全 文 ：核 农 学 报摇 圆园员圆袁圆远渊苑冤院园怨怨源 耀 园怨怨怨
允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
收稿日期院圆园员圆鄄园远鄄圆远摇 接受日期院圆园员圆鄄园愿鄄圆圆
基金项目院科技部野十二五冶国家科技支撑计划项目渊圆园员圆月粤阅员怨月园源冤
作者简介院杨丽荣 渊员怨苑远鄄冤袁女袁内蒙古通辽人袁博士袁副研究员袁主要从事微生物基因工程与分子生物学遥 栽藻造院园猿苑员鄄远缘愿缘圆员缘园曰 耘鄄皂葬蚤造院
赠葬灶早造蚤则燥灶早园圆圆源岳 赠葬澡燥燥援 糟燥皂援 糟灶
通讯作者院薛保国渊员怨缘苑鄄冤袁男袁河南汝南人袁博士袁研究员袁研究方向为微生物分子生物学研究遥 栽藻造院 园猿苑员鄄远缘愿缘圆员缘园曰耘鄄皂葬蚤造院 曾怎藻遭遭遭岳 早皂葬蚤造援 糟燥皂
文章编号院员园园园鄄愿缘缘员渊圆园员圆冤园苑鄄园怨怨源鄄园远
农杆菌介导球孢白僵菌转化体系的建立及突变体筛选
杨丽荣1 摇 全摇 鑫员 摇 黄摇 莹员 摇 梁摇 慎圆 摇 薛保国员
渊员郾 河南省农业科学院植物保护研究所 辕 河南省农作物病虫害防治重点实验室袁 农业部华北南部作物有害
生物综合治理重点实验室袁河南 郑州摇 源缘园园园圆曰圆援 河南省农业科学研究院园艺研究所袁河南 郑州摇 源缘园园园圆冤
摘摇 要院以球孢白僵菌渊月藻葬怎增藻则蚤葬 遭葬泽泽蚤葬灶葬冤再月 原园远 为受体菌株袁 采用农杆菌介导的遗传转化方法袁实现
了农杆菌 粤郧蕴员渊责粤栽酝栽员冤介导的球孢白僵菌的遗传转化袁并研究了转化介质和 责匀对转化效率的影响遥
结果表明院在采用 圆愿益尧圆园园滋皂燥造 辕 蕴的乙酰丁香酮渊粤杂冤尧农杆菌浓度 韵阅远园园 越 园郾 愿尧孢子浓度为 员 伊 员园远个 辕皂造尧责匀缘郾 员 耀 缘郾 愿 时可实现 栽鄄阅晕粤的插入转化遥 当转化体系 责匀缘郾 猿 时袁转化效率最高袁达 缘愿远 个转化子 辕
员园远分生孢子曰不同共转化介质对转化效率影响明显袁 玻璃纸和硝酸纤维素膜转化效率较高遥 对 猿园园园
个转化子生长速度和产孢量等性状分析获得 源远 个性状特异突变体遥 本文结果为进一步研究球孢白僵
菌的生长发育尧致病机理和毒力相关基因功能奠定了基础遥
关键词院球孢白僵菌曰农杆菌 粤郧蕴员曰栽鄄阅晕粤插入转化曰转化效率
郧耘晕耘栽陨悦 栽砸粤晕杂云韵砸酝粤栽陨韵晕 韵云 月藻葬怎增藻则蚤葬 遭葬泽泽蚤葬灶葬 哉杂陨晕郧 粤早则燥遭葬糟贼藻则蚤怎皂 贼怎皂藻枣葬糟蚤藻灶泽鄄酝耘阅陨粤栽耘阅
栽砸粤晕杂云韵砸酝粤栽陨韵晕 粤晕阅 酝哉栽粤晕栽杂 杂悦砸耘耘晕陨晕郧 宰陨栽匀 杂孕耘悦陨粤蕴 栽砸粤陨栽杂
再粤晕郧 蕴蚤鄄则燥灶早员 摇 匝哉粤晕 载蚤灶员 摇 匀哉粤晕郧 再蚤灶早员 摇 蕴陨粤晕郧 杂澡藻灶圆 摇 载哉耘 月葬燥鄄早怎燥员
渊员援 孕造葬灶贼 孕则燥贼藻糟贼蚤燥灶 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻袁 匀藻灶葬灶 粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻 袁 匀藻灶葬灶 运藻赠 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 枣燥则 悦燥灶贼则燥造 燥枣 悦则燥责 阅蚤泽藻葬泽藻泽 葬灶凿 陨灶泽藻糟贼 孕藻泽贼泽袁
陨孕酝 运藻赠 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 蚤灶 杂燥怎贼澡藻则灶 责葬则贼 燥枣 晕燥则贼澡 悦澡蚤灶葬 枣燥则 酝蚤灶蚤泽贼则赠 燥枣 粤早则蚤糟怎造贼怎则藻袁 在澡藻灶早扎澡燥怎袁 匀藻灶葬灶摇 源缘园园园圆曰
