
ＬＩ Ｙｕ⁃ｚｈｕ１ 　 ＳＨＩ Ｓｈａｎｇ⁃ｌｉ１
（Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｇｒａｓｓｌａｎｄ Ｅｃｏｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ／ Ｐｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｇａｎｓｕ ｐｒｏｖｉｎｃｅ ／ Ｐｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｇａｎｓｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ／ Ｓｉｎｏ⁃ＵＳ Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｇｒａｚｉｎｇｌａｎｄ Ｅｃｏｓｙｓｔｅｍ Ｓｕｓｔａｉｎａｂｉｌｉｔｙ， Ｌａｎｚｈｏｕ， Ｇａｎｓｕ　 ７３００７０）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｃａｌｌｉ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ Ｌ． ｃｖ． Ｑｉｎｇｓｈｕｉ ａｎｄ Ｌｏｔｕｓ ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ Ｌ． ｃｖ． Ｌｅｏｎ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ
ｏｆ ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ ｔｉｍｅ， ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ， ｏｓｍｏｔｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ， ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅ， ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｍｅａｓｕｒｅｓ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ
ｍｅｔｈｏｄｓ ｓｏ ａｓ ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｏｎ， ｔｈｅｎ ｔｈｅ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｓｏｍａｔｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗａｓ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ
ｂｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＰＥＧ⁃ｈｉｇｈ Ｃａ２ ＋ － ｈｉｇｈ ｐＨ ｍｅｔｈｏｄｓ， ａｎｄ ｔｅｓｔｅｄ ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｒａｔｅ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｔａｉｎｉｎｇ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ
ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｌｆａｌｆａ ａｎｄ ｂｉｒｄｓｆｏｏｔ ｔｒｅｆｏｉｌ ｃａｎ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｃａｌｌｕｓ ｏｆ ｐｒｅ⁃ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｏｒ ８
～ １２ ｄ， ｐｒｅｐｌａｓｍｏｌｙｚｉｎｇ ｉｎ ＣＰＷ⁃１０ ｆｏｒ １ ｈ ｏｒ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｉｎ ｄａｒｋｎｅｓｓ ｆｏｒ ２４ ｈ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ０􀆰 ５５ ｔｏ ０􀆰 ６ ｍｏｌ·Ｌ － １
ｍａｎｎｉｔｏｌ． Ｗｉｔｈ ２％ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｏｎｏｚｕｋａ Ｒ⁃１０ ＋ ０􀆰 ５％ ｐｅｃｔｉｎａｓｅ Ｙ － ２３ ＋ ０􀆰 ３ ％ ｄｒｉｓｅｌａｓｅ ｈａｒｖｅｓｔｅｄ ａｔ １０ ｈ ｆｏｒ Ｑｉｎｇｓｈｕｉ
ａｎｄ ｗｉｔｈ ２％ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｏｎｏｚｕｋａ Ｒ⁃１０ ＋ ０􀆰 ５％ ｐｅｃｔｉｎａｓｅ Ｙ － ２３ ＋ ０􀆰 ３％ ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｈａｒｖｅｓｔｅｄ ａｔ １２ ｈ ｃａｎ ｇｅｔ
ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｃａｌｌｉ ａｎｄ ｐｌａｎｔｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｏｌｉｄ⁃ｌｉｑｕｉｄ ＋ ｓｏｌｉｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐａｔｔｅｒｎ ａｆｔｅｒ ２ ～ ３ ｍｏｎｔｈｓ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． ‘Ｑｉｎｇｓｈｕｉ’
ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｗａｓ ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ｉｎ ３ ｍｍｏｌ·Ｌ － １ ＩＯＡ ａｎｄ ‘Ｌｅｏｎ’ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｗａｓ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｉｎ ５０ μｇ·ｍＬ － １ Ｒ⁃６Ｇ， ａｎｄ ｔｈｅ
ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｓｏｍａｔｉｃ ｈｙｂｒｉｄ ｃａｌｌｉ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅｍ ｗｉｔｈ ３􀆰 １％ ｆｕｓｉｏｎ ｒａｔｅ， ａｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ＰＥＧ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｗａｓ ３５％ ｉｎ ｉｔ． Ｔｈｅ ｈｙｂｒｉｄ ｃａｌｌｉ ｏｆ ａｌｆａｌｆａ ａｎｄ Ｌｏｔｕｓ ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ ｗｉｌｌ ｂｅｃｏｍｅ ｎｅｗ ｇｅｒｍｐｌａｓｍ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｆｏｒ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇ
ａｎｔｉ⁃ｂｌｏａｔ ａｌｆａｌｆａ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ， Ｌｏｔｕｓ ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ， ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ， ｃｕｌｔｕｒｅ， ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｓｏｍａｔｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ
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