全 文 ：李属坏死环斑病毒（PNRSV）新疆巴旦木分离物
外壳蛋白基因（CP）片断的克隆与序列分析
殷智婷 1，韩 剑 1，周国辉 2，张祥林 3，罗 明 1*，潘亚南 1
（1新疆农业大学农学院，乌鲁木齐 830052； 2华南农业大学资源与环境学院，广州 510642；
3新疆出入境检疫检验局，乌鲁木齐 830052）
摘 要: 【目的】为了查明新疆巴旦木果树病原病毒的种类，为病毒的分子检测提供基础。 【方法】采用双抗体夹心酶
联免疫吸附法（DAS-ELISA），从巴旦木果树叶片中检测到李属坏死环斑病毒（PNRSV）。 以阳性样品的总 RNA 为模
板进行 PNRSV 外壳蛋白基因（CP）RT-PCR 扩增，对预期 430 bp 大小的 4 个扩增产物进行克隆、测序和序列分析。
【结果】 结果表明，PNRSV 新疆巴旦木分离物 CP 基因的核苷酸和氨基酸序列与世界各地已报道的分离物具有较高
的同源性，分别为 80.0%~97.2%和 80.1%~94.1%，其中与阿根廷分离物 AY217 的同源性最高；而与同属 03 亚组的苹
果花叶病毒（ApMV）同源性较低，仅为 52.9%~55.4%和 45.6%~48.6%。新疆 PNRSV 各分离物之间 CP 基因高度同源。
序列比对与系统发生树的分析显示，PNRSV 新疆巴旦木分离物的株系属于 GroupⅠ组。 【结论】确定了 PNRSV 为侵
染新疆巴旦木果树的病原病毒。 这是 PNRSV 在新疆发现的首次报道。
关键词: 巴旦木； 李属坏死环斑病毒（PNRSV）； 双抗体夹心酶联免疫吸附法（DAS-ELISA）； RT-PCR； CP 基因
中图分类号：S662．9 文献标志码：A 文章编号：1009－9980（2012）05－0740－07
Cloning and sequence analysis of CP gene of Prunus necrotic ringspot virus
from almond plants in Xinjiang
YIN Zhi-ting1，HAN Jian1，ZHOU Guo-hui2，ZHANG Xiang-lin3，LUO Ming1*，PAN Ya-nan1
（1College of Agriculture， Xinjiang Agricultural University， Urumqi， 830052 Xinjiang China； 2College of Natural Resourcesand and Envi-
ronment， South China Agricultural University， Guangzhou， Guangdong； 3Xinjiang Entry and Exit Inspection and Quarantine Bureau， U-
rumqi， 830052 Xinjiang China）
Abstract: 【Objective】The objective of the study is to identify the virus infecting almond trees in Xinjiang
Province，and provide a foundation for developing molecular detection of the viral diseases. 【Method】The
samples showing typical symptoms of virus-like diseases were screened by Double-Antibody Sandwich
Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (DAS-ELISA)， and eight were tested positive for Prunus necrotic
ringspot virus (PNRSV). Using universal primers for viral coat protein gene (CP) of PNRSV， RT-PCR were
performed with the total RNA as templates extracted from the detected positive samples. Four amplified
cDNA fragments with expected amplified sizes of 430 bp were cloned and sequenced. 【Result】The simi-
larity analysis of the nucleotide sequences and deduced amino acid of CP gene showed highly identity be-
tween of PNRSV-Xinjiang isolates and that from several different countries， sharing identities of 80.0% to
97.2% and 80.1% to 94.1% respectively. They shared the highest identity with PNRSV-Argentina isolates
AY217， while less than 52.9% to 55.4% and 45.6% to 48.6% when compared with Apple mosaic virus
(ApMV) which belong to the same subgroup of Ilarvirus. High sequence identities of CP gene were showed
among Xinjiang isolates. Xinjiang isolates were clustered to GroupⅠ(the serious pathotype) in phylogenet-
ic analysis.【Conclusion】It was concluded that PNRSV infected almond in Xinjiang. This is the first report
that PNRSV was detected in Xinjiang， China.
