全 文 ：　 核 农 学 报　 ２０１３ꎬ２７(６):０７３１ ~ ０７３５
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
收稿日期:２０１２￣０９￣２６　 接受日期:２０１３￣０１￣１６
基金项目:黑龙江农垦总局资助(ＨＮＫ１１Ａ￣０１￣０７￣０８)
作者简介:王北艳(１９７９￣)ꎬ女ꎬ硕士研究生ꎬ实验师ꎬ主要从事生物化学和分子生物学工作ꎮ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｗａｎｇｂｅｉｙａｎ１９８０＠ １６３. ｃｏｍ
通讯作者:殷奎德(１９６４￣)ꎬ 男ꎬ博士ꎬ教授ꎬ主要从事植物分子育种研究工作ꎮ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｙｉｎｋｕｉｄｅ＠ ｓｏｈｕ. ｃｏｍ
文章编号:１０００￣８５５１(２０１３)６￣０７３１￣０５
转 ｒｄ２９Ａ￣ＩＣＥ１ 冷诱导基因水稻提高抗寒性研究
王北艳　 殷奎德
(黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院ꎬ黑龙江 大庆　 １６３３１９)
摘　 要:本研究以 ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ 质粒为基础ꎬ构建了植物冷诱导表达载体 ｐＣＡＭＢＩＡ１３００￣ｒｄ２９Ａ￣ＩＣＥ１ꎬ利
用农杆菌介导法导入粳稻品种空育 １３１ 中ꎮ ＰＣＲ、ＲＴ￣ＰＣＲ和 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交检测结果表明ꎬＩＣＥ１ 基因已
经成功整合到水稻基因组中ꎬ并正常表达ꎮ 与对照相比ꎬ低温处理后超表达 ＩＣＥ１ 基因的水稻转基因株
系存活率和脯氨酸含量明显增加ꎬ丙二醛含量积累速率明显下降ꎬ提高了抗低温胁迫能力ꎮ
关键词:水稻ꎻＩＣＥ１ 基因ꎻｒｄ２９Ａ启动子ꎻ遗传转化ꎻ耐寒性
　 　 低温是限制植物生长发育的重要环境胁迫因素之
一ꎬ限制着植物的时空分布ꎬ严重影响作物的产量和品
质ꎬ几乎每年都会对农业生产造成巨大损失[１]ꎮ 作为
东亚地区最重要的粮食作物之一的水稻是对热量条件
要求较高的作物ꎬ而地处中高纬度的黑龙江省是全国
热量资源最少的省份之一ꎬ地理位置决定了水稻冷害
具有普遍性、多发性和严重性ꎮ 通过基因工程手段提
高水稻抗冷害能力在寒地水稻安全生产上具有重要的
意义ꎮ 拟南芥 ＩＣＥ(Ｉｎｄｕｃｅｒ ｏｆ ＣＢＦ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ)低温胁
迫转录激活因子在低温胁迫信号传导和诱导下游冷诱
导基因(ＣＯＲ)表达起着关键作用ꎬ广泛参与植物低温
胁迫应答反应ꎬ是近年植物抗寒基因工程中研究较多
的一类转录因子ꎮ Ｃｈｉｎｎｕｓａｍｙ 等[２]从拟南芥中分离
和鉴定了第一个 ＩＣＥ１ 基因ꎬ其蛋白编码一个类似
ＭＹＣ 的碱性 － 螺旋 － 环 － 螺旋 ( ｂａｓｉｃ Ｈｅｌｉｘ￣Ｌｏｏｐ￣
ＨｅｌｉｘꎬｂＨＬＨ)转录激活因子ꎬ具有 ＭＹＣ 转录因子家族
特有的 ｂＨＬＨ(碱性 －螺旋 －环 －螺旋)ＤＮＡ 结合域ꎮ
ＩＣＥ１ 基因为组成型表达ꎬ其蛋白在常温处于钝化状
态ꎬ在低温条件下发生磷酸化、脱磷酸化、泛素化或类
泛素化等转录后修饰ꎬ使 ＩＣＥ１ 蛋白从无活性的单体变
为有活性的二聚体ꎬ能够与 ＣＢＦ３ 启动子上的 ＭＹＣ 顺
式作用元件结合ꎬ激活 ＣＢＦ３ 基因的表达ꎬ从而激活
ＩＣＥ１￣ＣＢＦ￣ＣＯＲ 冷反应通路ꎬ导致植物抗寒性的提
高[２]ꎮ 低温胁迫转录激活因子 ＩＣＥ１ 的研究近年来已
经获得了一定的进展ꎬ已从多种植物中分离了 ＩＣＥ￣ｌｉｋｅ
基因[３ － ５]ꎬ获得了转 ＩＣＥ１ 基因的拟南芥[２ꎬ ６]、柑橘[７]、
番茄[８]和烟草[９]ꎬ极大提高了抗寒性ꎮ
本研究构建了 ｒｄ２９Ａ 启动子调控的 ＩＣＥ１ 基因的
植物超表达载体ꎬ对粳稻品种空育 １３１ 进行遗传转化ꎬ
以期增强寒地水稻的抗低温胁迫能力ꎬ旨在为通过转
基因手段快速培育抗冷害水稻品种奠定基础ꎮ
