全 文 ：摇 核 农 学 报摇 圆园员圆袁圆远渊猿冤院园源园怨 耀 园源员缘允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
文章编号院员园园园鄄愿缘缘员渊圆园员圆冤园猿鄄园源园怨鄄园苑
收稿日期院圆园员员鄄园愿鄄圆远摇 接受日期院圆园员员鄄员园鄄圆缘
基金项目院公益性行业渊农业冤科研专项经费渊圆园员员园猿园园苑冤袁国际原子能机构协调研究项目 渊悦孕砸员缘远缘缘冤袁国家自然科学基金项目渊员员苑缘员缘源冤袁中央
高校基本科研业务费专项资金渊圆园员员载在在载园园远冤
作者简介院李瑞清渊员怨愿源鄄冤袁男袁山西静乐人袁博士研究生袁研究方向为水稻诱变遗传育种遥
通讯作者院舒庆尧渊员怨远缘鄄冤袁男袁浙江新昌人袁研究员袁从事水稻遗传育种与生物技术研究遥 耘鄄皂葬蚤造院 择赠泽澡怎岳 扎躁怎援 藻凿怎援 糟灶
水稻 阅晕粤损伤修复同源基因纯合突变系的鉴定
李瑞清员 摇 富昊伟圆 摇 崔海瑞猿 摇 张华丽猿 摇 舒庆尧猿
渊员郾 浙江大学作物科学研究所袁浙江 杭州摇 猿员园园圆怨曰圆郾 嘉兴市农业科学研究院袁浙江 嘉兴摇 猿员源园员远曰
猿郾 浙江大学原子核农业科学研究所袁水稻生物学国家重点实验室和农业部 辕浙江省核农学重点实验室袁浙江 杭州摇 猿员园园圆怨冤
摘摇 要院在长期的进化过程中袁生物逐步形成了应对各种 阅晕粤损伤的修复机制袁以保护基因组的完整性袁
减轻或消除 阅晕粤损伤的影响遥 本研究通过同源搜索找到了与 阅晕粤 损伤修复相关水稻同源基因袁在水
稻插入突变体库中搜索出插入突变系袁并成功引进了其中的 圆远 份 栽员 代突变材料遥 通过对插入位点的
分子鉴定和进一步培育袁获得了 员源 份涉及 愿 个水稻 阅晕粤 损伤修复同源基因的 栽猿 代纯合插入突变系袁
并对其进行了初步的遗传分析和表型考察遥 这些纯合突变系涉及的水稻基因可能在 阅晕粤 错配修复
渊韵泽园圆早园缘怨圆猿园园尧 韵泽园怨早园源园苑远园园尧 韵泽员园早园缘园怨园园园 冤 和碱基切除修复 渊 韵泽园圆早园源远缘员员圆尧 韵泽园远早园远源猿远园园尧
韵泽园缘早园缘远苑缘园园尧韵泽园源早园远苑猿源园园尧韵泽园怨早园源圆园猿园园冤中发挥重要作用遥 与亲本相比袁除 员 份材料外袁其他纯合
突变体系及其野生型姐妹系的结实率均有显著降低曰 某些纯合突变系的千粒重与亲本相比有显著下
降遥 这些水稻 阅晕粤损伤修复基因突变系的育成为开展水稻 阅晕粤修复的遗传学和分子生物学研究以及
培育抗逆水稻提供了珍贵的实验材料遥
关键词院水稻曰 栽鄄阅晕粤 突变系曰 栽燥泽员苑 突变系曰 阅晕粤损伤修复
陨阅耘晕栽陨云陨悦粤栽陨韵晕 韵云 匀韵酝韵在再郧韵哉杂 酝哉栽粤晕栽 蕴陨晕耘杂 韵云 郧耘晕耘杂
陨晕灾韵蕴灾耘阅 陨晕 阅晕粤 阅粤酝粤郧耘 砸耘孕粤陨砸 陨晕 砸陨悦耘
蕴陨 砸怎蚤鄄择蚤灶早员 摇 云哉 匀葬燥鄄憎藻蚤圆 摇 悦哉陨 匀葬蚤鄄则怎蚤猿 摇 在匀粤晕郧 匀怎葬鄄造蚤猿 摇 杂匀哉 匝蚤灶早鄄赠葬燥猿
渊员郾 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣 悦则燥责 杂糟蚤藻灶糟藻泽袁 在澡藻躁蚤葬灶早 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 匀葬灶早扎澡燥怎袁 在澡藻躁蚤葬灶早摇 猿员园园圆怨曰
圆郾 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽袁 允蚤葬曾蚤灶早 悦蚤贼赠袁 允蚤葬曾蚤灶早袁 在澡藻躁蚤葬灶早摇 猿员源园员远曰
猿郾 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣 晕怎糟造藻葬则鄄粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽袁 在澡藻躁蚤葬灶早 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 匀葬灶早扎澡燥怎袁 在澡藻躁蚤葬灶早摇 猿员园园圆怨冤
粤遭泽贼则葬糟贼院陨灶 贼澡藻 责则燥糟藻泽泽 燥枣 遭蚤燥造燥早蚤糟葬造 藻增燥造怎贼蚤燥灶袁 燥则早葬灶蚤泽皂泽 澡葬增藻 凿藻增藻造燥责藻凿 阅晕粤 则藻责葬蚤则 皂藻糟澡葬灶蚤泽皂泽 则藻泽责燥灶凿蚤灶早 贼燥 增葬则蚤燥怎泽
贼赠责藻泽 燥枣 阅晕粤 凿葬皂葬早藻 贼燥 责则燥贼藻糟贼 早藻灶燥皂藻 蚤灶贼藻早则蚤贼赠 葬灶凿 则藻皂燥增藻 燥则 皂蚤灶蚤皂蚤扎藻 贼澡藻 藻枣枣藻糟贼 燥枣 阅晕粤 凿葬皂葬早藻援 栽澡则燥怎早澡 澡燥皂燥造燥早
泽藻葬则糟澡袁 贼澡藻 则蚤糟藻 早藻灶藻泽 澡燥皂燥造燥早燥怎泽 贼燥 阅晕粤 凿葬皂葬早藻 则藻责葬蚤则 早藻灶藻泽 憎藻则藻 蚤凿藻灶贼蚤枣蚤藻凿援 酝怎贼葬灶贼 造蚤灶藻泽 憎蚤贼澡 贼澡藻 早藻灶藻泽 蚤灶泽藻则贼藻凿