Key words: Prunus necrotic ringspot virus (PNRSV)； Almond； Double-Antibody Sandwich Enzyme-
Linked Immunosorbent Assays (DAS-ELISA); RT-PCR； CP gene
收稿日期： 2012－02－27 接受日期: 2012－06－10
基金项目： 新疆自治区自然科学基金（2012211B25）；新疆自治区科技支疆项目（200991238）
作者简介： 殷智婷，女，在读硕士生。 研究方向：植物病毒及检测。 Tel: 15292862639，E-mail: yzt0373@163.com
觹 通讯作者 Author for correspondence． Tel: 13669995610，E-mail:luomingxjau@yahoo.com.cn
果 树 学 报 2012，29（5）: 740~746
Journal of Fruit Science
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2012.05.003
李属坏死环斑病毒 （Prunus necrotic ringspot
virus，PNRSV）是《中华人民共和国进境植物检疫危
险性病、虫、杂草名录》中危险性检疫对象，也是世
界上许多国家进口的检疫对象。 PNRSV 属于雀麦
花叶病毒科 （Bromoviridae） 等轴不稳环斑病毒属
（Ilarvirus），可侵染核果类等多种果树和西（甜）瓜、
棉花、向日葵、菜豆、啤酒花等 21 个科、47 个属 189
种植物，具有寄主范围广泛、侵染传播力强、危害严
重、检疫和防控难度大等特点。 PNRSV 通过种子及
苗木等无性繁殖材料进行远距离传播， 还可以经花
粉、虫媒、嫁接、机械接种等迅速传播蔓延。果树一经
感染便终生带毒、逐年加重、持久危害，引起叶片坏
死环斑和穿孔，果实畸形、品质下降、腐烂加快，树体
急剧衰退、提早枯死，一般可造成 30%~70%的产量
损失，严重的可导致树皮坏死、癌肿直至整株绝产、
枯死，为果树生产中的一种毁灭性病害[1]，在 40 多个
温带国家和地区都有发生。 目前，PNRSV 在中国已
在局部地区被发现。 在对陕西西安地区甜樱桃园的
调查中， 首次报道了李属坏死环斑病毒在中国境内
发生，之后辽宁、四川[2]、北京[3]，浙江[4]等也相继报道
了 PNRSV的发生危害。
近年来，新疆林果产业发展迅猛，种植面积以每
年 6.67 万 hm2 以上速度迅速递增， 现总面积已达
106.67 万 hm2，形成了核桃、红枣、杏、巴旦木、香梨
等为主要品种的特色林果优势产业。 随着果树种植
规模的快速扩大及品种的改良更新，对苗木、种子的
需求激增。 在种（苗）的调运、嫁接和育苗等过程中，
加剧了病毒病的传播和蔓延的风险， 成为制约林果
产业健康发展的重要隐患。 为了解新疆特色果树上
病原病毒的种类及发生危害状况，2010—2011 年，
笔者对阿克苏、喀什地区的红枣、核桃、巴旦木种植
地进行果园调查和样品采集， 采用双抗体夹心酶联
免疫吸附法 （DAS-ELISA） 在巴旦木上检测到
PNRSV 为阳性，以阳性样品的总 RNA 为模板，通过
RT-PCR技术克隆了 PNRSV外壳蛋白基因 （CP）片
段，并对其作同源性比较和序列分析，确定为侵染新
疆巴旦木的 PNRSV分离物。
1 材料和方法
1.1 供试材料
2010 年 7 月和 2011 年 5 月分别在新疆阿克
苏、喀什地区红枣、核桃、巴旦木果园调查，采集到表
现为植株矮化、树体衰弱；叶片黄花、花叶、卷叶；新
梢坏死等具有疑似病毒病症状的叶片和幼嫩枝条。
样品保存于 4 ℃冰箱和液氮中。 同时采集健康植株
枝叶作为对照。
1.2 酶联免疫吸附法（ELISA）检测
1.2.1 样品的提取及稀释 将保存于冰箱中的样品
以 1∶10（样品质量: 提取缓冲液体积）的比例加入提