圆援 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣 匀燥则贼蚤糟怎造贼怎则藻袁匀藻灶葬灶 粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽袁 在澡藻灶早扎澡燥怎袁 匀藻灶葬灶摇 源缘园园园圆冤
粤遭泽贼则葬糟贼院陨灶 贼澡蚤泽 泽贼怎凿赠袁 月藻葬怎增藻则蚤葬 遭葬泽泽蚤葬灶葬 再月 原 园远 憎葬泽 泽怎糟糟藻泽泽枣怎造造赠 贼则葬灶泽枣燥则皂藻凿 怎泽蚤灶早 粤早则燥遭葬糟贼藻则蚤怎皂 贼怎皂藻枣葬糟蚤藻灶泽鄄
皂藻凿蚤葬贼藻凿 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 葬责责则燥葬糟澡袁 葬灶凿 栽鄄阅晕粤 蚤灶泽藻则贼蚤燥灶 皂怎贼葬灶贼泽 憎藻则藻 枣怎则贼澡藻则 燥遭贼葬蚤灶藻凿援 栽澡藻 藻枣枣藻糟贼泽 燥枣 责匀 葬灶凿 糟怎造贼蚤增葬贼蚤燥灶
皂藻凿蚤葬 燥灶 早藻灶藻贼蚤糟 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 憎藻则藻 泽贼怎凿蚤藻凿 怎灶凿藻则 贼澡藻 糟燥灶凿蚤贼蚤燥灶 燥枣 圆愿益袁 员 伊 员园远 泽责燥则藻泽 辕 皂造袁 粤援 贼怎皂藻枣葬糟蚤藻灶泽 渊粤郧蕴员冤
韵阅远园园 越 园郾 愿袁 圆园园滋皂燥造 辕 蕴 葬糟藻贼燥泽赠则蚤灶早燥灶藻 葬灶凿 源愿澡 糟燥鄄糟怎造贼蚤增葬贼蚤燥灶 蚤灶 贼澡藻 责则藻泽藻灶糟藻 燥枣 蚤灶凿怎糟贼蚤燥灶 皂藻凿蚤怎皂援 栽澡藻 则藻泽怎造贼泽泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 贼则葬灶泽枣燥则皂葬灶贼泽 糟燥怎造凿 遭藻 燥遭贼葬蚤灶藻凿 蚤灶 泽责藻糟蚤枣蚤糟 责匀 增葬造怎藻 则葬灶早蚤灶早 枣则燥皂 缘郾 员 贼燥 缘郾 愿 葬灶凿 贼澡藻 贼则葬灶泽枣燥则皂葬灶贼蚤燥灶
藻枣枣蚤糟蚤藻灶糟赠 则藻葬糟澡藻凿 贼澡藻 澡蚤早澡藻泽贼 造藻增藻造 葬贼 责匀缘郾 猿 憎蚤贼澡 葬遭燥怎贼 缘愿远 贼则葬灶泽枣燥则皂葬灶贼泽 责藻则 员园远泽责燥则藻泽援 栽澡藻 则藻泽怎造贼泽 葬造泽燥 则藻增藻葬造藻凿 贼澡葬贼
贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 藻枣枣蚤糟蚤藻灶糟赠 憎葬泽 澡蚤早澡藻则 燥灶 糟藻造造燥责澡葬灶藻 葬灶凿 晕悦 皂蚤造造蚤责燥则藻 枣蚤造贼藻则 糟燥皂责葬则藻凿 贼燥 枣蚤造贼藻则 责葬责藻则援 匀孕匀 垣 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 葬灶凿
孕悦砸 葬泽泽葬赠 燥枣 贼澡藻 贼则葬灶泽枣燥则皂葬灶贼泽 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 栽鄄阅晕粤 澡葬凿 遭藻藻灶 泽怎糟糟藻泽泽枣怎造造赠 蚤灶贼藻早则葬贼藻凿 蚤灶贼燥 贼澡藻 早藻灶燥皂藻 燥枣 贼澡藻 枣怎灶早怎泽援
粤 枣藻憎 皂怎贼葬灶贼泽 憎藻则藻 蚤凿藻灶贼蚤枣蚤藻凿 遭赠 糟燥造燥灶赠 早则燥憎贼澡袁 糟燥造燥灶赠 糟燥造燥则袁 葬灶凿 糟燥灶蚤凿蚤怎皂 燥怎贼责怎贼 燥枣 贼澡藻 猿袁园园园 贼则葬灶泽枣燥则皂葬灶贼泽援