藻蚤贼澡藻则 遭赠 葬 栽鄄阅晕粤 燥则 栽燥泽员苑 憎藻则藻 泽藻葬则糟澡藻凿 蚤灶 皂怎贼葬灶贼 凿葬贼葬遭葬泽藻泽袁 葬灶凿 圆远 栽员 造蚤灶藻泽 憎藻则藻 泽怎糟糟藻泽泽枣怎造造赠 蚤灶贼则燥凿怎糟藻凿援 酝燥造藻糟怎造葬则葬灶葬造赠泽藻泽 燥枣 蚤灶泽藻则贼蚤燥灶 泽蚤贼藻泽 藻灶葬遭造藻凿 贼澡藻 蚤凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 员源 澡燥皂燥扎赠早燥怎泽 栽猿 皂怎贼葬灶贼 造蚤灶藻泽 贼澡葬贼 蚤灶增燥造增藻凿 愿 阅晕粤 凿葬皂葬早藻 则藻责葬蚤则早藻灶藻泽援 孕则藻造蚤皂蚤灶葬则赠 早藻灶藻贼蚤糟 葬灶凿 葬早则燥灶燥皂蚤糟 贼则葬蚤贼 葬灶葬造赠泽藻泽 憎藻则藻 葬造泽燥 责藻则枣燥则皂藻凿援 栽澡藻 则蚤糟藻 早藻灶藻泽 贼澡葬贼 葬则藻 凿蚤泽则怎责贼藻凿 蚤灶 贼澡藻泽藻
员源 皂怎贼葬灶贼 造蚤灶藻泽 责则燥遭葬遭造赠 责造葬赠 则燥造藻泽 蚤灶 阅晕粤 皂蚤泽皂葬贼糟澡 则藻责葬蚤则 渊韵泽园圆早园缘怨圆猿园园袁 韵泽园怨早园源园苑远园园袁 韵泽员园早园缘园怨园园园冤 葬灶凿
遭葬泽藻 藻曾糟蚤泽蚤燥灶 则藻责葬蚤则 渊韵泽园圆早园源远缘员员圆袁 韵泽园远早园远源猿远园园袁 韵泽园缘早园缘远苑缘园园袁 韵泽园源早园远苑猿源园园袁 韵泽园怨早园源圆园猿园园冤援 悦燥皂责葬则藻凿
憎蚤贼澡 憎蚤造凿 贼赠责藻 责葬则藻灶贼泽袁 贼澡藻 泽藻藻凿 泽藻贼 燥枣 员猿 皂怎贼葬灶贼 造蚤灶藻泽 燥枣 遭燥贼澡 澡燥皂燥扎赠早燥怎泽 皂怎贼葬灶贼 责造葬灶贼泽 葬灶凿 憎蚤造凿 贼赠责藻 泽蚤遭造蚤灶早泽 憎葬泽
泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼造赠 则藻凿怎糟藻凿袁 憎澡蚤造藻 泽燥皂藻 燥枣 贼澡藻皂 澡葬凿 则藻凿怎糟藻凿 早则葬蚤灶 憎藻蚤早澡贼援 栽澡藻泽藻 皂怎贼葬灶贼 造蚤灶藻泽 泽澡燥怎造凿 泽藻则增藻 葬泽 增葬造怎葬遭造藻
皂葬贼藻则蚤葬造泽 枣燥则 早藻灶藻贼蚤糟 葬灶凿 遭蚤燥造燥早蚤糟葬造 泽贼怎凿蚤藻泽 燥灶 阅晕粤 凿葬皂葬早藻 则藻责葬蚤则 葬灶凿 蚤皂责则燥增藻皂藻灶贼 燥枣 葬遭蚤燥贼蚤糟 泽贼则藻泽泽 贼燥造藻则葬灶糟藻 蚤灶 则蚤糟藻援
怨园源
核摇 农摇 学摇 报 圆远 卷
运藻赠 憎燥则凿泽院则蚤糟藻曰 栽鄄阅晕粤 皂怎贼葬灶贼曰 栽燥泽 员苑 皂怎贼葬灶贼曰 阅晕粤 凿葬皂葬早藻 则藻责葬蚤则
摇 摇 生物细胞基因组的完整性时刻遭受各种细胞内外
环境因子的胁迫袁如紫外线渊主要是 哉灾鄄月冤尧离子射
线尧各种化学介质等环境因子咱员 耀 猿暂和细胞代谢过程中
产生的活性氧渊砸韵杂冤等胞内因子咱源袁缘暂 遥 在长期的进化
过程中袁生物逐步形成了应对各种 阅晕粤损伤的修复机
制袁以保护基因组的完整性袁减轻或消除 阅晕粤 损伤的
影响袁如负责错配位点尧脱碱基位点尧单链损伤渊杂杂砸泽冤
等修复的错配修复渊酝酝砸冤或碱基切除修复渊月耘砸冤系
统咱远袁苑暂 袁负责 哉灾诱发的光产物和加合物修复的核苷酸
切除修复渊晕耘砸冤系统咱愿暂 袁以及负责 阅晕粤 双链断裂损
伤渊阅杂月泽冤修复的同源重组渊匀砸冤和非同源末端粘连
渊晕匀耘允冤修复系统咱怨暂 遥 细胞还通过激活细胞周期临界
点来响应 阅晕粤损伤袁从而延长细胞周期以提供给细胞
足够时间使之在分裂之前修复 阅晕粤损伤遥 此外袁一些
在动物细胞中存在的 阅晕粤 修复途径并未在植物中发
现咱员园暂 袁植物很可能在长期进化和适应过程中形成了独
特的 阅晕粤修复系统遥
水稻作为一种重要的粮食作物和模式植物袁明确
其 阅晕粤损伤修复的遗传学机制袁对于建立高效的水稻
和其他作物的诱变遗传育种体系具有重要的指导意
义遥 已有报道表明袁水稻中也存在与各种 阅晕粤修复系
统相关的同源基因咱员园暂 遥 为研究水稻 阅晕粤损伤修复相
关基因的功能袁阐明各系统的作用机制袁本研究引进尧
鉴定 圆远 份 栽鄄阅晕粤 和 栽燥泽员苑 插入突变系袁得到了 员源 份
携带 阅晕粤损伤修复同源基因的纯合突变系袁并初步分
析了突变系的表型性状袁为进一步利用反向遗传学手
段研究植物 阅晕粤修复相关蛋白的功能及其在水稻抗
逆性状培育中的应用奠定了基础遥
员摇 材料与方法
员郾 员摇 材料
根据在其他生物中发现的 阅晕粤修复基因袁在 砸蚤糟藻
粤灶灶燥贼葬贼蚤燥灶 孕则燥躁藻糟贼 阅葬贼葬遭葬泽藻 渊 澡贼贼责院 辕 辕 则葬责凿遭援 凿灶葬援 葬枣枣则糟援
早燥援 躁责冤上搜索水稻中可能参与 阅晕粤 损伤修复的基因遥
根据这些基因袁从韩国浦项科技大学植物功能基因组
学实验室咱员员暂引进了 怨 份 栽鄄阅晕粤 突变体材料的种子曰
从日本国立农业生物研究所咱员圆暂引入 员苑 份 栽燥泽员苑 突变
体 栽员 代材料的种子渊表 员冤遥
员郾 圆摇 基因组 阅晕粤的提取