取缓冲液，充分研磨后加入 96孔微孔板中。
1.2.2 缓冲液的制备 样品提取缓冲液为内含聚乙
烯吡咯烷酮、0.2%鸡蛋清粉的 PBS-T溶液（pH 7.4）；
抗体包被缓冲液为 0.1%~0.2%的抗体碳酸盐 （pH
6.0）溶液；洗涤液为内含 0.05%吐温-20 的磷酸盐溶
液（PBS-T，pH 7.4）；酶标记物制备缓冲液为含聚乙
烯吡咯烷酮、牛血清蛋白的 PBS-T 稀释液（pH 7.4）
0.1%~0.5%的酶标抗体样本提取缓冲液溶液； 酶底
物溶解缓冲液为 9.7%（pH 9.8） 二乙醇胺水溶液，根
据各不同病毒检测试剂盒的具体要求配制或使用不
同浓度的缓冲液。
1.2.3 双抗体夹心酶联免疫吸附法检测 （DAS-
ELISA ） 检测病毒的种类为果树上危险性大及无
毒 苗 木 生 产 中 必 须 脱 除 的 李 坏 死 环 斑 病 毒
（PNRSV）、李痘病毒（PPV）及李矮缩病毒（PDV）3 种
检疫性病毒。所用 DAS-ELISA病毒检测试剂盒为美
国 Agdia公司产品。
检测主要步骤参照说明书进行。主要步骤为:包
被抗体→孵育，4 ℃过夜→洗板→点样→室温下（25
℃） 孵育 2 h→洗板→加酶标记物稀释液→室温下
（25 ℃）孵育 2 h→洗板→加 PNP 底物溶液。 底物溶
液加入后，在恒湿箱中孵育 30~60 min，观察微孔中
的颜色变化，用酶标仪测量 OD405，记载数据。比较样
品吸光值与阳性对照、阴性对照吸光值的大小。阳性
对照由 Agdia公司提供，阴性对照为健康植株枝叶。
1.3 RT-PCR扩增
1.3.1 巴旦木样品总 RNA 的提取 取 0.1 g 新鲜巴
旦木叶片和幼嫩枝条在液氮中研磨至粉末， 采用
RNAplant plus Reagen 试剂盒 （Plant Genomic DNA
Kit，TIANGEN）提取样品总 RNA，方法略有改动。 抽
提 RNA 产物加入 DEPC-ddH2O 溶解，-70 ℃保存备
用。
1.3.2 引物设计合成 参照已报道的 PNRSV 外
壳蛋白基因 （CP）保守序列设计引物 [5]，正向引物
为5′-acg cgc aaa agt gtc gaa atc taa a-3′，反向引物为
5′- tgg tcc cac tca gag ctc aac aaa g-3′，预期产物长度
为 450 bp。 引物由上海生工生物工程技术服务有限
公司合成。
1.3.3 cDNA的合成 以提取的巴旦木样品总 RNA
殷智婷等: 李属坏死环斑病毒（PNRSV）新疆巴旦木分离物外壳蛋白基因（CP）片断的克隆与序列分析5 期 741
果 树 学 报 29 卷
表 1 DAS-ELISA 法对 PNRSV 的检测结果
Table 1 Results of DAS-ELISA test for PNRSV
样品编号
No. of
samples
采集地点
Sampling spots
田间症状
Field syptoms
样品 OD405
OD405 of samples
对照 OD405
OD405 of controls
OD405
样品 OD405/阴性对照 OD405
Ratio of samples’ OD405 and
negative control’ OD405
阳性对照
Positive
control
阴性对照
Negative
control
B-1
B-12
B-35
B-36
B-39
B-47
B-49
B-50
喀什地区莎车县
Shache county of Kashi city
喀什地区莎车县
Shache county of Kashi city
喀什地区莎车县
Shache county of Kashi city
喀什地区莎车县
Shache county of Kashi city
喀什地区莎车县
Shache county of Kashi city
喀什地区莎车县
Shache county of Kashi city
喀什地区麦盖提
Maigaiti county of Kashi city
