全 文 ：摇 核 农 学 报摇 圆园员猿袁圆苑渊源冤院园源苑猿 耀 园源苑愿允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
收稿日期院圆园员圆鄄园怨鄄圆远摇 接受日期院圆园员猿鄄园员鄄圆愿
基金项目院山东省科技发展计划项目渊圆园员园郧晕悦员园怨员缘冤袁国家公益性行业科研专项渊圆园员园园猿园远缘冤袁山东省高等学校科技计划项目渊 允员园蕴悦苑猿冤袁大宗
蔬菜产业技术体系渊悦粤砸杂鄄圆缘冤
作者简介院乔 宁渊员怨苑愿鄄冤袁男袁山东泰安人袁硕士袁讲师袁主要从事植物基因工程研究遥 耘鄄皂葬蚤造院择灶蚤灶早苑愿岳 员远猿援 糟燥皂
通讯作者院李美芹渊员怨远愿鄄冤袁女袁山东潍坊人袁博士袁副教授袁主要从事生物学研究遥 耘鄄皂葬蚤造院皂择造蚤怨园员岳 员圆远援 糟燥皂
文章编号院员园园园鄄愿缘缘员渊圆园员猿冤园源鄄园源苑猿鄄园远
番茄黄化曲叶病毒双抗体夹心 耘蕴陨杂粤
检测方法的初步建立
乔摇 宁员 摇 李美芹员 摇 吕金浮员 摇 刘永光员 摇 王兴翠员 摇 竺晓平圆
渊员潍坊科技学院蔬菜花卉研究所袁山东 寿光摇 圆远圆苑园园曰 圆山东农业大学植保学院袁山东 泰安摇 圆苑员园员愿冤
摘摇 要院以纯化的番茄黄化曲叶病毒渊栽再蕴悦灾冤外壳蛋白为抗原袁免疫家兔制备并纯化出 栽再蕴悦灾 的多克
隆抗体 陨早郧袁以此抗体做包被抗体袁并用碱性磷酸酶渊粤孕冤对其进行标记作为酶标抗体袁从而建立了番茄
黄化曲叶病毒的双抗体夹心 耘蕴陨杂粤渊阅粤杂鄄耘蕴陨杂粤冤检测方法遥 通过 耘蕴陨杂粤方阵试验确定该法的最佳工作
浓度为酶标抗体渊 陨早郧鄄粤孕冤作 员颐 源园园 倍稀释袁包被抗体浓度为 远郾 圆缘滋早窑皂蕴 原员曰并且确定了抗原最低检出
浓度为 怨郾 苑缘灶早窑皂蕴 原员遥 采用该法对山东寿光的田间病样进行了定性和定量检测袁结果表明建立的 阅粤杂鄄
耘蕴陨杂粤 方法灵敏度高尧特异性强袁可用于番茄黄化曲叶病毒的常规检测遥
关键词院番茄黄化曲叶病毒曰阅粤杂鄄耘蕴陨杂粤曰快速检测
耘泽贼葬遭造蚤泽澡皂藻灶贼 燥枣 阅燥怎遭造藻 粤灶贼蚤遭燥凿赠 杂葬灶凿憎蚤糟澡 耘蕴陨杂粤 枣燥则
栽燥皂葬贼燥 再藻造造燥憎 蕴藻葬枣 悦怎则造 灾蚤则怎泽
匝陨粤韵 晕蚤灶早员 摇 蕴陨 酝藻蚤鄄择蚤灶员 摇 蕴灾 允蚤灶鄄枣怎员 摇 蕴陨哉 再燥灶早鄄早怎葬灶早员 摇 宰粤晕郧 载蚤灶早鄄糟怎蚤员 摇 在匀哉 载蚤葬燥鄄责蚤灶早圆
渊员 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣 灾藻早藻贼葬遭造藻泽 葬灶凿 云造燥憎藻则泽袁 宰藻蚤枣葬灶早 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠 燥枣 杂糟蚤藻灶糟藻 葬灶凿 栽藻糟澡灶燥造燥早赠袁 杂澡燥怎早怎葬灶早袁 杂澡葬灶凿燥灶早摇 圆远圆苑园园曰