采用 砸韵杂耘 法咱员猿暂提取水稻基因组 阅晕粤袁略作修
改院将叶片置于 圆皂造 离心管中袁加液氮用镊子迅速磨
碎袁并使粉末分散曰加入 圆园园 耀 源园园滋造 砸韵杂耘 提取液袁混
匀后立即 怨园益水浴 圆园皂蚤灶袁期间每 缘皂蚤灶 颠倒混匀曰其
后迅速于冰上静置 缘皂蚤灶 待组织和交联聚乙烯基吡咯
烷酮渊孕灾孕孕冤沉淀曰吸取 员园滋造 上清液到新的每孔预先
加有 员缘园滋造 凿凿匀圆韵渊或 栽耘冤的 怨远 孔 孕悦砸 板管中袁溶解
后待用遥
员郾 猿摇 插入位点的分子鉴定
根据目标基因号袁在 杂陨郧灶粤渊 澡贼贼责院 辕 辕 泽蚤早灶葬造援 泽葬造噪援
藻凿怎 辕 糟早蚤鄄遭蚤灶 辕 砸蚤糟藻郧耘冤数据库中获得插入目标基因突变
体的 栽鄄阅晕粤 载体尧边界序列和插入位点等信息曰在
晕陨砸杂渊 澡贼贼责院 辕 辕 贼燥泽援 灶蚤葬泽援 葬枣枣则糟援 早燥援 躁责 辕 冤 数据库中获得
栽燥泽员苑 突变体的 栽葬蚤造 序列尧插入位点及旁邻序列等信
息遥 根据这些信息袁在 郧则葬皂藻灶藻渊澡贼贼责院 辕 辕 憎憎憎援 早则葬皂藻灶藻援
燥则早冤中 月蕴粤杂栽袁确定插入基因位点袁并利用 晕悦月陨 的引
物设计软件 渊 澡贼贼责院 辕 辕 憎憎憎援 灶糟遭蚤援 灶造皂援 灶蚤澡援 早燥增 辕 贼燥燥造泽 辕
责则蚤皂藻则鄄遭造葬泽贼 辕 冤在目标基因插入位点的上下游 阅晕粤 序
列设计 圆 条扩增水稻 阅晕粤的 孕悦砸上游引物渊云孕冤和下
游引物渊砸孕冤袁以及位于 栽鄄阅晕粤 边界或 栽燥泽员苑 尾巴的
特异序列引物渊栽孕冤渊表 圆冤遥 利用 云孕尧砸孕与 栽孕进行三
引物 孕悦砸扩增咱员猿暂 遥 孕悦砸 体系渊圆园滋造冤包含院缘园灶早 的模
板 阅晕粤袁云孕尧栽孕 各 源园园灶皂燥造 辕 蕴袁砸孕 愿园园灶皂燥造 辕 蕴袁圆 伊 栽葬择
酝葬泽贼藻则 酝蚤曾 员园滋造袁加 凿凿匀圆韵 到 圆园滋造曰孕悦砸 程序为院怨源益怨园泽曰怨源益 猿园泽袁 远园益 渊 晕阅远园员员 的为 缘愿益冤 猿园泽袁 苑圆益
怨园泽袁猿园 个循环曰苑圆益 缘皂蚤灶遥 孕悦砸 产物由 员郾 缘豫琼脂糖
凝胶电泳检测遥
员郾 源摇 插入纯合突变体的获得
引入的多数突变材料为 栽员 代种子遥 这些 栽员 种子
发芽后单本移栽袁按单株收获种子袁形成 栽圆 代株系曰代
表性材料继续按单株收获尧按株系种植袁形成 栽猿 株系遥
在此过程中根据分子鉴定将分离世代突变体株系的基
因型确定为野生型渊宰栽冤尧半杂合型渊匀酝冤和突变型
渊酝栽冤遥 在获得纯合突变株系后袁对部分材料的农艺性
状进行观察遥 除采取一定的隔离措施外袁材料的种植
和管理参照水稻大田栽培遥
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 基因型鉴定
理论上袁被 栽鄄阅晕粤 辕 栽燥泽员苑 插入的基因两端引物
云孕尧砸孕及载体上的特异引物 栽孕 加入同一反应体系中
对基因组 阅晕粤 进行扩增袁有可能鉴别出 猿 种基因型袁
即野生型 渊 憎蚤造凿 贼赠责藻袁 宰栽冤尧半杂合型 渊 澡藻皂蚤扎赠早燥贼藻袁
园员源
摇 猿 期 水稻 阅晕粤损伤修复同源基因纯合突变系的鉴定
摇 摇 摇 摇 摇 表 员摇 引入材料的信息
栽葬遭造藻 员摇 陨灶枣燥则皂葬贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 蚤灶贼则燥凿怎糟藻凿 皂葬贼藻则蚤葬造泽
材料
皂葬贼藻则蚤葬造
基因名称
早藻灶藻 灶葬皂藻
预测功能
责则藻凿蚤糟贼藻凿 枣怎灶糟贼蚤燥灶
插入位点
蚤灶泽藻则贼蚤燥灶
纯合突变系
澡燥皂燥扎赠早燥怎泽 造蚤灶藻
员郾 栽鄄阅晕粤插入材料
猿粤鄄园员缘源远 韵泽园苑早园员愿源怨园园 运怎苑园 同源蛋白 澡燥皂燥造燥早怎藻 员源贼澡 鄄蚤灶贼则燥灶 原
员月鄄园缘园圆缘 韵泽园圆早园缘怨圆猿园园 孕酝杂缘 同源蛋白 澡燥皂燥造燥早怎藻 猿则凿 鄄藻曾燥灶 阅阅砸员
猿粤鄄员园圆愿源 韵泽园员早园苑怨怨缘园园 阅晕粤 糖苷酶家族蛋白 早造赠糟燥泽赠造葬泽藻 枣葬皂蚤造赠 责则燥贼藻蚤灶 源贼澡 鄄藻曾燥灶 原
猿粤鄄员员源源远 韵泽园缘早园圆苑源圆园园 阅晕粤 错配修复蛋白 酝怎贼杂 皂蚤泽皂葬贼糟澡 则藻责葬蚤则 澡燥皂燥造燥早怎藻 员圆贼澡 鄄藻曾燥灶 原
猿粤鄄员缘愿圆苑 韵泽园圆早园源远缘员员圆 砸粤阅圆猿 同源蛋白 澡燥皂燥造燥早怎藻 员员贼澡 鄄蚤灶贼则燥灶 阅阅砸圆
员悦鄄园怨猿园缘 韵泽园猿早园圆园缘源园园 载孕郧同源蛋白 澡燥皂燥造燥早怎藻 员员贼澡 鄄蚤灶贼则燥灶 原
猿月鄄园园缘圆源 韵泽园远早园远源猿远园园 阅晕粤 糖苷酶家族蛋白 早造赠糟燥泽赠造葬泽藻 枣葬皂蚤造赠 责则燥贼藻蚤灶 员员贼澡 鄄藻曾燥灶 阅阅砸猿
猿阅鄄园园源源缘鄄园圆 韵泽园源早园缘园苑园园园 阅晕粤 错配修复蛋白 皂蚤泽皂葬贼糟澡 则藻责葬蚤则 澡燥皂燥造燥早怎藻 圆员泽贼 鄄藻曾燥灶 原