喀什地区麦盖提
Maigaiti county of Kashi city
主干新枝簇生、坏死
Having clusters of shoots，necrosis
新生枝条密生
Having new branches in close
主干新枝簇生、坏死
Having clusters of shoots，necrosis
整株枯死
Trees withered
主干新枝簇生、坏死
Having clusters of shoots，necrosis
主干新枝簇生、坏死
Having clusters of shoots，necrosis
叶肉发黄
Mesophyll yellowing
明脉、叶肉发黄
Vein clearing，mesophyll yellowing
3.393
0.251
1.405
2.330
0.581
0.868
0.584
2.107
20.564
1.521
8.515
14.121
3.521
5.261
3.539
12.770
2.427 0.165
为模板，反转录合成 cDNA第 1链。 反转录体系（20
μL）: RNA模板 2 μL，dNTP（10 mmol·L-1）1 μL，Oligo
（dT）（50 mmol·L-1）1 μL，DEPC-ddH2O 10 μL，65 ℃
下 5 min，冰上放置 5 min，加入 5×first-strand Buffer
4 μL，M-MLV 反转录酶 （200 U·μL-1）1 μL，RNA 酶
抑制剂（40 U·μL-1）1 μL。反应条件: 30℃ 10 min；42
℃ 60 min；95℃ 5 min。
1.3.4 PCR 扩增 对 PNRSV 的 CP 基因采用二次
PCR 扩增。 第 1次扩增以反转录合成的 cDNA 为模
板， 第 2次扩增以第 1次扩增产物的适当稀释液为
模板，以 CP基因序列引物进行 PCR 扩增。反应体系
（20 μL）: cDNA 2 μL，10×PCR 缓冲液 2 μL，dNTP
（2.5 mmol·L-1）1 μL， 上、 下游引物各 1 μL，Taq 酶
（2.5 U·μL-1） 0.5 μL，ddH2O 12.5 μL。反应条件: 94℃
预变性 5 min；94 ℃变性 30 s；52 ℃复性 30 s；72 ℃
延伸 30 s；25个循环，72℃延伸 7 min。 取 PCR 产物
在浓度为 1.3%的琼脂糖 1×TAE 缓冲系统电泳检
测， 染色后， 使用凝胶成像系统观察并摄影记录结
果。
1.3.5 PCR 产物的回收纯化及克隆 用普通琼脂
糖凝胶 DNA 回收试剂盒 （TIANgel Midi Purification
Kit）回收、纯化巢式 PCR 扩增产物。 回收 PCR 产物
与PGM-T 载体在 16 ℃下过夜连接。 重组质粒转化
E. coli TOP10感受态细胞，涂布含 Amp（100 mg·L-1）、
X-Gal（20 g·L-1）和 IPTG（50 g·L-1）的 LB 培养基平
板上进行蓝白斑筛选。 利用 PCR 反应和酶切鉴定、
筛选阳性克隆。 质粒提取采用 TIANprep Mini Plas-
mid Kit， 限制性内切酶 Eco RⅠ为 Promega 公司产
品。
1.3.6 序列测定及系统发育分析 将筛选获得的含
目的片段的重组质粒进行序列测定， 由上海生工生
物工程技术服务有限公司完成。 利用 GenBank 数据
库中的 BLAST 程序对测序结果进行相似性检索
（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）， 通过 DNAS-
tar、Clustalx、MEGA version 4.1 软件进行相似序列比
较、分析 ，邻接法 （Neighbor Joining）构建系统发育
树。
2 结果与分析
2.1 双抗体夹心酶联免疫吸附法（DAS-ELISA）的
检测结果
采用李坏死环斑病毒 （PNRSV）、 李痘病毒