圆 悦燥造造藻早藻 燥枣 孕造葬灶贼 孕则燥贼藻糟贼蚤燥灶袁 杂澡葬灶凿燥灶早 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 栽葬蚤葬灶袁 杂澡葬灶凿燥灶早摇 圆苑员园员愿冤
粤遭泽贼则葬糟贼院栽澡藻 则葬遭遭蚤贼 陨早郧 燥枣 栽燥皂葬贼燥 再藻造造燥憎 蕴藻葬枣 悦怎则造 灾蚤则怎泽 渊 栽再蕴悦灾冤 葬灶贼蚤泽藻则怎皂 憎葬泽 责怎则蚤枣蚤藻凿 葬灶凿 糟燥灶躁怎早葬贼藻凿 憎蚤贼澡
葬造噪葬造蚤灶藻 责澡燥泽责澡葬贼葬泽藻 渊粤孕冤 遭赠 早造怎贼葬则葬造凿藻澡赠凿藻 燥灶藻鄄泽贼藻责 皂藻贼澡燥凿援 栽澡藻 阅粤杂 鄄 耘蕴陨杂粤 皂藻贼澡燥凿 枣燥则 栽再蕴悦灾 凿藻贼藻糟贼蚤燥灶 憎葬泽
藻泽贼葬遭造蚤泽澡藻凿援 栽澡藻 燥责贼蚤皂葬造 凿蚤造怎贼蚤燥灶 燥枣 陨早郧鄄粤孕 憎葬泽 员颐 源园园 葬灶凿 贼澡藻 燥责贼蚤皂葬造 糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶 燥枣 糟燥葬贼藻凿 葬灶贼蚤遭燥凿赠 憎葬泽 远郾 圆缘滋早窑
皂蕴 原员袁 憎澡蚤糟澡 憎葬泽 凿藻贼藻则皂蚤灶藻凿 遭赠 责澡葬造葬灶曾 贼蚤贼则蚤皂藻贼则赠袁 葬贼 贼澡藻 泽葬皂藻 贼蚤皂藻 贼澡藻 糟怎则增藻 蚤灶凿蚤糟葬贼藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 造燥憎藻泽贼 凿藻贼藻糟贼蚤燥灶 造蚤皂蚤贼
憎葬泽 怨郾 苑缘灶早窑皂蕴 原员 援 云蚤藻造凿 泽葬皂责造藻泽 糟燥造造藻糟贼藻凿 枣则燥皂 杂澡燥怎早怎葬灶早 燥枣 杂澡葬灶凿燥灶早 孕则燥增蚤灶糟藻 憎藻则藻 凿藻贼藻糟贼藻凿 择怎葬造蚤贼葬贼蚤增藻造赠 葬灶凿
择怎葬灶贼蚤贼葬贼蚤增藻造赠 遭赠 阅粤杂– 耘蕴陨杂粤援 粤造造 燥枣 贼澡藻泽藻 则藻泽怎造贼泽 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 阅粤杂 鄄耘蕴陨杂粤 皂藻贼澡燥凿 憎葬泽 泽藻灶泽蚤贼蚤增藻 葬灶凿 泽责藻糟蚤枣蚤糟袁 憎澡蚤糟澡
糟燥怎造凿 遭藻 藻葬泽蚤造赠 葬责责造蚤藻凿 蚤灶 贼澡藻 枣蚤藻造凿援
运藻赠 憎燥则凿泽院栽燥皂葬贼燥 赠藻造造燥憎 造藻葬枣 糟怎则造 增蚤则怎泽曰阅粤杂鄄耘蕴陨杂粤曰砸葬责蚤凿 凿藻贼藻糟贼蚤燥灶
摇 摇 番茄黄化曲叶病毒渊栽燥皂葬贼燥 赠藻造造燥憎 造藻葬枣 糟怎则造 增蚤则怎泽袁
栽再蕴悦灾冤 于 圆园园苑 年传至山东地区袁先后在淄博尧潍坊尧
聊城尧泰安等地大面积发病袁发病区多数减产甚至绝
产袁给当地农户造成严重的经济损失咱员 原 圆暂 遥 以山东寿
光为例袁该病最初于 圆园园愿 年秋冬季发现袁到 圆园园怨 年病
田率高达 怨园豫 袁一般病株率在 员园豫 耀 圆园豫之间袁严重
地块病株率达 怨缘豫以上袁造成严重减产咱猿 原 源暂 遥 近年
来袁番茄黄化曲叶病毒病已成为秋冬季番茄生产中最
严重的病害袁而且有继续蔓延的趋势袁因此建立一种快
速有效的检测方法显得十分必要遥