猿粤鄄园怨愿怨怨 韵泽园缘早园缘苑怨员园园 阅晕粤 糖苷酶家族蛋白 早造赠糟燥泽赠造葬泽藻 枣葬皂蚤造赠 责则燥贼藻蚤灶 员泽贼 鄄藻曾燥灶 原
圆郾 栽燥泽员苑 插入材料
匀园缘愿远 韵泽园源早园远愿圆怨园园 阅晕粤错配修复同源蛋白 酝杂匀猿 皂蚤泽皂葬贼糟澡 则藻责葬蚤则 澡燥皂燥造燥早怎藻 愿贼澡 鄄藻曾燥灶 原
晕悦园猿缘园 韵泽园缘早园缘远苑缘园园 阅晕粤 糖苷酶家族蛋白 早造赠糟燥泽赠造葬泽藻 枣葬皂蚤造赠 责则燥贼藻蚤灶 猿则凿 鄄藻曾燥灶 阅阅砸源
晕悦园缘员员 韵泽园缘早园缘远苑缘园园 阅晕粤 糖苷酶家族蛋白 早造赠糟燥泽赠造葬泽藻 枣葬皂蚤造赠 责则燥贼藻蚤灶 圆贼澡 鄄蚤灶贼则燥灶 阅阅砸缘
晕悦圆苑源苑 韵泽园源早园远苑猿源园园 尿嘧啶 阅晕粤 糖苷酶家族蛋白 缘贼澡 鄄蚤灶贼则燥灶 阅阅砸员圆
晕阅员园缘圆 韵泽园怨早园源圆园猿园园 阅晕粤 糖苷酶家族蛋白 早造赠糟燥泽赠造葬泽藻 枣葬皂蚤造赠 责则燥贼藻蚤灶 源贼澡 鄄蚤灶贼则燥灶 阅阅砸员猿
晕阅猿园源源 韵泽园源早园远愿圆怨园园 阅晕粤 错配修复同源蛋白 酝杂匀猿 皂蚤泽皂葬贼糟澡 则藻责葬蚤则 澡燥皂燥造燥早怎藻 员园贼澡 鄄藻曾燥灶 原
晕阅源缘源源 韵泽园缘早园员源源愿园园 核苷酸切除修复 晕怎糟造藻燥贼蚤凿藻 藻曾糟蚤泽蚤燥灶 则藻责葬蚤则 愿贼澡 鄄蚤灶贼则燥灶 原
晕阅缘园缘缘 韵泽园怨早园源园苑远园园 阅晕粤 错配修复同源蛋白 酝杂匀远鄄员 皂蚤泽皂葬贼糟澡 则藻责葬蚤则 澡燥皂燥造燥早怎藻 猿忆鄄哉栽砸 阅阅砸怨
晕阅远园员员 韵泽园怨早园源园苑远园园 阅晕粤 错配修复同源蛋白 酝杂匀远鄄员 皂蚤泽皂葬贼糟澡 则藻责葬蚤则 澡燥皂燥造燥早怎藻 猿忆鄄哉栽砸 阅阅砸愿
晕耘园园猿缘 韵泽园缘早园缘远苑缘园园 阅晕粤 糖苷酶家族蛋白 早造赠糟燥泽赠造葬泽藻 枣葬皂蚤造赠 责则燥贼藻蚤灶 远贼澡 鄄蚤灶贼则燥灶 阅阅砸远
晕耘圆园猿园 韵泽园员早园员愿园远园园 酝怎贼杂同源蛋白 澡燥皂燥造燥早怎藻 员猿贼澡 鄄藻曾燥灶 原
晕耘苑园圆远 韵泽员员早园圆远苑源园园 核苷酸切除修复 晕怎糟造藻燥贼蚤凿藻 藻曾糟蚤泽蚤燥灶 则藻责葬蚤则 缘贼澡 鄄藻曾燥灶 原
晕云猿园园怨 韵泽园怨早园缘缘员怨园园 阅晕粤 错配修复同源蛋白 皂蚤泽皂葬贼糟澡 则藻责葬蚤则 澡燥皂燥造燥早怎藻 员泽贼 鄄蚤灶贼则燥灶 原
晕云远园缘园 韵泽园缘早园缘远苑缘园园 阅晕粤 糖苷酶家族蛋白 早造赠糟燥泽赠造葬泽藻 枣葬皂蚤造赠 责则燥贼藻蚤灶 缘贼澡 鄄藻曾燥灶 阅阅砸苑
晕云苑园猿苑 韵泽员园早园缘园怨园园园 阅晕粤 错配修复同源蛋白 酝怎贼杂 皂蚤泽皂葬贼糟澡 则藻责葬蚤则 澡燥皂燥造燥早怎藻 员园贼澡 鄄藻曾燥灶 阅阅砸员源
晕云苑苑愿源 韵泽园怨早园源园苑远园园 阅晕粤 错配修复同源蛋白 酝杂匀远鄄员 皂蚤泽皂葬贼糟澡 则藻责葬蚤则 澡燥皂燥造燥早怎藻 愿贼澡 鄄藻曾燥灶 阅阅砸员园
晕云怨园员园 韵泽园怨早园源园苑远园园 阅晕粤 错配修复同源蛋白 酝杂匀远鄄员 皂蚤泽皂葬贼糟澡 则藻责葬蚤则 澡燥皂燥造燥早怎藻 员泽贼 鄄藻曾燥灶 阅阅砸员员
匀酝冤尧突变型渊皂怎贼葬灶贼 贼赠责藻袁酝栽冤 渊图 员鄄粤冤遥 在野生型
植株中袁只有 云孕尧砸孕 引物可配对袁从而只扩增出水稻
基因条带曰在纯合突变型植株中袁水稻基因的下游引物
与 栽鄄阅晕粤 辕 栽燥泽员苑 的引物 栽孕 配袁扩增出包含 栽鄄阅晕粤 辕
栽燥泽员苑 边界序列与水稻基因片段的突变型条带曰如果
植株是半杂合体袁那么就会同时出现 圆 种条带遥
引入的 栽员 代材料大多处于分离状态袁因此需对单
株进行分子分析遥 如图 员鄄月尧员鄄悦所示袁在一些 栽员 株系
中可以出现预期的 猿 种基因型袁表明鉴定方法得当遥
圆郾 圆摇 突变单株和纯合突变系的培育
至 圆园员园 年 缘 月袁多数材料已繁殖至 栽猿 代袁经 孕悦砸
鉴定袁共获得 员源 份 阅晕粤 修复相关的基因纯合突变株
系袁其中 栽鄄阅晕粤插入系 猿 份袁栽燥泽员苑 突变系 员员 份袁按获
得纯合系的先后袁统一编为 阅晕粤 损伤修复突变系
渊阅晕粤 阅葬皂葬早藻 砸藻责葬蚤则袁阅阅砸冤袁以用于后续研究渊表 员冤遥
在 怨 份 栽鄄阅晕粤 插入系的 栽员 代植株中袁猿粤鄄园员缘源远尧员月鄄园缘园圆缘尧猿粤鄄员缘愿圆苑尧猿月鄄园园缘圆源 等 源 个系分别得到了
员尧源尧远尧源 个半杂合型单株袁猿粤鄄员园圆愿源尧猿粤鄄员员源源远尧猿阅鄄
园园源源缘鄄园圆尧猿粤鄄园怨愿怨怨 等 源 个系全为野生型曰猿粤鄄员缘愿圆苑尧
猿月鄄园园缘圆源 进一步在 栽圆 代都获得 猿 个纯合突变株袁并在栽猿 代中得到验证曰员月鄄园缘园圆缘 在 栽猿 代时得到 缘 个纯合
突变株遥 此外袁猿粤鄄园员缘源远 则在 栽圆尧栽猿 代中均得到纯合
株袁员悦鄄园怨猿园缘 无苗存活渊表 猿冤遥
在 栽燥泽员苑 突变系中袁 匀园缘愿远尧 晕悦园猿缘园尧 晕悦园缘员员尧