（PPV）及李矮缩病毒（PDV）DAS-ELISA 检测试剂盒
对采集到的红枣、核桃、巴旦木病毒病疑似样品进行
检测。 结果显示， 仅从巴旦木样品中检测到 8 个
PNRSV 为阳性的样品（表 1），它们呈现出明显的颜
色反应，OD405远大于阴性对照。 阳性样品在检测总
样品中的检出率为 4.3%，在巴旦木样品中的检出率
11.4%。
2.2 PNRSV的 RT-PCR扩增
将经过 DAS-ELISA 检测呈阳性巴旦木感病样
品通过 RT-PCR 反应， 从其总 RNA 提取物中扩增
到 430 bp 的单一明亮的电泳条带，与预期目标条带
大小一致, 而作为阴性对照的健康植株样和仅有引
物的空白对照均未出现特异性条带， 结果表明所用
引物对具有特异性， 扩增条带与目标基因 CP 片段
742
5 期
表 2 新疆巴旦木 PNRSV 分离物 CP 基因核苷酸和氨基酸同源性比较
Table 2 Homology comparison of nucleotide sequence and deduced amino acid identity
of CP gene fragments from PNRSV-Xinjiang isolates
PNRSV（AY217）
PNRSV（Ring25）
PNRSV（PV32）
PNRSV（CH9）
PNRSV（FJ344）
PNRSV（YN）
PNRSV （AF285）
PNRSV（BJ）
PNRSV（Chr-p）
PNRSV（Chr-m）
PNRSV（AJ205）
PNRSV（EF257）
PNRSV（Ring 18）
PNRSV（CH39）
PNRSV（EF253）
PNRSV（PE5）
Apple mosaic virus（ApMV）
AY007217
AF465229
Y07568
AF034992
FJ610344
AY684271
AF013285
DQ300178
HQ833191
HQ833193
AJ133205
EF565257
AF465223
AF034990
EF565253
L38823
FN435317
桃 Peach
玫瑰 Rose
苹果 Apple
樱桃 Cherry
玫瑰 Rose
玫瑰 Rose
巴旦 Almond
樱桃 Cherry
樱桃 Cherry
樱桃 Cherry
桃 Peach
桃 Peach
樱桃 Cherry
樱桃 Cherry
桃 Peach
桃 Peach
苹果 Apple
阿根廷 Argentina
法国 France
西班牙 Spain
美国 USA
中国浙江 Zhejiang,China
中国云南 Yunnan, China
美国 USA
中国北京 Beijing, China
中国山东 Shandong, China
中国河南 Henan, China
意大利 Italy
智利 Chile
德国 Germany
美国 USA
智利 Chile
德国 Germany
印度 India
93.4%~97.2%
92.7%~96.3%
92.4%~95.6%
91.2%~95.1%
92.9%~96.7%
92.4%~96.3%
86.8%~90.8%
86.8%~90.7%
86.1%~89.9%
86.8%~90.5%
87.6%~91.4%
87.3%~91.2%
88.0%~91.8%
87.3%~91.2%
80.5%~82.7%
80.0%~82.7%
52.9%~55.4%
93.0%~94.1%
91.9%~92.4%
90.1%~91.2%
89.0%~89.6%
92.6%~93.1%
91.9%~92.4%
87.5%~88.2%
87.5%~88.2%
85.3%~86.8%
86.8%~87.5%
88.2%~88.9%
87.5%~88.2%
88.2%~88.9%
87.5%~88.2%
80.1%~81.3%
80.9%~81.9%
45.6%~48.6%
分离物
Isolates
登录号
Accession No.