猿苑源
核摇 农摇 学摇 报 圆苑 卷
目前袁 针对 栽再蕴悦灾的检测主要是以 孕悦砸 为基础
的分子生物学检测方法咱缘 原 怨暂 袁应用免疫学检测的报道
还较少遥 为此袁本研究以纯化的病毒外壳蛋白为抗原袁
免疫家兔袁获得高特异性抗血清袁并以此制备出抗体与
酶标抗体袁以期建立一种特异性好尧灵敏度高尧稳定可
靠尧方便快捷检测番茄黄化曲叶病毒的双抗体夹心
耘蕴陨杂粤渊阅粤杂鄄耘蕴陨杂粤冤方法遥
员摇 材料与方法
员郾 员摇 试验材料与试剂
抗原为纯化的番茄黄化曲叶病毒外壳蛋白咱源暂 曰
匀砸孕标记羊抗兔 陨早郧 购自北京博奥森生物技术有限
公司曰弗氏完全佐剂尧弗氏不完全佐剂尧对硝基苯磷酸
二钠渊孕晕孕孕冤尧牛血清白蛋白渊月杂粤冤等均购自 杂蚤早皂葬 公
司曰新西兰白兔购自上海友科生物科技有限公司曰
匀蚤栽则葬责 孕则燥贼藻蚤灶 粤 抗体纯化柱购自美国 郧耘 公司曰碱性
磷酸酶渊粤孕冤购自大连宝生物公司曰其他试剂均为国产
分析纯遥
测试病样为在山东省寿光市主要番茄种植区采集
的 愿园 份疑似感染番茄黄化曲叶病毒的叶片遥
员郾 圆摇 试验方法
员郾 圆郾 员摇 多克隆抗体的制备及检测摇 用 孕月杂缓冲液将外
壳蛋白稀释为 员皂早窑皂蕴 原员袁取 员皂蕴蛋白液加入等体积弗
氏完全佐剂混合研磨尧乳化袁并以此为抗原免疫 圆 只健
康新西兰白兔袁采取颈背部皮下多点渊至少 愿 点冤注射曰
一周后进行第 圆次基础免疫袁剂量与第 员次基础免疫相
同曰此后每周进行 员次加强免疫袁剂量加倍袁于兔背部和
大腿肌肉处交叉进行曰末次免疫后 员周于兔耳缘静脉采
血测抗体效价袁待效价符合要求时颈动脉取血袁兔血在
源益下静置过夜袁猿园园园 则窑皂蚤灶 原员离心缘皂蚤灶袁收集上清袁即为
最终的抗血清袁于 原圆园益分装保存遥 采用间接 耘蕴陨杂粤法
检测抗体效价袁测定 韵阅源缘园灶皂值袁取阳性 辕阴性渊孕 辕 晕冤逸猿
时的抗体溶液最大稀释倍数为其效价遥
员郾 圆郾 圆摇 抗体纯化及鉴定摇 准备 造皂蕴 的 匀蚤栽则葬责 孕则燥贼藻蚤灶
粤 抗体纯化柱袁用至少 远 倍柱体积的去离子水洗出保
护剂溶液曰然后用 圆 倍柱体积的起始缓冲液平衡柱袁待
流出液与起始缓冲液 责匀相同时袁注入血清样品袁同时
收集流出液曰用至少 愿 倍柱体积的 孕月杂 磷酸盐缓冲液
洗脱杂蛋白后加入 远皂蕴 的洗脱液渊园郾 员皂燥造窑蕴 原员袁 责匀
猿郾 园 柠檬酸缓冲液冤袁收集洗脱液袁每管收集 员皂蕴袁加入
中和液至溶液 责匀 为 苑郾 园曰源益于 孕月杂 缓冲液中透析过
夜袁测其 圆愿园灶皂 和 圆远园灶皂 下的吸光值袁计算抗体浓
度咱员园暂 遥
采用 杂阅杂鄄孕粤郧耘电泳进行纯度鉴定遥 分离胶浓度
为 员圆豫 袁浓缩胶浓度为 缘豫 袁考马斯亮蓝 砸 原圆缘园 染色尧
脱色曰扫描后用凝胶图像分析软件 月葬灶凿泽糟葬灶 缘郾 园 进行
分析遥
员郾 圆郾 猿摇 酶标抗体的制备摇 参照沈关心等咱员员暂的戊二醛
一步法标记抗体袁并适当做了改进袁具体步骤为院将