晕阅员园缘圆尧晕阅缘园缘缘尧晕阅远园员员尧晕耘园园猿缘尧晕耘苑园圆远尧晕云远园缘园尧
晕云苑园猿苑尧晕云怨园员园 共 员员 个系在 栽员 代中检测出了纯合突
变体袁在 晕悦圆苑源苑尧晕阅源缘源源尧晕云猿园园怨尧晕云苑苑愿源 中检测到
半杂合型单株袁而 晕耘圆园猿园尧晕阅猿园源源 都为野生型单株曰
晕悦圆苑源苑 在 栽猿 代得到了 猿 株纯合突变株袁晕云苑苑愿源 在 栽猿
代得到 员 个纯合突变株渊表 猿冤遥
员员源
核摇 农摇 学摇 报 圆远 卷
表 圆摇 用于 栽鄄阅晕粤尧栽燥泽员苑 插入突变系基因型鉴定的引物序列
栽葬遭造藻 圆摇 孕则蚤皂藻则 泽藻择怎藻灶糟藻 燥枣 早藻灶燥贼赠责藻 泽糟则藻藻灶蚤灶早 枣燥则 栽鄄阅晕粤 辕 栽燥泽员苑 蚤灶泽藻则贼蚤燥灶 皂怎贼葬灶贼 造蚤灶藻泽
材料
皂葬贼藻则蚤葬造
引物序列渊缘忆鄄猿忆冤
责则蚤皂藻则 泽藻择怎藻灶糟藻 渊缘忆鄄猿忆冤
产物大小
责则燥凿怎糟贼 泽蚤扎藻 渊遭责冤
员月鄄园缘园圆缘
云孕院郧郧悦栽郧悦粤郧悦栽粤粤粤郧粤粤栽栽悦郧
栽孕院郧栽栽粤悦郧栽悦悦栽郧栽粤郧粤粤粤悦悦悦悦粤粤
砸孕院郧栽栽粤郧粤粤悦粤郧郧郧悦栽栽郧悦栽郧悦
云孕 辕 砸孕院员员愿缘
栽孕 辕 砸孕院源怨远
猿粤鄄员缘愿圆苑
云孕院栽悦粤栽粤粤栽悦栽郧栽郧粤悦郧悦栽悦郧悦
栽孕院郧栽栽粤悦郧栽悦悦栽郧栽粤郧粤粤粤悦悦悦悦粤粤
砸孕院郧粤栽栽悦栽粤悦悦粤郧悦粤悦悦郧粤粤郧悦
云孕 辕 砸孕院员员缘园
栽孕 辕 砸孕院缘园远
猿月鄄园园缘圆源
云孕院悦粤悦粤粤栽郧粤郧栽栽郧郧郧栽栽悦粤郧郧
栽孕院粤悦粤粤郧悦悦郧栽粤粤郧栽郧悦粤粤郧栽 郧
砸孕院栽栽栽悦栽悦栽郧栽郧栽悦栽栽郧栽郧悦郧悦
云孕 辕 砸孕院员园圆圆
栽孕 辕 砸孕院源远怨
晕悦园猿缘园
云孕院郧悦悦粤栽郧郧悦粤粤悦粤郧悦悦栽粤悦粤郧郧栽
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云孕 辕 砸孕院源员苑
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圆郾 猿摇 纯合突变系的农艺特性
农艺特性分析结果表明渊图 圆冤袁与相应的亲本相
比袁除 晕悦园缘员员 外袁其他纯合突变体系及其野生型姐妹
系的结实率均显著降低曰而 员月鄄园缘园圆缘尧猿粤鄄员缘愿圆苑尧猿月鄄
园园缘圆源尧晕云苑苑愿源尧晕悦圆苑源苑 等的纯合突变系与其野生型
姐妹系之间并无显著差异遥 此外袁晕悦园缘员员 的结实率显
著高于亲本遥 员月鄄园缘园圆缘尧猿粤鄄员缘愿圆苑尧晕悦圆苑源苑尧晕云苑苑愿源 等
纯合突变系的千粒重与其野生型姐妹系均存在显著差
异袁并且二者与亲本的千粒重相比也都显著减少遥 猿月鄄
园园缘圆源 纯合突变系千粒重与亲本尧野生型姐妹系之间
均显著减少遥 晕阅员园缘圆尧晕云怨园员园尧晕悦园猿缘园 等纯合突变系
的千粒重与亲本间存在显著差异袁 而 晕阅远园员员尧
晕耘园园猿缘尧晕云远园缘园尧晕悦园缘员员 等纯合突变系的千粒重则与
亲本无明显差异遥 员月鄄园缘园圆缘 纯合突变系的株高与其
野生型姐妹系尧亲本间均存在显著差异袁而 猿粤鄄员缘愿圆苑尧
猿月鄄园园缘圆源尧晕云苑苑愿源尧晕云远园缘园尧晕悦园猿缘园 则与亲本间无显
著差异袁其余各系的株高与野生亲本间也有显著差异遥
圆员源
摇 猿 期 水稻 阅晕粤损伤修复同源基因纯合突变系的鉴定
图 员摇 插入株系基因型鉴定图
云蚤早援 员摇 郧藻灶燥贼赠责藻 凿藻贼藻则皂蚤灶葬贼蚤燥灶 枣燥则 贼澡藻 蚤灶泽藻则贼蚤燥灶 造蚤灶藻泽
粤院插入株系基因型鉴定示意图曰月院员月鄄园缘园圆缘 的三引物 孕悦砸的 员郾 缘豫琼脂糖凝胶电泳图曰
悦院晕云苑苑愿源 的三引物 孕悦砸的 员郾 缘豫琼脂糖凝胶电泳图遥 图 月和 悦中袁泳道 员院野生亲本曰泳道 圆 耀 愿院引进材料遥
粤院杂糟澡藻皂葬贼蚤糟 凿蚤葬早则葬皂 燥枣 早藻灶燥贼赠责藻 凿藻贼藻则皂蚤灶葬贼蚤燥灶 枣燥则 贼澡藻 蚤灶泽藻则贼蚤燥灶 造蚤灶藻泽曰月院员郾 缘豫 葬早葬则燥泽藻 早藻造 藻造藻糟贼则燥责澡燥则藻泽蚤泽 燥枣 贼则蚤责造藻鄄责则蚤皂藻 孕悦砸
燥枣 员月鄄园缘园圆缘曰悦院员郾 缘豫 葬早葬则燥泽藻 早藻造 藻造藻糟贼则燥责澡燥则藻泽蚤泽 燥枣 贼则蚤责造藻鄄责则蚤皂藻 孕悦砸 燥枣 晕云苑苑愿源郾 蕴葬灶藻员院憎蚤造凿 贼赠责藻曰造葬灶藻圆 耀 愿院 蚤灶贼则燥凿怎糟藻凿 皂葬贼藻则蚤葬造泽援
表 猿摇 引入材料各世代分子鉴定
栽葬遭造藻 猿摇 酝燥造藻糟怎造葬则 糟澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 蚤灶贼则燥凿怎糟藻凿
皂葬贼藻则蚤葬造泽 葬贼 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 早藻灶藻则葬贼蚤燥灶泽
材料
皂葬贼藻则蚤葬造