分离寄主
Host
毒株来源
Origin
同源性 Sequence Homology
核苷酸 Nucleotide 氨基酸 Amino acid
殷智婷等: 李属坏死环斑病毒（PNRSV）新疆巴旦木分离物外壳蛋白基因（CP）片断的克隆与序列分析
430 bp
1 2 3 4 M 5 6
图 1 PNRSV 的 CP 基因的 RT-PCR 扩增结果
M. 100 bp DNA 标准分子量； 1~4. 感病植株样品； 5. 仅有引物的阴
性对照； 6. 健康植株样品
Fig. 1 Amplification result of PNRSV CP gene by RT-PCR
M. 100 bp DNA marker； 1 to 4. PNRSV-infected samples； 5. Negative
control； 6. Healthy control
大小相符， 无杂带出现， 在疑似病样中检测到有
PNRSV 存在。
2.3 PNRSV的 CP基因片段的克隆
将以上 RT-PCR 产物回收、纯化、克隆，提取阳
性克隆质粒用 PCR 和酶切反应鉴定，均得到大小为
430 bp 的预期片段， 证明得到了含有插入 PNRSV
CP基因片段的重组子。
2.4 PNRSV CP基因的序列测定与分析
选取重组克隆进行序列测定，分别得到 433 bp、
426 bp、410 bp、430 bp的 4条核苷酸序列。将获得序
列在 NCBI 上进行 BLAST 检索，结果表明（表 2）与
PNRSV 序列具有较高的同源性， 在 80.0%~97.2%，
而与 PNRSV 同属 03 亚组的苹果花叶病毒（Apple
mosaic virus，ApMV） 的同源性较低 ， 为 52.9%~
55.4%，因此确定它们为侵染新疆巴旦木 PNRSV 分
离物的 CP基因， 命名为 XJB-12、XJB-35、XJB-39、
XJB-47，将序列提交至 GenBank，获得序列号分别
为 JQ247429、JQ247430、JQ247431、JQ247432。
新疆巴旦木 PNRSV 分离物 CP 基因核苷酸序
列与阿根廷分离物 AY217（AY007217）的同源性最
高为 93.4%~97.2%（平均 95.55%）；国内分离物中与
浙江分离物和云南分离物的同源性最高， 分别为
92.9%~96.7%（平均 95.30%） 和 92.4%~96.3%（平均
94.85%）；而与德国分离物 PE5（L38823）同源性最
低 ， 在 80.0%~82.7% （平均 81.63% ）。 应用软件
（DNAStar）对新疆巴旦木 PNRSV 分离物 CP 基因核
苷酸序列进行翻译， 并将翻译得到的氨基酸序列登
录 Genbank 进行比对，结果表明，其相应的编码外壳
蛋白氨基酸序列与 PNRSV 相应序列同源性为
80.1%~94.1%， 而与 ApMV 的同源性仅为 45.6%~
48.6%，与其核苷酸序列同源性的比较结果相似。
PNRSV 新疆巴旦木各分离物之间 CP 基因核苷
酸序列具有很高的同源性，在 95.1% ~97.9%，氨基
酸同源性在 93.4%~95.6%。
2.5 系统发育树构建与分析
将新疆巴旦木分离物与 16 个已报道的国内外
PNRSV 分离物 CP 基因核苷酸序列构建系统发育
树，以 ApMV 分离物作外群参比。 从系统发育树可
以看出 （图 2），PNRSV 新疆巴旦木分离物与阿根廷
分离物 AY217（AY007217）形成了一个小分支，其亲
743
果 树 学 报 29 卷
图 2 基于 CP 基因核苷酸序列构建的系统发育树
Fig. 2 Phylogenetic tree based on the nucleotide sequences of CP gene from different PNRSV isolates
缘关系最近。
PNRSV 存在不同的株系。 Hammond[12]根据 CP
基因序列将 PNRSV 株系划分为 3 个不同的组，即