粤造贼燥早藻贼澡藻则袁 贼澡蚤泽 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 泽赠泽贼藻皂 责则燥增蚤凿藻凿 葬 遭葬泽蚤泽 枣燥则 贼澡藻 泽贼怎凿赠 燥枣 凿藻增藻造燥责皂藻灶贼袁 责葬贼澡燥早藻灶蚤糟蚤贼赠 皂藻糟澡葬灶蚤泽皂 葬灶凿
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运藻赠 憎燥则凿泽院 月藻葬怎增藻则蚤葬 遭葬泽泽蚤葬灶葬曰 粤早则燥遭葬糟贼藻则蚤怎皂 贼怎皂藻枣葬糟蚤藻灶泽 粤郧蕴员曰 栽鄄阅晕粤 蚤灶泽藻则贼蚤燥灶 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶曰 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶
藻枣枣蚤糟蚤藻灶糟赠
源怨怨
摇 苑 期 农杆菌介导球孢白僵菌转化体系的建立及突变体筛选
摇 摇 球孢白僵菌渊月藻葬怎增藻则蚤葬 遭葬泽泽蚤葬灶葬 渊月葬造泽援 冤 灾怎蚤造造冤袁
属 于 半 知 菌 亚 门 渊 阅藻怎贼藻则燥皂赠糟燥贼蚤灶葬 冤袁 丝 孢 纲
渊匀赠责澡燥皂赠糟藻贼藻泽冤袁丛梗孢目 渊 酝燥灶蚤造蚤葬造藻泽冤袁丛梗孢科
渊酝燥灶蚤造蚤葬糟藻葬藻冤袁白僵菌属渊月藻葬怎增藻则蚤葬冤袁是最常见的昆虫
病原真菌之一袁广泛应用于害虫的生物防治咱员袁圆暂 袁已取
得显著效果咱猿袁源暂 遥 但存在杀虫速度慢尧效率低尧防治效
果不稳定等缺陷袁使其推广使用受到制约袁随着病原真
菌遗传转化技术的日趋成熟袁基因工程技术己成为菌
株改良及分子机制研究最有效的途径咱员员 耀 员猿暂 袁自 员怨怨愿
年咱缘暂首次报道农杆菌介导的遗传转化应用于构建丝
状真菌随机插入突变库以来袁许多重要病原真菌已经
建立了 栽鄄阅晕粤随机插入突变库并分离鉴定了一些具
有重要功能的基因咱远 耀 怨暂 遥 农杆菌介导的遗传转化在构
建随机插入突变库时具有快速获得大量转化子和侧翼
序列袁转化子中的 栽鄄阅晕粤 插入的多为单拷贝咱员园暂等显
著优点遥 昆虫病原真菌渊如球抱白僵菌和金龟子绿僵
菌等冤已经建立了农杆菌介导的遗传转化方法咱员员 耀 员 愿暂 袁
但受农杆菌介导的遗传转化效率及其稳定性的影响袁
分离鉴定具有特定表型变化的突变体及其相关基因的
研究报导还不多见遥 本实验室在前期研究中从小麦蚜
虫上分离到球孢白僵菌 再月 原 园远 菌株袁室内毒力试验
表明对蚜虫具有很好的杀虫作用遥 但研究人员由于对
该菌侵染蚜虫的致病机理了解甚微袁从而限制了对该
菌在生物防治上的应用遥 本研究优化根癌农杆菌介导
栽鄄阅晕粤 的转化方法袁探讨高效的白僵菌菌株 栽鄄阅晕粤插
入突变体库影响因子袁以期获得控制生长发育及致病
相关突变体袁为白僵菌的致病机理研究及改进生物防
治效果提供科学依据遥
员摇 材料与方法
员郾 员摇 材料
员郾 员郾 员摇 菌株摇 球孢白僵菌 月援 遭葬泽泽蚤葬灶葬 渊月葬造泽援 冤 灾怎蚤造造
再月 原 园远 菌株为本实验室保存菌种遥 含有双元载体
责粤栽酝栽员 的根癌农杆菌菌株 粤郧蕴 原 员 由浙江大学王政
逸教授惠赠遥
员郾 员郾 圆摇 化学试剂摇 乙酰丁香酮渊简称 粤杂冤尧圆渊晕 原马
啉冤乙基磺酸渊简称 酝耘杂冤尧头孢霉素尧硫酸链霉素尧卡
那霉素等产品均购自 杂蚤早皂葬 公司袁潮霉素 月 购自
砸燥糟澡藻公司袁其他试剂为国产分析纯遥
员郾 员郾 猿摇 培养基摇 蕴月培养基用于培养农杆菌 粤郧蕴 原 员袁
参见文献咱愿暂遥 诱导培养基 陨酝 和 粤陨酝 用于农杆菌预
培养和共培养转化袁参见文献咱苑 耀 员员暂的方法曰孕阅粤 培
养基渊早 辕 蕴冤院马铃薯 圆园园袁 葡萄糖 圆园袁琼脂粉 员缘遥
员郾 圆摇 方法