栽员 代野生株 辕半杂
合株 辕突变株数
宰栽 辕 匀酝 辕 酝栽 责造葬灶贼泽
晕燥援 燥枣 栽员
栽猿 代野生株 辕半杂
合株 辕突变株系数
宰栽 辕 匀酝 辕 酝栽 责造葬灶贼泽
造蚤灶藻 晕燥援 燥枣 栽猿
猿粤鄄园员缘源远 苑 辕 员 辕 园 圆员 辕 园 辕 园员月鄄园缘园圆缘 园 辕 源 辕 园 源 辕 员园 辕 缘猿粤鄄员园圆愿源 员 辕 园 辕 园 原猿粤鄄员员源源远 员 辕 园 辕 园 原猿粤鄄员缘愿圆苑 猿 辕 远 辕 园 圆 辕 圆缘 辕 猿员悦鄄园怨猿园缘 园 辕 园 辕 园 原猿月鄄园园缘圆源 圆 辕 源 辕 园 愿 辕 员怨 辕 猿猿阅鄄园园源源缘鄄园圆 员圆 辕 园 辕 园 鄄猿粤鄄园怨愿怨怨 源源 辕 园 辕 园 原匀园缘愿远 园 辕 缘 辕 猿 原晕悦园猿缘园 员 辕 缘 辕 猿 原晕悦园缘员员 远 辕 圆 辕 圆 原晕悦圆苑源苑 缘 辕 圆 辕 园 源 辕 员 辕 猿晕阅员园缘圆 远 辕 园 辕 员 原晕阅猿园源源 远 辕 园 辕 园 原晕阅源缘源源 圆 辕 圆 辕 园 原晕阅缘园缘缘 缘 辕 圆 辕 圆 原晕阅远园员员 员 辕 员 辕 源 原晕耘园园猿缘 猿 辕 猿 辕 源 原晕耘圆园猿园 怨 辕 园 辕 园 原晕耘苑园圆远 园 辕 苑 辕 员 原晕云猿园园怨 愿 辕 员 辕 园 原晕云远园缘园 圆 辕 缘 辕 猿 原晕云苑园猿苑 员 辕 猿 辕 员 原晕云苑苑愿源 园 辕 猿 辕 园 圆 辕 源 辕 员晕云怨园员园 员 辕 圆 辕 圆 原
猿摇 讨论
插入诱变是基因功能研究最重要的方法之一袁外
源 阅晕粤的插入不仅可诱发突变袁而且可标定基因用于
分离和鉴定遥 转座子和 栽鄄阅晕粤 被广泛应用于插入诱
变遥 栽鄄阅晕粤随机插入基因组袁但其插入序列可逐代稳
定遗传咱员源暂 遥 水稻中已构建了 栽鄄阅晕粤 插入突变体
库咱员缘暂 袁功能基因组学研究提供了新的反向遗传学手
段遥 栽燥泽员苑 是第一个被发现的同时具有转录和转座活
性的逆转座子袁在自然条件下则活性较弱袁原始拷贝数
为 员 耀 源 个袁但组织培养过程中则会高频率诱发突变袁
携带有 缘 耀 猿园 个转座的 栽燥泽员苑 拷贝咱员远暂 遥 栽燥泽员苑 的组培
诱变是水稻突变体的重要来源袁可产生许多突变体遥
栽燥泽员苑 插入突变体可用 孕悦砸方法鉴定并用于目标基因
的功能研究咱员远暂 遥 水稻是一种重要的禾谷类模式植物袁
其基因组相对较小袁物理图谱构建完成袁耘杂栽泽 已大范
围分析袁有效转化系统已建立袁基因组计划已完成咱员缘暂 袁
因此袁插入突变库的建立对于水稻功能基因组学研究
具有重要作用遥
利用反向遗传学袁从基因寅表型观察袁并结合生物
信息学研究基因功能袁已成为一种功能基因组学的研
究手段遥 突变群体的构建是功能基因组学的基础袁有
猿员源
核摇 农摇 学摇 报 圆远 卷
图 圆摇 鉴定出的 栽鄄阅晕粤及 栽燥泽员苑 插入突变体系的农艺性状
云蚤早援 圆摇 粤早则燥灶燥皂蚤糟 贼则葬蚤贼泽 燥枣 澡燥皂燥扎赠早燥怎泽 皂怎贼葬灶贼 造蚤灶藻泽 蚤凿藻灶贼蚤枣蚤藻凿 枣则燥皂 贼澡藻 栽鄄阅晕粤 辕 栽燥泽员苑 蚤灶泽藻则贼蚤燥灶泽
注院不同字母表示在 缘豫水平差异显著援
晕燥贼藻院阅蚤枣枣藻则藻灶贼 造藻贼贼藻则 皂藻葬灶泽 泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼 凿蚤枣枣藻则藻灶糟藻 葬贼 缘豫 造藻增藻造援
了突变库袁还需要系统尧全面的筛选和分子鉴定遥 本研
究将目前 阅晕粤损伤修复基因相关研究的进展与生物
信息学分析手段相结合袁对引进的 圆远 份 阅晕粤 损伤修
复相关基因的 栽鄄阅晕粤和 栽燥泽员苑 插入材料进行了鉴定袁
通过连续加代种植和三引物 孕悦砸分析与筛选袁最终获
得 员源 份纯合的 阅晕粤 损伤修复基因插入突变系袁包括
猿 份 栽鄄阅晕粤插入系和 员员 份 栽燥泽员苑 逆转座子插入突变
体袁涉及到 愿 个 阅晕粤损伤修复相关的同源基因遥 这些
材料的获得袁为进一步利用反向遗传学手段袁揭示植物
阅晕粤修复相关蛋白的功能及其在水稻抗逆性状培育
中的应用奠定了基础遥
本研究观察到袁各纯合插入突变系至少在 员 耀 圆 个
性状具有显著变化袁对 阅晕粤损伤修复的功能相同而基
因不同的插入系和同一基因不同位点的插入系与对照
间差异的表现趋势也不一致袁甚至有很大差异遥 出现
这种现象的原因可能有以下几个方面院员冤阅晕粤损伤修
复系统由众多的修复基因所组成袁这些基因参与不同
的修复代谢过程袁他们的突变可能产生不同表型和对
诱变剂处理的不同反应遥 据报道袁水稻 阅晕粤损伤修复
基因 噪怎苑园 的突变体植株变矮尧花粉育性降低袁对 酝酝杂
敏感袁而对 匀圆韵圆尧丝裂霉素 悦 等则无明显效果咱员怨暂 袁损
伤修复蛋白 韵泽载砸悦悦员 的表达对博来霉素敏感而增加
其片段化袁但对其他诱变剂则不敏感咱圆园暂 曰拟南芥 阅晕粤