Group I、GroupⅡ和 GroupШ， 差异主要表现在致病
力方面。其中 Group I中的株系大多在寄主上引起严
重的症状；Group II 中的株系大多数产生温和的症
状；GroupШ 中既包括温和致病型株系也包括引起
严重症状类型的株系。 由图 2 可见， 新疆巴旦木
PNRSV 4 个分离物与 Group I 分离物聚在一个大分
支上，与代表毒株 AY007217 的相似性最高（93.4%~
97.2%）； 与而与 GroupⅡ （代表毒株 AF034990）和
Group Ш（代表毒株 L38823）的相似性只有 87.3%~
91.2%和 80.9%~81.9%。 同时，新疆 PNRSV 分离物
CP 基因在第 44~49 序列为 ATAGGA， 这一插入序
列为 Group I组分离物所特有。氨基酸比较结果也发
现，新疆分离物 CP 基因第 17、18 和 56 位氨基酸分
别为天冬酰胺（N）、精氨酸（R）和酪氨酸（Y），这与
Group I 组分离物的保守氨基酸一致。 据此，可以确
定新疆巴旦木 PNRSV 分离物归属 PNRSV 的 Group
I株系。
3 讨 论
3.1 DAS-ELISA 法检测果树组织中 PNRSV 的局
限性
PNRSV 侵染的寄主大多为木本植物如核果类
果树以及蔷薇属植物。前人[6-7]研究发现，病毒在受感
染的植株体内常常分布不均，在茎干、表皮、根等组
织携带病毒极其微量， 且病毒浓度随生长季节变化
很大。春季植物展叶时是最佳的检测时间，当温度高
于 38℃时症状潜隐，采用指示植物和 ELISA法都常
常无法检测到，给病毒检测带来了很大难度。本研究
中采用 DAS-ELISA 和 RT-PCR 技术分别对 2010
年 7 月和 2011 年 5 月采集的两批红枣、核桃、巴旦
木植株样进行检测和鉴定，仅在 2011年 5 月的巴旦
木幼叶中检测到 PNRSV分离物， 而在 2010年 7月
的样品中未检测到。 此结果一方面表明，采样时期、
采样组织对于 PNRSV检测极为关键。 春季（5月）幼
芽萌动、新生叶片中病毒快速增值、浓度高、症状明
显，检测结果更具有可靠性；而在 7 月由于气温高，
对病毒有钝化作用、 植物组织内病毒浓度急剧下降
会直接影响到检测结果。 另一方面， 本研究是先用
DAS-ELISA 法对样品初筛，再对其中的阳性样品通
过 RT-PCR进一步鉴定。 由于 PNRSV的株系繁多，
受抗体特征的限制， 病毒分离物的多样性及不同生
长时期变化等不确定因素会影响 ELISA 检测灵敏
度和准确性[8-10]。 因此，不排除尚有一些样品中的微
GroupⅢ
GroupⅡ
GroupⅠ
744
5 期 殷智婷等: 李属坏死环斑病毒（PNRSV）新疆巴旦木分离物外壳蛋白基因（CP）片断的克隆与序列分析
量病毒未被检出，造成假阳性和漏检的情况。PNRSV
是否侵染新疆的红枣、 核桃等其他果树还需多次大
量采样、多种检测技术检测后确定。
3.2 PNRSV新疆巴旦木分离物的株系分化
研究发现，PNRSV 有很多株系， 主要体现在致
病力差别上， 表现为从无症到重症花叶等一系列症
状。 Mink 等[11]根据 PNRSV 在樱桃上是引起温和斑
驳症状还是造成皱缩花叶症状，将 PNRSV株系分为
M和 R两种致病型。 Hammond[12]根据各株系引起的
症状类型将 PNRSV 株系划分为 3 个不同的组
（Group I，GroupⅡ和 Group Ш）。 Fiore 等 [13]对 23 个
PNRSV南美分离物的分析表明，GroupⅡ、Group I 和
GroupШ各自所占比例约为 58%、33.3%和 8.2%。马
云霞[14]通过对 PNRSV北京平谷樱桃分离物（PE-BJ）
序列比对结果发现，CH-BJ 属于引起严重症状的
Group I。 黄冲等[15]将北京怀柔分离物（PE-HR）属于
引起温和症状的 GroupⅡ。 由此可见，PE-BJ和 PE-