员郾 圆郾 员摇 再月 原 园远 菌株对潮霉素 月 的敏感性测定 摇 将
再月 原 园远 菌株分别接种于含 园尧 圆缘尧 缘园尧 苑缘尧 员园园 和
员圆缘滋早 辕 皂造潮霉素 月 的 孕阅粤 培养基平板上袁用打孔器
取相同菌龄和直径的菌碟于平板中心袁圆愿益培养 苑凿
后袁观察菌落生长情况袁根据菌株生长情况确定最佳潮
霉素筛选浓度遥 每个处理 猿 个重复遥
员郾 圆郾 圆摇 球孢白僵菌 再月 原 园远 分生孢子的制备 摇 取在
孕阅粤平板上培养 苑凿的球孢白僵菌 再月 原园远袁用 员园皂造无
菌水冲洗分生孢子袁孢子悬液用 猿 层无菌擦镜纸过滤
后收集于 员郾 缘皂造离心管中袁猿园园园则 辕 皂蚤灶 离心 圆皂蚤灶袁弃去
上清袁加无菌水配制分生孢子浓度为 员 伊 员园远个 辕 皂造袁用
于转化遥
员郾 圆郾 猿摇 农杆菌转化和共培养摇 取 原 愿园益保存的带有
质粒 责粤栽酝栽员 的农杆菌 粤郧蕴员袁在 蕴月 固体培养基上活
化袁待长出单斑菌落后袁挑单斑接种于 缘皂造 的 蕴月 液体
培养基渊含 缘园滋早 辕 皂造 卡那霉素袁猿园滋早 辕 皂造 利福平冤中袁
圆园园则 辕 皂蚤灶尧圆愿益培养约 源愿澡袁待菌液浓度达 韵阅远园园 越 园郾 远耀 员 时袁用含有乙酰丁香酮的 陨酝 液体培养液稀释袁然
后在 猿园益尧圆园园则 辕 皂蚤灶 预诱导培养 远澡袁待菌体浓度达
韵阅远园园为 园郾 远 时袁即可用于共培养遥员郾 圆郾 源摇 不同农杆菌浓度对转化效率的影响摇 挑取农
杆菌 粤郧蕴员 单菌落接种于 缘皂造 含有相应抗性的 蕴月 液
体培养基中袁圆愿益袁圆园园则 辕 皂蚤灶培养 员凿袁缘 园园园则 辕 皂蚤灶离心
缘皂蚤灶 收集菌体袁用含有 粤杂渊 圆园园滋皂燥造 辕 蕴冤 的 蕴月 液体
培养基重悬菌体袁使其 韵阅远园园值约为 园郾 圆袁按照同等条
件继续培养至 韵阅远园园 越 园郾 源尧园郾 远尧园郾 愿 和 员郾 园 用于后续
的转化试验袁每处理 猿 个重复遥
员郾 圆郾 缘摇 不同转化介质下共培养摇 将制备得到的菌株
再月 原 园远 分生孢子悬液与经诱导培养的农杆菌 粤郧蕴员
按 员颐 员比例等体积混合袁取 圆园园滋造 混合液分别均匀涂
布于覆有滤纸尧玻璃纸和硝酸纤维素滤膜 渊孔径
园郾 源缘滋皂尧直径 源缘皂皂冤的共培养基上遥 猿 种共培养介质
面积约为 员远糟皂圆袁按农杆菌介导的球孢白僵菌 再月 原 园远
菌株转化的优化条件于 圆愿益下黑暗共培养 源愿澡袁然后
转入含有抗生素渊员园园滋早 辕 皂造 潮霉素 月尧源园园滋早 辕 皂造 头孢
霉素和 远园滋早 辕 皂造硫酸链霉素冤的 孕阅粤 上培养袁筛选转
化子遥 每处理 猿 个重复袁用 阅孕杂 软件进行差异显著性
分析遥
员郾 圆郾 远摇 不同 责匀 值对农杆菌介导的转化效率的影响
摇 本文以玻璃纸为共转化介质袁农杆菌浓度 韵阅远园园 越园郾 愿袁进一步确定 再月 原 园远 菌株高效转化的 责匀 值遥 转
化体系 责匀 值分别设为 缘郾 园尧缘郾 员尧缘郾 圆尧缘郾 猿尧缘郾 源尧缘郾 缘尧
缘郾 远尧缘郾 苑尧缘郾 愿尧缘郾 怨 和 远郾 园袁共 员员 个值遥 每处理 猿 个重
缘怨怨
核摇 农摇 学摇 报 圆远 卷
复袁用 阅孕杂软件进行差异显著性分析遥
员郾 圆郾 苑摇 转化子的筛选鉴定摇 为检测转化子的正确性
渊即潮霉素 月的遗传稳定性冤袁 随机选取 圆员 个转化子
在不含潮霉素 月 的 孕阅粤 上连续培养 缘 代袁然后接种
于含 员园园滋早 辕 皂造 潮霉素 月的 孕阅粤平板上袁进行抗性测
定遥 同时袁以所选转化子基因组 阅晕粤为模板袁以 匀孕匀鄄
云 渊 栽栽郧粤悦粤栽栽郧郧郧郧粤郧栽栽栽粤郧悦郧 冤 和 匀孕匀鄄砸