员皂早 纯化的 陨早郧与 愿园园哉的碱性磷酸酶混匀袁加 孕月杂缓
冲液到 园郾 缘皂蕴曰在其混合液中加入 源怎蕴 圆缘豫戊二醛袁室
温放置 圆澡袁每 猿园皂蚤灶上下颠倒 员 次曰源益中用 孕月杂 透析
过夜曰透析物转移至新的离心管中袁加入 缘皂早月杂粤袁源益
保存备用遥 采用直接 耘蕴陨杂粤 检测酶标抗体活性袁参照
徐宜为咱员圆暂的判断标准袁以能产生吸光值约为 员郾 园 的稀
释度为结合物的最适浓度遥
员郾 圆郾 源摇 阅粤杂鄄耘蕴陨杂粤检测方法的建立
员郾 圆郾 源郾 员摇 包被抗体及酶标抗体最佳工作浓度的确定
参照李广存等咱员猿暂的方法进行 耘蕴陨杂粤 方阵试验遥 将
陨早郧用包被液稀释成 员园园滋早窑皂蕴 原员袁然后倍比稀释至
员郾 缘远滋早窑皂蕴 原员袁员缘园滋蕴 辕孔加至酶标板袁源益过夜曰洗板后
加入封闭液进行封闭袁圆园园怎造 辕孔袁猿苑益孵育 员郾 缘澡袁洗涤
猿 次曰以 员滋早窑皂蕴 原员的外壳蛋白为阳性对照袁员豫 月杂粤 辕
孕月杂栽作阴性对照袁员园园怎造 辕孔袁猿苑益孵育 员澡袁洗涤 猿 次曰
将酶标抗体作 员 颐 圆缘 至 员 颐 员远园园 倍比稀释袁员园园怎造 辕孔袁
猿苑益孵育 圆澡袁洗涤 猿 次曰加入新鲜配制的显色液
孕晕孕孕袁员园园怎造 辕孔袁猿苑益放置 猿园皂蚤灶袁于 源园缘灶皂 波长下测
各孔的吸光值袁以阳性对照约为 员郾 园袁阴性对照小于
园郾 员袁且阳性 辕阴性渊孕 辕 晕冤逸圆 的条件作最适条件袁以此
选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度遥
员郾 圆郾 源郾 圆摇 抗原最低检出量的确定摇 将阳性抗原的浓
度倍比稀释为 圆园园园灶早窑皂蕴 原员至 猿怨灶早窑皂蕴 原员袁包被抗体
和酶标抗体分别选取最佳工作浓度袁同时设阴性对照
和空白对照袁测定 韵阅源园缘灶皂值袁取阳性 辕阴性渊孕 辕 晕冤逸圆
时的最大稀释倍数所对应的浓度袁即为待检抗原的最
低检出量遥 并根据标准外壳蛋白渊抗原冤的量和其所
对应的 韵阅值计算出其回归方程遥
员郾 圆郾 缘摇 田间病样的 阅粤杂鄄耘蕴陨杂粤检测
员郾 圆郾 缘郾 员摇 阅粤杂鄄耘蕴陨杂粤的定性检测摇 从寿光市蔬菜研
究院番茄种植基地及部分乡镇的番茄种植区采集不同
程度感染番茄黄化曲叶病毒的植株袁称取 员早采集的病
叶袁加入 圆皂蕴提取缓冲液袁于研钵中匀浆曰源益袁员园袁园园园
则窑皂蚤灶 原员离心 缘皂蚤灶袁吸取上清液 员园园滋蕴 加入各样品孔
中袁采用已建立的 阅粤杂鄄耘蕴陨杂粤体系对病样进行检测遥
员郾 圆郾 缘郾 圆摇 阅粤杂鄄耘蕴陨杂粤的定量检测摇 从上述处理的样
品中任取 缘 个袁每个样品分别取 员远园尧愿园尧源园尧圆园尧员园尧缘尧
圆郾 缘尧员郾 圆缘尧园郾 远圆缘滋蕴的提取液依次加入待测孔中袁 采
源苑源
摇 源 期 番茄黄化曲叶病毒双抗体夹心 耘蕴陨杂粤检测方法的初步建立
用同样的 阅粤杂鄄耘蕴陨杂粤法进行检测遥
以上试验均同时设健康植株为阴性对照袁外壳蛋
白纯化液为阳性对照和空白对照曰测定 韵阅源园缘灶皂值袁以 孕