损伤修复基因 葬贼哉灾鄄凿凿遭圆 突变体表现矮化咱圆员暂 袁而
葬贼灶葬责员 则促进第一叶的生长咱圆圆暂 遥 本研究中袁插入突变
系 猿月鄄园园缘圆源 千粒重比亲本尧野生型姐妹系间均显著减
少袁可能就是水稻 韵泽园远早园远源猿远园园 位点功能被破坏所引
起的曰圆冤无性系变异引起的遥 例如袁本试验中袁员月鄄
园缘园圆缘尧猿粤鄄员缘愿圆苑尧猿月鄄园园缘圆源尧晕云苑苑愿源 等插入系袁其结实
率与对照亲本间有显著差异袁但与野生型姐妹系之间
并无显著差异袁这显然与插入基因无关袁而是无性系变
异所造成曰猿冤田间局部环境条件的影响遥
总之袁本研究通过对引入杂合材料的分子鉴定袁获
得了 愿 个可能与 阅晕粤 损伤修复相关基因的突变体纯
系袁并对其农艺性状进行了初步分析袁所获结果为进一
步研究这些基因的生物学功能及其开展基因工程奠定
了重要基础遥
参考文献院
咱 员 暂摇 月葬贼泽糟澡葬怎藻则 粤援 粤 责造葬灶贼 早藻灶藻 枣燥则 责澡燥贼燥造赠泽藻院葬灶 藻灶扎赠皂藻 糟葬贼葬造赠扎蚤灶早 贼澡藻
则藻责葬蚤则 燥枣 哉灾 造蚤早澡贼鄄蚤灶凿怎糟藻凿 阅晕粤 凿葬皂葬早藻 咱允暂 援 孕造葬灶贼 允袁员怨怨猿袁源院苑园缘
原 苑园怨
咱 圆 暂摇 月则蚤贼贼 粤 月援 阅晕粤 凿葬皂葬早藻 葬灶凿 则藻责葬蚤则 蚤灶 责造葬灶贼泽 咱 允暂 援 孕造葬灶贼 孕澡赠泽蚤燥造袁
员怨怨远袁源苑院苑缘 原 员园园
咱 猿 暂摇 悦怎造造蚤早葬灶 运 酝袁 匀葬赠泽 允 月援 阅晕粤 皂蚤泽皂葬贼糟澡 则藻责葬蚤则 蚤灶 责造葬灶贼泽援 粤灶
粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽 贼澡葬造蚤葬灶葬 早藻灶藻 贼澡葬贼 责则藻凿蚤糟贼泽 葬 责则燥贼藻蚤灶 遭藻造燥灶早蚤灶早 贼燥 贼澡藻
酝杂匀圆 泽怎遭枣葬皂造蚤赠 燥枣 藻怎噪葬则赠燥贼蚤糟 酝怎贼杂 澡燥皂燥造燥早泽 咱 允暂 援 孕造葬灶贼 孕澡赠泽蚤燥造袁
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咱 源 暂摇 宰赠皂葬灶 悦袁运葬灶葬葬则 砸援 阅晕粤 凿燥怎遭造藻 原 泽贼则葬灶凿 遭则藻葬噪 则藻责葬蚤则院 葬造造爷 泽 憎藻造造
贼澡葬贼 藻灶凿泽 憎藻造造 咱允暂 援 粤灶灶怎 砸藻增 郧藻灶藻贼袁圆园园远袁源园院猿远猿 原 猿愿猿
咱 缘 暂摇 匀燥藻蚤躁皂葬噪藻则泽 允 匀援 郧藻灶燥皂藻 皂葬蚤灶贼藻灶葬灶糟藻 皂藻糟澡葬灶蚤泽皂泽 枣燥则 责则藻增藻灶贼蚤灶早
糟葬灶糟藻则 咱允暂 援 晕葬贼怎则藻袁圆园园员袁源员员院猿远远 原 猿苑源
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允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
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咱 远 暂 摇 允则蚤藻糟灶赠 允援 栽澡藻 皂怎造贼蚤枣葬糟藻贼藻凿 皂蚤泽皂葬贼糟澡 原 则藻责葬蚤则 泽赠泽贼藻皂 咱允暂 援 晕葬贼 砸藻增
酝燥造 悦藻造造 月蚤燥造袁圆园园远袁苑院猿猿缘 原 猿源远
咱 苑 暂 摇 砸燥遭藻则贼泽燥灶 粤 月援 阅晕粤 则藻责葬蚤则 蚤灶 皂葬皂皂葬造蚤葬灶 糟藻造造泽院 遭葬泽藻 藻曾糟蚤泽蚤燥灶
则藻责葬蚤则院 贼澡藻 造燥灶早 葬灶凿 泽澡燥则贼 燥枣 蚤贼 咱允暂 援 悦藻造造 酝燥造 蕴蚤枣藻 杂糟蚤袁圆园园怨袁远远院怨愿员
原 怨怨猿
咱 愿 暂 摇 匀葬灶葬憎葬造贼 孕 悦袁 杂责蚤增葬噪 郧援 栽则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶 原 糟燥怎责造藻凿 阅晕粤 则藻责葬蚤则院 贼憎燥
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咱 怨 暂 摇 运葬灶葬葬则 砸援 匝怎葬造蚤贼赠 糟燥灶贼则燥造 燥枣 阅晕粤 遭则藻葬噪 皂藻贼葬遭燥造蚤泽皂院 蚤灶 贼澡藻 野藻灶凿冶袁
蚤贼爷泽 葬 早燥燥凿 贼澡蚤灶早 咱允暂 援 耘酝月韵 允袁圆园园愿袁圆苑院缘愿员 原 缘愿愿
咱员园暂摇 运蚤皂怎则葬 杂袁杂葬噪葬早怎糟澡蚤 运援 阅晕粤 则藻责葬蚤则 燥灶 责造葬灶贼泽 咱 允暂 援 悦澡藻皂 砸藻增袁
圆园园远袁员园远渊圆冤院苑缘猿 原 苑远远
咱员员暂摇 允怎灶早 运 匀袁匀怎则 允 匀袁砸赠怎 悦 匀援 悦澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 葬 则蚤糟藻 糟澡造燥则燥责澡赠造造
原 凿藻枣蚤糟蚤藻灶贼 皂怎贼葬灶贼 怎泽蚤灶早 贼澡藻 栽鄄阅晕粤 早藻灶藻 贼则葬责泽 泽赠泽贼藻皂 咱 允暂 援 栽澡藻