渊栽郧栽栽郧郧悦郧粤悦悦栽悦郧栽粤栽栽郧冤为引物袁孕悦砸 检测潮霉
素抗性基因片段渊约 员园园园遭责冤遥 圆缘滋造 的反应体系扩增
程序如下院怨源益 猿皂蚤灶曰怨源益 源缘泽袁缘远益 源缘泽袁苑圆益 猿园泽袁猿缘
个循环遥 最后袁采用 员豫琼脂糖凝胶检测 孕悦砸 扩增结
果遥
员郾 圆郾 愿摇 转化子生物学性状研究及其特异突变体的获
得摇 转化子接种于 孕阅粤 培养基上培养 源凿 后袁测量菌
落直径袁计算其生长速度曰镜下观察孢子数量曰每个转
化子设 猿 个重复遥
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 不同浓度潮霉素 月对 再月 原园远 菌株生长的影响
再月 原园远 菌株在含潮霉素 月 的 孕阅粤 上培养 苑凿 后
如表 员 所示袁圆缘 耀 缘园滋早 辕 皂造 潮霉素 月 使菌株生长受到
一定抑制袁而在 苑缘 耀 员圆缘滋早 辕 皂造 或更高浓度下袁菌丝完
全丧失生长能力袁菌株死亡遥 据此袁本研究以 员园园滋早 辕
皂造 潮霉素 月作为筛选阳性转化子的适宜浓度遥
表 员摇 球孢白僵菌 再月 原园远 对潮霉素 月 的敏感性
栽葬遭造藻 员摇 匀赠早则燥皂赠糟蚤灶 泽怎泽糟藻责贼蚤遭蚤造蚤贼赠 燥枣 再月 原园远
潮霉素 月浓度
澡赠早则燥皂赠糟蚤灶 月 糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶渊滋早 辕 皂造冤
园 圆缘 缘园 苑缘 员园园 员圆缘
生长情况
早则燥憎贼澡 泽贼葬贼蚤燥灶 垣垣垣 垣垣 垣 要 要 要
注院 垣垣垣 院生长良好曰 垣垣 院生长受到抑制曰 垣 院强烈抑制生长曰要院丧失生
长能力遥
晕燥贼藻院 垣垣 垣 院早则燥憎贼澡 憎藻造造曰 垣 垣 院 蚤灶澡蚤遭蚤贼藻凿 早则燥憎贼澡曰 垣 院 泽贼则燥灶早造赠 蚤灶澡蚤遭蚤贼藻凿
早则燥憎贼澡曰 要院 憎蚤贼澡燥怎贼 早则燥憎贼澡
圆郾 圆摇 农杆菌浓度对转化效率的影响
取不同浓度渊 韵阅远园园 越 园郾 圆尧园郾 源尧园郾 远尧园郾 愿 和 员郾 园冤
的根癌农杆菌 粤郧蕴员 菌液各 员园园滋造袁分别与等体积的浓
度为 员园远个 辕 皂造 的白僵菌孢子悬液混匀袁涂布在 陨酝 固
体平板培养基渊 责匀 缘郾 猿袁含 粤杂 圆园园滋皂燥造 辕 蕴冤 上 圆愿益避
光培养 员凿袁然后转移到 孕阅粤渊 含潮霉素 月 员园园滋早 辕 皂造袁
链霉素 远园滋早 辕 皂造袁头孢霉素 源园园滋早 辕 皂造冤 筛选培养基上
培养袁筛选转化子遥 结果表明渊图 圆冤院 农杆菌 韵阅值从
图 员摇 不同浓度潮霉素 月对球孢
白僵菌 再月 原园远 生长的影响
云蚤早援 员摇 耘枣枣藻糟贼 燥枣 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶 燥枣
澡赠早则燥皂赠糟蚤灶 燥灶 早则燥憎贼澡 燥枣 再月 原园远
员院对照曰圆 耀 远院潮霉素 月浓度依次为
圆缘尧缘园尧苑缘尧员园园尧员圆缘滋早 辕 皂造
员院悦运曰圆 耀 远院澡赠早则燥皂赠糟蚤灶 月 糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶院
圆缘尧缘园尧苑缘尧员园园尧员圆缘滋早 辕 皂造
园郾 圆 增加到 园郾 远 转化效率显著提高袁农杆菌浓度为
韵阅远园园 越 园郾 远 时转化效率最高袁韵阅远园园 越 园郾 愿 时次之遥
图 圆摇 农杆菌浓度对转化效率的影响
云蚤早援 圆摇 耘枣枣藻糟贼 燥枣 粤援 贼怎皂藻枣葬糟蚤藻灶泽 糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶
燥灶 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 藻枣枣蚤糟蚤藻灶糟赠
圆郾 猿摇 责匀值对 再月 原园远 菌株转化效率的影响
不同 责匀 值对 再月 原 园远 菌株转化效率影响试验结
果表明袁共培养 源愿澡后袁玻璃纸剪成条状转移到含不同
抗生素的 孕阅粤培养基上培养后袁责匀为 缘郾 园尧缘郾 怨 和 远郾 园
的玻璃纸平板上没有出现转化子曰责匀 值为 缘郾 员 耀 缘郾 愿
之间的玻璃纸平板上均出现转化子袁经统计和差异显
著性分析袁责匀缘郾 猿 时转化效率最高袁责匀缘郾 愿 时转化效率
最低袁二者差异达极显著遥 渊表 圆冤遥
圆郾 源摇 不同承载介质对转化效率的影响
以滤纸尧玻璃纸和硝酸纤维素滤膜作为共培养转化
承载介质袁结果如图 猿所示袁在采用 圆愿益尧圆园园滋皂燥造 辕 蕴的
乙酰丁香酮渊粤杂冤尧农杆菌浓度 韵阅远园园 越园郾 愿尧责匀缘郾 猿时袁不
同转化介质上共培养转化效率不同袁每 员园远个分生孢子
在上述猿种介质上培养分别获得源圆猿尧缘远愿和缘愿远个转化
子遥 玻璃纸与硝酸纤维素滤膜为介质袁转化效率较高袁
但二者间转化效率差异不显著渊孕 跃 园郾 园缘冤遥 滤纸转
远怨怨
摇 苑 期 农杆菌介导球孢白僵菌转化体系的建立及突变体筛选
摇 摇 摇 摇 摇 表 圆摇 责匀值对转化效率的影响
栽葬遭造藻 圆摇 耘枣枣藻糟贼 燥枣 责匀 燥灶 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 藻枣枣蚤糟蚤藻灶糟赠
培养基 责匀值
责匀 燥枣糟怎造贼怎则藻 皂藻凿蚤怎皂
平均获得转化子数 辕
员园远分生孢子
缘郾 园 园郾 园 依 园郾 园早郧
缘郾 员 远源郾 园 依 怨郾 圆枣云
缘郾 圆 猿园圆郾 苑 依 苑郾 远糟悦
缘郾 猿 缘远愿郾 园 依 员猿郾 源葬粤
缘郾 源 猿远猿郾 苑 依 员圆郾 缘遭月
缘郾 缘 圆圆远郾 源 依 圆苑郾 苑凿阅
缘郾 远 员愿远郾 园 依 愿郾 苑藻耘
缘郾 苑 缘圆郾 苑 依 员园郾 源枣云
缘郾 愿 源愿郾 远 依 愿郾 缘枣云
缘郾 怨 园郾 园 依 园郾 园早郧
远郾 园 园郾 园 依 园郾 园早郧
注院数据后不同大写和小写字母分别表示在 园郾 园员 和 园郾 园缘 水平差异显
著遥
晕燥贼藻院阅葬贼葬 憎蚤贼澡 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 糟葬责蚤贼葬造 葬灶凿 泽皂葬造造 造藻贼贼藻则泽 皂藻葬灶 泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼 凿蚤枣枣藻则藻灶糟藻
葬贼 园郾 园员葬灶凿 园郾 园缘 造藻增藻造袁 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠援
化效率最低袁与玻璃纸和硝酸纤维素滤膜比较袁转化效
率差异显著渊孕 约园郾 园缘冤遥 因此袁在转化过程中袁选择玻
璃纸和硝酸纤维素微孔滤膜作为共培养介质遥
图 猿摇 不同转化介质对转化效率的影响
云蚤早援 猿摇 耘枣枣藻糟贼 燥枣 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 皂藻凿蚤怎皂 燥灶
贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 藻枣枣蚤糟蚤藻灶糟赠
图 缘摇 孕悦砸扩增鉴定转化子
云蚤早援 缘摇 陨凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 贼则葬灶泽枣燥则皂葬灶贼泽 遭赠 孕悦砸