为感病样品吸光值袁晕 阴性对照为吸光值袁取 孕 辕 晕 跃 圆
作为阳性判断标准遥
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 多克隆抗体的鉴定结果
采用间接 耘蕴陨杂粤法检测抗体效价袁结果如表 员 所
示袁可知免疫的两只兔抗体效价均达到 员颐 员远园园园袁能够
满足后续试验的要求遥
圆郾 圆摇 抗体纯化结果
通过紫外吸收法袁测得纯化抗体在 圆愿园灶皂 和
圆远园灶皂下的吸光值袁得出其浓度分别为 圆源郾 猿皂早窑皂蕴 原员
渊员 号兔冤和 圆园 皂早窑皂蕴 原员 渊圆 号兔冤遥 纯化的 陨早郧 在
杂阅杂鄄孕粤郧耘图谱上可见清晰的抗体重链和轻链带渊图
员冤 咱员源暂 袁而且通过软件分析可知其纯度高达 怨缘豫以上遥
圆郾 猿摇 酶标抗体活性测定
采用戊二醛一步法进行 陨早郧 的碱性磷酸酶标记袁
以纯化蛋白为抗原袁将酶标抗体用于直接 耘蕴陨杂粤 分
析袁结果表明酶标抗体的稀释度为 员颐 愿园园 时其吸光值
约为 员郾 园渊图 圆冤袁可见该酶标抗体渊 陨早郧鄄粤孕冤具有较强
的抗原结合活性与酶活性咱员圆暂 遥
表 员摇 抗血清效价的测定
栽葬遭造藻 员摇 阅藻贼藻则皂蚤灶葬贼蚤燥灶 燥枣 葬灶贼蚤泽藻则怎皂 贼蚤贼藻则
韵阅源缘园 灶皂
抗血清稀释倍数
栽蚤皂藻泽 燥枣 凿蚤造怎贼蚤燥灶 燥枣 葬灶贼蚤泽藻则怎皂
员颐 缘园园 员颐 员园园园 员颐 圆园园园 员颐 源园园园 员颐 愿园园园 员颐 员远园园园 员颐 猿圆园园园
免疫前血清 晕
孕则藻鄄蚤皂皂怎灶藻 泽藻则怎皂
渊员颐 员园园园冤
员 号兔 孕 圆郾 猿苑苑 圆郾 猿远源 圆郾 圆苑缘 圆郾 员员源 员郾 远愿缘 园郾 愿苑源 园郾 源苑猿 园郾 员苑源晕燥援 员 孕 辕 晕 员猿郾 远远 员猿郾 缘愿 员猿郾 园苑 员圆郾 员源 怨郾 远愿 缘郾 园圆猿 圆郾 苑圆
圆 号兔 孕 圆郾 猿苑源 圆郾 猿远苑 圆郾 圆愿缘 圆郾 员猿远 员郾 苑圆缘 园郾 怨园苑 园郾 源愿苑 园郾 员苑圆晕燥援 圆 孕 辕 晕 员猿郾 愿园 员猿郾 苑远 员猿郾 圆愿 员圆郾 源员 员园郾 园圆 缘郾 圆苑猿 圆郾 愿猿
摇 摇 注院孕表示感病样品 韵阅源缘园灶皂的平均值曰晕表示阴性对照 韵阅源缘园灶皂的平均值
摇 摇 晕燥贼藻院 孕 蚤泽 韵阅源缘园灶皂 葬增藻则葬早藻 增葬造怎藻泽 燥枣 贼则藻葬贼皂藻灶贼泽曰晕 蚤泽 韵阅源缘园灶皂 葬增藻则葬早藻 增葬造怎藻泽 燥枣 灶藻早葬贼蚤增藻 糟燥灶贼则燥造
图 员摇 陨早郧的纯化结果
云蚤早援 员摇 栽澡藻 责怎则蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 陨早郧
酝院蛋白质分子质量标准曰员院未诱导的细菌裂解物院
圆院 陨孕栽郧渊园援 缘皂皂燥造 辕 蕴冤诱导的表达产物曰猿院纯化的 陨早郧
酝院 孕则燥贼藻蚤灶 皂燥造藻糟怎造葬则 憎藻蚤早澡贼 皂葬则噪藻则曰