HR 两个分离物虽同在北京地区， 但引起的症状类
型不同，分属于不同株系。 我国已经发现的 11 个分
离物中，属 Group I 组的 8 个，占 72.7%；属 GroupⅡ
组的 3个，占 27.3%；尚未发现属 GroupШ 组的分离
物[16]。 本研究将 PNRSV新疆巴旦木分离物 CP 基因
片段的克隆序列分析，发现其与归属于 Group I 的代
表分离物 PV32 的同源性最高， 其核苷酸中具有
Group I 组分离物所特有的序列 ， 氨基酸序列与
Group I 组的保守氨基酸一致。 同时，根据其在寄主
上表现为树体衰弱、 叶芽枯萎、 新梢坏死等症状特
点， 推测可能是一种严重致病型株系。 但同时也发
现，由 PNRSV引起的果树叶片出现褪绿斑或褐色坏
死斑、枯斑脱落造成叶穿孔、少数叶背出现耳突等典
型症状在新疆感病巴旦木果树上并未观察到， 这可
能与病毒株系、 寄主品种的感病性以及环境条件有
关[17]。
此外，本研究中的 4 个新疆巴旦木 PNRSV分离
物均来自喀什地区莎车县， 但分离物之间 CP 基因
核苷酸序列相似性很高。有研究发现 PNRSV各个分
离物间 CP和 MP序列相当保守，与寄主和地区关系
不大[18]。 PNRSV新疆巴旦木分离物与阿根廷分离物
AY217 的相似性达到 95.55%， 国内分离物中与浙
江、 云南的玫瑰分离物的同源性最高， 分别达到了
95.30%和 94.85%；而与美国的巴旦木分离物 AF285
的相似性仅为 89.65%。 此结果可能揭示出一个现
象: PNRSV 可能是经国内外苗木或花卉的调入而传
入新疆，在新疆特殊的地域环境中 PNRSV产生了一
定的分化，此分化可能是由于地理隔离所造成的，而
与寄主种类关系不大。 新疆 PNRSV 的起源究竟如
何？ 是否存在明显的地区专化型？ 在致病性、寄主范
围上有无分化？ 这些问题都还需要通过扩大样品的
检测数量、 全面测定其基因组序列以获取更加丰富
的分子生物学信息来加以研究证实。
3.3 关于巴旦木果树病毒的复合侵染
在果树上常会发生几种病毒复合侵染， 尤其是
PNRSV 与 PDV 相伴随系统性发生。 本研究在检测
PNRSV 时，还同时检测了 PDV 和 PPV，但除巴旦木
中发现有 PNRSV外，尚未发现病样中存在混合侵染
现象。侵染果树病毒种类很多，而本研究仅检测了其
中 3种。 研究中也显示部分表现明显病毒病症状的
样品不能检出病毒，这些症状是否由其他病毒引起？
是由何种病毒引起？ 都还有待进一步研究。
3.4 PNRSV在新疆的疫情发生和分布情况
我国自 1996 年发现 PNRSV以来， 已有几个省
市相继有 PNRSV 发生的报道， 表明我国的地理气
候环境适宜 PNRSV 发生， 加上该病毒的寄主在我
国种植广泛，目前该病毒极有可能已成功定殖并逐
渐进入流行期[16]。 本研究是在新疆巴旦木上检测到
PNRSV分离物的首次报道。巴旦木是世界著名的坚
果树种，也是木本油料植物，我国巴旦木的栽培分布
区位于新疆南部的喀什等地。 目前在调查地发现的
巴旦木病株呈零星分布， 但不排除存在比例不等的
无症带毒病株，PNRSV 在新疆地区危害并扩散蔓延
的风险必将逐年增加，但目前对新疆地区 PNRSV疫
情发生和分布情况尚缺乏全面了解。 本研究首次对
PNRSV 新疆分离物进行分子鉴定，分析其遗传变异
和株系分化，为建立快速诊断和检测技术，建立优良
苗木生产繁育体系，实施病害切实有效的防控措施，
促进新疆林果业的健康可持续发展， 提供了科学基
础和技术支持。
4 结 论
采用 DAS-ELISA 和 RT-PCR 法确定了 PNRSV
为侵染新疆喀什地区巴旦木果树的病原病毒。 克隆
病毒分离物的 CP 基因、 序列比对与系统发生树分
析， 将 PNRSV 新疆巴旦木分离物归属于 GroupⅠ
组。根据其在寄主上的表现，推测可能是一种严重致
病型株系。
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