酝院 阅晕粤标准分子量曰员 耀 员缘院 转化子曰员远院 阳性对照质粒 责粤栽酝栽员曰员苑院 野生菌株
酝院 阅晕粤 皂葬则噪藻则曰 员 耀 员缘院 贼则葬灶泽枣燥则皂葬灶贼泽曰 员远院 责粤栽酝栽员曰 员苑院憎蚤凿藻 贼赠责藻
圆郾 缘摇 转化子遗传稳定性检测
圆郾 缘郾 员摇 转化子的潮霉素抗性稳定性检测摇 随机选取
圆员 个转化子接种到不含潮霉素 月 的 孕阅粤上连续培养
缘 代后袁转接种于含 员园园滋早 辕 皂造 潮霉素 月 的固体 孕阅粤
培养基上遥 如图 源 所示袁在没有潮霉素选择压力下袁圆员
个转化子经 缘 代培养袁并未丧失潮霉素抗性袁再接种于
含潮霉素 月的 孕阅粤培养基上仍能正常生长袁表现出潮
霉素抗性袁表明潮霉素基因在转化子基因组中具有遗
传稳定性遥
图 源摇 转化子对潮霉素的稳定性
云蚤早援 源摇 杂贼葬遭蚤造蚤贼赠 燥枣 贼则葬灶泽枣燥则皂葬灶贼泽 燥灶 澡赠早则燥皂赠糟蚤灶
悦运院野生菌株摇 悦运院憎蚤凿藻 贼赠责藻
圆郾 缘郾 圆摇 转化子稳定性的分子鉴定摇 以随机挑选的 员缘
个转化子基因组 阅晕粤 为模板袁 分别以 再月 原园远 菌株和
质粒 责粤栽酝栽员 为阴性和阳性对照袁 经 孕悦砸扩增及测序
后发现袁员缘 个转化子和 责粤栽酝栽员 质粒均含有 员园园园遭责
的潮霉素抗性片段袁而野生菌株 再月 原园远 没有该片段遥
这表明 栽鄄阅晕粤 已插入转化子基因组 阅晕粤 内袁随转化
子细胞生长而进行转录和翻译袁使转化子表现出潮霉
素抗性和遗传稳定性渊图 缘冤遥
圆郾 远摇 特异突变体获得
经农杆菌介导的 再月 原 园远 菌株的转化袁本实验室
已得到近 猿园园园 个转化子袁其初步生物学性状分析如图
远 所示袁在 孕阅粤 培养基上培养 源凿袁与野生转化子相比
这些转化子表现为生长缓慢袁形态各异遥 苑凿 后有 圆缘
个转化子产孢量显著降低渊本文未列数据冤遥 这些性
状特异突变体的获得袁为后期该病原菌非致病突变体
的筛选尧控制生长发育及其致病相关基因的克隆奠定
苑怨怨
核摇 农摇 学摇 报 圆远 卷
图 远摇 球包白僵菌 再月 原园远 转化子菌落形态
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了基础遥
猿摇 讨论
由于微生物制剂的技术特征和发展方向与人类未
来的生产方式尧食品安全尧营养健康尧生态平衡和生物
多样性都具有良好的相融性袁加上以现代发酵工程尧生
物技术为基础的生物农药工业化生产技术体系日趋完
善袁微生物制剂的研究引起广泛关注和重视遥 尤其是
球孢白僵菌袁因其寄主范围广袁防治害虫效果好袁对自
然界害虫种群数量有重要调控作用袁但昆虫病原真菌
存在击倒害虫时间长和防效不稳定等缺点袁限制了其
进一步应用遥 为改变这一局面袁有必要加强昆虫病原
真菌致病分子机理的研究遥 农杆菌介导的真菌遗传转
化因其操作简便袁转化效率高袁转化子高通量性袁易获
得单拷贝随机插入的转化子等优点而成为研究植物病
原真菌致病相关基因及其致病分子机制的手段之
一咱员园袁员猿暂 遥 相信随着对农杆菌介导真菌遗传转化各个
因素的进一步深入研究和探讨袁更多的真菌将会利用
该方法成功地实现遗传转化袁农杆菌介导的遗传转化
也将成为研究不同真菌基因功能尧分离标记基因更加
有效的手段遥 随着越来越多的基因组测序的完成袁使
以农杆菌介导的真菌转化为主导的反向遗传学研究更
加高效袁这种技术手段渐渐成为病理学科研工作者研
究致病机制尧建立致病分子机制模型及寻找新的药物
靶点的强有力工具遥
目前在很多作物上已实现了农杆菌介导的遗传转