员院 晕燥灶鄄蚤灶凿怎糟贼蚤燥灶 憎蚤贼澡 陨孕栽郧曰
圆院 陨灶凿怎糟贼蚤燥灶 憎蚤贼澡 园援 缘皂酝 陨孕栽郧曰猿院孕怎则蚤枣蚤藻凿 陨早郧
图 圆 酶标抗体活性的测定
云蚤早援 圆摇 粤糟贼蚤增蚤贼赠 葬泽泽葬赠 燥枣 陨早郧鄄粤孕
缘苑源
核摇 农摇 学摇 报 圆苑 卷
表 圆摇 不同包被浓度和酶标抗体作用浓度对方阵 耘蕴陨杂粤的结果渊孕 辕 晕冤
栽葬遭造藻 圆摇 栽澡藻 则藻泽怎造贼泽 燥枣 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶 燥枣 陨早郧 葬灶凿 陨早郧鄄粤孕 枣燥则 贼澡藻 泽择怎葬则藻 耘蕴陨杂粤渊孕 辕 晕冤
包被抗体浓度
悦燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶 燥枣
陨早郧渊滋早窑皂蕴 原员 冤
酶标抗体稀释倍数
阅蚤造怎贼蚤燥灶 燥枣陨早郧鄄粤孕
员颐 圆缘 员颐 缘园 员颐 员园园 员颐 圆园园 员颐 源园园 员颐 愿园园 员颐 员远园园
员园园 圆郾 猿圆园 辕 园郾 圆园苑 圆郾 圆怨缘 辕 园郾 员怨苑 圆郾 员员怨 辕 园郾 员苑愿 员郾 怨缘员 辕 园郾 员远源 员郾 苑愿缘 辕 园郾 员缘苑 员郾 源缘圆 辕 园郾 员源源 员郾 圆远猿 辕 园郾 员猿怨
缘园 圆郾 圆源怨 辕 园郾 员怨愿 圆郾 员愿源 辕 园郾 员怨园 员郾 怨远员 辕 园郾 员远缘 员郾 苑愿愿 辕 园郾 员苑苑 员郾 苑员远 辕 园郾 员圆愿 员郾 远苑员 辕 园郾 员远苑 员郾 源怨猿 辕 园郾 员缘愿
圆缘 圆郾 圆苑愿 辕 园郾 员苑园 圆郾 员远圆 辕 园郾 员远缘 圆郾 园园猿 辕 园郾 员愿员 员郾 怨猿圆 辕 园郾 员苑源 员郾 远源缘 辕 园郾 员远愿 员郾 猿缘缘 辕 园郾 员缘缘 员郾 圆源远 辕 园郾 员猿圆
员圆郾 缘 圆郾 圆远员 辕 园郾 员苑猿 员郾 怨愿苑 辕 园郾 员苑缘 员郾 愿怨怨 辕 园郾 员苑圆 员郾 缘苑缘 辕 园郾 员缘圆 员郾 源苑园 辕 园郾 员猿源 员郾 园缘源 辕 园郾 员怨员 园郾 苑怨愿 辕 园郾 员猿缘
远郾 圆缘 圆郾 员远缘 辕 园郾 员远远 员郾 怨缘圆 辕 园郾 员园苑 员郾 缘怨远 辕 园郾 员远员 员郾 猿猿苑 辕 园郾 员怨缘 员郾 园员猿 辕 园郾 园怨源 园郾 远怨苑 辕 园郾 园远远 园郾 猿远猿 辕 园郾 员苑源
猿郾 员圆缘 圆郾 园员愿 辕 园郾 员源怨 员郾 怨园圆 辕 园郾 员圆圆 员郾 缘员园 辕 园郾 员源缘 园郾 怨苑远 辕 园郾 员园圆 园郾 缘远愿 辕 园郾 园缘远 园郾 猿愿缘 辕 园郾 园缘猿 园郾 猿猿怨 辕 园郾 园猿愿
员郾 缘远 员郾 圆怨源 辕 园郾 员园源 员郾 员愿园 辕 园郾 员园猿 园郾 苑愿圆 辕 园郾 园愿缘 园郾 远怨猿 辕 园郾 园源猿 园郾 源远猿 辕 园郾 园猿源 园郾 猿远源 辕 园郾 园猿缘 园郾 圆园圆 辕 园郾 园源缘