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咱员圆暂摇 酝蚤赠葬燥 粤袁栽葬灶葬噪葬 运袁运燥遭葬赠葬泽澡蚤 酝援 云怎灶糟贼蚤燥灶葬造 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 贼澡藻 猿苑噪阅葬
蚤灶灶藻则 藻灶增藻造燥责藻 皂藻皂遭则葬灶藻 责燥造赠责藻责贼蚤凿藻 蚤灶 糟澡造燥则燥责造葬泽贼 遭蚤燥早藻灶藻泽蚤泽 怎泽蚤灶早
葬 阅泽 原 贼葬早早藻凿 粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽 责葬造藻 原 早则藻藻灶 皂怎贼葬灶贼 咱 允暂 援 孕造葬灶贼 允袁圆园园猿袁
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咱员猿暂摇 杂贼藻蚤灶藻则 允 允袁孕燥噪造藻皂遭葬 悦 允袁云躁藻造造泽贼则燥皂 砸 郧袁耘造造蚤燥贼贼 蕴 云援 粤 则葬责蚤凿 燥灶藻 原
贼怎遭藻 早藻灶燥皂蚤糟 阅晕粤 藻曾贼则葬糟贼蚤燥灶 责则燥糟藻泽泽 枣燥则 孕悦砸 葬灶凿 砸粤孕阅 葬灶葬造赠泽蚤泽
咱允暂 援 晕怎糟造藻蚤糟 粤糟蚤凿泽 砸藻泽袁员怨怨缘袁圆猿院圆缘远怨 原 圆缘苑园
咱员源暂摇 粤灶 杂援 郧藻灶藻则葬贼蚤燥灶 葬灶凿 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 藻灶凿 泽藻择怎藻灶糟藻 凿葬贼葬遭葬泽藻 枣燥则 栽鄄阅晕粤
贼葬早早蚤灶早 造蚤灶藻泽 蚤灶 则蚤糟藻 咱允暂 援 孕造葬灶贼 孕澡赠泽蚤燥造燥早赠袁圆园园猿袁员猿猿院圆园源园 原 圆园源苑
咱员缘暂摇 允藻燥灶 允 杂援 栽鄄阅晕粤 蚤灶泽藻则贼蚤燥灶葬造 皂怎贼葬早藻灶藻泽蚤泽 枣燥则 枣怎灶糟贼蚤燥灶葬造 早藻灶燥皂蚤糟泽 蚤灶
则蚤糟藻 咱允暂 援 栽澡藻 孕造葬灶贼 允燥怎则灶葬造袁圆园园园袁圆圆渊远冤院缘远员 原 缘苑园
咱员远暂摇 匀蚤则燥糟澡蚤噪葬 匀袁 杂怎早蚤皂燥贼燥 运袁 韵贼泽怎噪蚤 再袁 栽泽怎早葬憎葬 匀袁 运葬灶凿葬 酝援
砸藻贼则燥贼则葬灶泽责燥泽燥灶泽 燥枣 则蚤糟藻 蚤灶增燥造增藻凿 蚤灶 皂怎贼葬贼蚤燥灶泽 蚤灶凿怎糟藻凿 遭赠 贼蚤泽泽怎藻
糟怎造贼怎则藻 咱允暂 援 孕则燥糟 晕葬贼造 粤糟葬凿 杂糟蚤 哉杂粤袁员怨怨远袁怨猿院苑苑愿猿 原 苑苑愿愿
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责则蚤灶糟蚤责造藻泽袁葬责责造蚤糟葬贼蚤燥灶泽 葬灶凿 造蚤皂蚤贼葬贼蚤燥灶泽 咱 允暂 援 酝燥造 月蚤燥贼藻糟澡灶燥袁圆园园源袁
圆远院圆源怨 原 圆远员
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阅晕粤 凿葬皂葬早藻 蚤灶 藻糟燥贼燥曾蚤糟燥造燥早赠 咱 允暂 援 耘糟燥贼燥曾蚤糟燥造燥早赠袁圆园员园袁员怨院愿园源 原
愿员员
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葬泽泽燥糟蚤葬贼藻凿 憎蚤贼澡 凿藻增藻造燥责皂藻灶贼 早则燥憎贼澡 葬灶凿 早藻灶燥皂藻 泽贼葬遭蚤造蚤贼赠 蚤灶 则蚤糟藻
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葬灶凿 蚤贼泽 蚤灶贼藻则葬糟贼蚤燥灶 憎蚤贼澡 责则燥造蚤枣藻则葬贼蚤灶早 糟藻造造 灶怎糟造藻葬则 葬灶贼蚤早藻灶 咱 允 暂 援
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渊粤贼哉灾 原 阅阅月圆冤 咱允暂 援 孕造葬灶贼 酝燥造藻糟怎造葬则 月蚤燥造燥早赠袁圆园园远袁远员院圆圆苑 原 圆源园
咱圆圆暂摇 蕴蚤怎 在 匝袁在澡怎 再袁郧葬燥 允袁再怎 云袁阅燥灶早 粤 宰袁杂澡藻灶 宰 匀援 酝燥造藻糟怎造葬则 葬灶凿
则藻增藻则泽藻 早藻灶藻贼蚤糟 糟澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 晕哉悦蕴耘韵杂韵酝耘 粤杂杂耘酝月蕴再
孕砸韵栽耘陨晕员 渊晕粤孕员冤 早藻灶藻泽 怎灶则葬增藻造泽 贼澡藻蚤则 枣怎灶糟贼蚤燥灶 蚤灶 贼则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶
葬灶凿 灶怎糟造藻燥贼蚤凿藻 藻曾糟蚤泽蚤燥灶 则藻责葬蚤则 蚤灶 粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽 贼澡葬造蚤葬灶葬 咱 允暂 援 栽澡藻
孕造葬灶贼 允燥怎则灶葬造袁圆园园怨袁缘怨渊员冤院圆苑 原 猿愿
渊责任编辑摇 王媛媛冤
缘员源