化研究咱员远袁员苑暂 袁而在真菌上起步较晚咱缘暂 袁先前利用原生
质体 原 孕耘郧转化方法咱员愿暂和电击转化方法咱员怨暂转化真菌
研究袁转化效率分别为 员园 转化子 辕 滋早质粒 阅晕粤和 园郾 圆
耀 园郾 远 转化子 辕 滋早 质粒 阅晕粤 辕 员园苑原生质体袁转化效率
很低袁而农杆菌介导的 栽鄄阅晕粤转化方法在真菌上的应
用大大提高了白僵菌的转化效率袁可达到 员猿 耀 圆圆 转化
子 辕 员园远分生孢子咱圆园暂 遥 且可对转化条件进行优化袁提高
转化效率遥 在本课题组的试验中袁农杆菌介导的 栽鄄
阅晕粤插入突变技术建立了含有 猿园园园 个转化子的白僵
菌 再月 原 园远 的突变体库袁通过对影响转化的不同因子
优化袁发现潮霉素筛选浓度尧农杆菌浓度尧转化 责匀 值
和转化介质对转化效率都有一定的影响袁且准确调整
转化时 责匀浓度尤为重要袁本文中 圆愿益尧圆园园滋皂燥造 辕 蕴 的
乙酰丁香酮渊粤杂冤尧农杆菌浓度 韵阅远园园 越 园郾 愿尧孢子浓度
为 员 伊 员园远个 辕 皂造 时袁调整 责匀 值到 缘郾 猿 转化效率达到
缘愿远 转化子 辕 员园远分生孢子袁与前人咱圆园暂研究相比大大提
高了转化效率遥 试验中袁转化介质的选择有所不同袁以
滤纸尧玻璃纸和硝酸纤维素滤膜三者作为承载转化介
质袁结果表明玻璃纸与硝酸纤维素滤膜转化效率相当
并显著高于滤化袁同时玻璃纸成本相对较低袁是最适转
化介质袁这些为进一步建立高通量的突变体库打下很
好的基础遥 本试验中潮霉素 月 筛选最适浓度为
员园园滋早 辕 皂造袁与之前报道的 圆园园滋早 辕 皂造咱圆园袁圆员暂筛选浓度有
较大差异袁这也许是由于野生菌株之间对潮霉素 月 的
抗性有所差异袁也表明本课题组分离的菌株 再月 原 园远
对潮霉素 月 的抗性水平低袁只用 员园园滋早 辕 皂造 潮霉素 月
就可达到筛选特异突变体的目的遥
通过遗传转化获得的 猿园园园 个转化子经初步生物
学性状分析袁如图 远 所示袁有一些转化子在菌落形态和
生长速度上有不同程度的改变袁产孢量渊未列具体数
据冤的改变很大程度上是由于 栽鄄阅晕粤插入某个特定基
因而导致其发生突变所导致袁研究结果为今后分离和
鉴定这些白僵菌突变体的 栽鄄阅晕粤标记基因袁尤其是影
愿怨怨
允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
圆园员圆袁圆远渊苑冤院园怨怨源 耀 园怨怨怨
响毒力的相关基因袁以及进一步研究它们在生长发育
和致病过程中的生物学功能奠定了良好基础袁 也为高
效利用白僵菌防治虫害奠定了理论基础遥
源摇 结论
本试验优化了农杆菌介导的球孢白僵菌遗传转化
条件袁建立了高效的农杆菌介导的球孢白僵菌遗传转
化突变体库构建方法袁在 圆愿益尧圆园园滋皂燥造 辕 蕴 的乙酰丁
香酮渊粤杂冤尧农杆菌浓度 韵阅远园园 越 园郾 愿尧孢子浓度为 员 伊
员园远个 辕 皂造和 责匀缘郾 猿 时可实现较高效率 栽鄄阅晕粤 的插入
转化袁不同共转化介质对转化效率影响明显袁玻璃纸和
硝酸纤维素膜转化效率较高遥
参考文献院
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咱员远暂摇 张明洲袁崔海瑞袁舒庆尧袁夏英武援 高粱茎尖再生体系及其遗传
转化影响因子的研究咱允暂 援 核农学报袁圆园园远袁 圆园院圆猿 原 圆远
咱员苑暂摇 杨海英袁朱丹华袁胡小丽袁杨清华袁袁凤杰袁董德坤援 农杆菌介导
的大豆成熟胚芽尖遗传转化体系的优化咱 允暂 援 核农学报袁 圆园员员袁
圆缘院远远缘 原 远苑圆
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