圆郾 源摇 最适工作浓度的确定
耘蕴陨杂粤方阵试验结果如表 圆 所示袁随着包被抗体
浓度和酶标抗体工作浓度的增加袁阳性及阴性 韵阅 值
都呈上升趋势遥 相比直接 耘蕴陨杂粤法确定的酶标抗体 员
颐 愿园园 的稀释度袁但考虑到实际应用时要求有较高检测
灵敏度和尽可能减少非特异性反应袁最终确定 阅粤杂鄄
耘蕴陨杂粤的最佳工作浓度为酶标抗体作 员 颐 源园园 倍稀释袁
陨早郧包被浓度为 远郾 圆缘 滋早窑皂蕴 原员遥
圆郾 缘摇 检测灵敏度的确定
将纯化的外壳蛋白作系列倍比稀释袁确定该方法
的最低检出量袁结果如图 猿 所示袁随着抗原浓度的降
低袁耘蕴陨杂粤检测的吸光度值也随之下降袁最终确定本方
法对抗原的最低检出浓度为 怨郾 苑缘灶早窑皂蕴 原员袁其线性检
测范围在 怨郾 苑缘 耀 缘园园园灶早窑皂蕴 原员之间遥 数据分析结果如
图 源袁回归方程为 赠 越 园郾 园园园员曾 垣 园郾 猿源源怨袁相关系数 砸圆
越 园郾 怨缘园员袁可见标准抗原浓度与其 韵阅 值显著相关袁表
明双抗夹心法 耘蕴陨杂粤定量测定病毒含量是可行的遥
图 猿摇 阅粤杂鄄耘蕴陨杂粤灵敏度的检测结果
云蚤早援 猿摇 栽澡藻 凿藻贼藻糟贼蚤燥灶 造蚤皂蚤贼 枣燥则 阅粤杂鄄耘蕴陨杂粤
图 源摇 标准抗原浓度与吸光值的相关性
云蚤早援 源摇 栽澡藻 糟燥则则藻造葬贼蚤燥灶 燥枣 泽贼葬灶凿葬则凿 葬灶贼蚤早藻灶
糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶 葬灶凿 贼澡藻 葬遭泽燥则遭葬灶糟藻
圆郾 远摇 田间病样检测结果
圆郾 远郾 员摇 阅粤杂鄄耘蕴陨杂粤的定性检测结果摇 利用确定的最
适工作条件对其中的部分样品进行了 阅粤杂鄄耘蕴陨杂粤 检
测袁结果如图 缘 示袁通过比较发现袁随着样品感病程度
的加重袁其测得的 韵阅值也相应增大曰而外在表现症状
大体相同的病株袁其 韵阅值稍有不同袁这可能与植株本
身的抗病性有很大关系遥
圆郾 远郾 圆摇 阅粤杂鄄耘蕴陨杂粤的定量检测结果摇 任意选取上述
处理好的 缘 个样品袁通过加入不同体积的样品提取液
来改变其中的病毒含量袁阅粤杂鄄耘蕴陨杂粤 检测结果渊如图
远冤显示 韵阅值与样品提取液的加入体积有良好的线性
关系袁其相关系数都较高且较为稳定渊表 猿冤袁可见用
阅粤杂鄄耘蕴陨杂粤法可以定量测定样品中的病毒含量遥
猿摇 讨论
山东寿光种植的番茄 怨园豫是采用了工厂化育苗
远苑源
摇 源 期 番茄黄化曲叶病毒双抗体夹心 耘蕴陨杂粤检测方法的初步建立
摇 摇
图 缘摇 田间病样的 阅粤杂鄄耘蕴陨杂粤检测结果
云蚤早援 缘摇 栽澡藻 则藻泽怎造贼泽 燥枣 贼澡藻 阅粤杂鄄耘蕴陨杂粤 贼泽藻贼 燥枣 凿蚤泽藻葬泽藻 泽葬皂责造藻 燥枣 蚤灶 枣蚤藻造凿
图 远摇 不同体积的样品提取液检测结果
云蚤早援 远摇 栽澡藻 贼藻泽贼 则藻泽怎造贼泽 燥枣 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 增燥造怎皂藻泽 燥枣 泽葬皂责造藻 藻曾贼则葬糟贼蚤燥灶
表 猿摇 样品提取液的加入体积与 韵阅源园缘灶皂值的线性关系
栽葬遭造藻 猿摇 栽澡藻 造蚤灶藻葬则 则藻造葬贼蚤燥灶泽澡蚤责 燥枣 贼澡藻 韵阅源园缘灶皂 增葬造怎藻 葬灶凿 葬凿凿蚤灶早 增燥造怎皂藻 燥枣 泽葬皂责造藻 藻曾贼则葬糟贼蚤燥灶
样品 员
杂葬皂责造藻 员
样品 圆
杂葬皂责造藻 圆
样品 源
杂葬皂责造藻 源
样品 缘
杂葬皂责造藻 缘
样品 苑
杂葬皂责造藻 苑
公式 枣燥则皂怎造葬泽 赠 越 原 园郾 员猿源曾 垣 员郾 源苑员远 赠 越 原 园郾 园远愿曾 垣 园郾 远源愿缘 赠 越 原 园郾 员远猿源曾 垣 员郾 愿苑圆圆 赠 越 原 园郾 员源怨怨曾 垣 员郾 远苑缘愿 赠 越 原 园郾 员苑远怨曾 垣 圆郾 圆源缘远
砸圆 园郾 怨远园苑 园郾 怨猿圆 园郾 怨缘源苑 园郾 怨源愿员 园郾 怨源远怨
基地供苗袁董克锋等咱员缘暂认为幼苗带毒是导致山东番茄
黄化曲叶病毒病大规模暴发的原因之一袁因此能否在
早期对番茄黄化曲叶病毒病做出及时准确地检测与诊
断袁成为该病害防治及研究的前提条件遥 本研究为番
茄黄化曲叶病毒病的早期鉴定技术提供了一定的理论
依据及实践基础袁但其中一些研究工作还有待于进一
步完善袁许多问题还需要继续关注遥 例如院番茄的品种
很多袁不同品种对番茄黄化曲叶病毒病的抗性及表现
各不相同袁有的番茄品种存在早期得病袁但随着时间的
延长会慢慢自愈的现象袁这样若是在苗期用该法检测
到病害而弃掉这些番茄苗的话袁会造成较大的浪费和
经济损失遥 因此还需要进一步研究考察袁以便为菜农
苑苑源
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找到更加科学合理的检测方法遥
本研究通过 耘蕴陨杂粤 方阵试验确定了包被抗体和
酶标抗体的最适工作浓度袁其中酶标抗体的工作浓度
与直接 耘蕴陨杂粤法确定的稀释度稍有差异袁这与施曼玲
等咱员远暂 尧薛朝阳等咱员苑暂的研究结果基本一致遥 但需要注
意的是在实际检测过程中有时存在一定假阳性袁因此
应进行重复实验予以排除遥 本试验对采集的病叶分别
进行了定性和定量检测袁结果表明建立的 阅粤杂鄄耘蕴陨杂粤
方法具有良好的特异性和灵敏度袁勿需要特殊设备袁即
可实现对番茄黄化曲叶病毒进行快速检测袁在生产中
具有较强实用价值遥
参考文献院
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区番茄黄化曲叶病毒外壳蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的表
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叶病毒的田间检测咱允暂 援植物病理学报袁 员怨怨怨袁 圆怨渊圆冤院员缘苑 原 员远员
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