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
粳稻品种空育 １３１ 由黑龙江省农科院水稻研究所
培育ꎮ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ、琼脂糖凝胶 ＤＮＡ 回收试剂盒、大
肠杆菌菌株 ＤＨ５α 和 ＤＮＡ 产物纯化试剂盒均购自
ＴＩＡＮＧＥＮ公司ꎮ 限制性内切酶和 Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ购自
ＴａＫａＲａ 公司ꎮ ｐＭＤ１８￣Ｔ￣ｒｄ２９Ａ 和 ｐＣＡＭＢＩＡ１３００￣３５Ｓ￣
ＩＣＥ１ 载体由黑龙江八一农垦大学生命学院分子生物
学实验室构建保存ꎮ ＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
Ｋｉｔ、杂交液和尼龙膜均为 Ｒｏｃｈｅ 公司产品ꎮ 乙酰丁香
酮(ＡＳ)和潮霉素 Ｂ 均购自北京鼎国生物技术有限责
任公司ꎮ 扩增拟南芥 ｒｄ２９Ａ 启动子的特异引物为
ｒｄ２９Ａｆ: ５′￣ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＡＧＡＴ￣ＧＣＡＡＴＴＣＡＡＴＣＡ￣３′
和 ｒｄ２９Ａｒ: ５′￣ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＴＴＣＣＡＡＡＧＡＴＴＴＴ￣
ＴＴＴＣＴＴＴＣ￣３′ꎻ扩增拟南芥 ＩＣＥ１ 基因的特异引物为
ＩＣＥ１ｆ: ５′￣ＣＧＡＡＴＴＣＧＡＴＧＧＧＴＣＴ￣ＴＧＡＣＧＧＡＡ￣３′ 和
ＩＣＥ１ｒ: ５′￣ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＴＡ￣ＣＣＡＧＣＡＴＡＣＣＣＴ￣３′ꎬ 均
１３７
核　 农　 学　 报 ２７ 卷
由上海生工生物工程有限公司完成ꎮ
１􀆰 ２　 方法
１􀆰 ２􀆰 １　 植物冷诱导表达载体的构建及对水稻遗传转
化 　 利用 ＢａｍＨ Ⅰ和 Ｎｃｏ Ⅰ对 ｐＭＤ１８￣Ｔ￣ｒｄ２９Ａ 和
ｐＣＡＭＢＩＡ１３００￣３５Ｓ￣ＩＣＥ１ 载体进行双酶切ꎬ回收目的片
段ꎬ连接构建成植物冷诱导表达载体 ｐＣＡＭＢＩＡ１３００￣
ｒｄ２９Ａ￣ＩＣＥ１(图 １)ꎬ菌落 ＰＣＲ、酶切和测序验证无误
后ꎬ电击导入农杆菌 ＬＢＡ４４０４ 感受态中ꎮ 用空育 １３１
成熟胚诱导的愈伤组织作为转化材料ꎬ利用农杆菌介
导法对其进行遗传转化ꎬ具体操作按 Ｈｉｅｉ 等[１０]的方
法ꎮ
图 １　 植物表达载体 ｐＣＡＭＢＩＡ１３００￣
ｒｄ２９Ａ￣ＩＣＥ１ Ｔ￣ＤＮＡ区结构示意图
Ｆｉｇ. １　 Ｓｋｅｔｃｈ ｆｏｒ Ｔ￣ＤＮＡ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｖｅｃｔｏｒ ｐＣＡＭＢＩＡ１３００￣ｒｄ２９Ａ￣ＩＣＥ１
１􀆰 ２􀆰 ２　 转基因植株的分子生物学鉴定 　 采用 ＣＴＡＢ
法对 Ｔ０代转基因水稻植株叶片总 ＤＮＡ 进行提取ꎬ以
表达载体 ＤＮＡ为阳性对照ꎬ未转基因水稻 ＤＮＡ 为阴
性对照ꎬ利用 ＩＣＥ１ｆ 和 ＩＣＥ１ｒ 特异引物对所获得的转
基因植株进行 ＰＣＲ 检测ꎬ扩增条件为:９４℃ꎬ４ ｍｉｎꎻ
９４℃ꎬ３０ ｓꎬ５８℃ꎬ４５ ｓꎬ７２℃ꎬ９０ ｓꎬ３５ 个循环ꎻ７２℃ꎬ１０
ｍｉｎꎮ 提取 ＰＣＲ 检测呈阳性植株的总 ＲＮＡ 进行 ＲＴ￣
ＰＣＲꎬ同时以未转化的水稻 ＲＮＡ 为阴性对照ꎬ表达载
体质粒为阳性对照ꎬ利用 ＩＣＥ１ｆ 和 ＩＣＥ１ｒ 特异引物检
测 ＩＣＥ１ 基因在水稻中是否表达ꎮ 提取 ＰＣＲ 检测呈阳
性植株的总 ＤＮＡꎬ利用 ＸｈｏⅠ进行酶切ꎬ同时用 ＸｈｏⅠ
酶切植物表达载体(图 １ꎬ可切下 １０２６ ｂｐ 的 ｈｐｔ ＩＩ 片
段)及未转基因水稻 ＤＮＡ 分别作为阳性对照和阴性
对照ꎮ 电泳、转膜、固定ꎬ以 ｈｐｔ ＩＩ 片段为探针进行
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ３　 转基因水稻的耐低温胁迫能力鉴定　 将获得
的 Ｔ１ 代水稻种子灭菌后分别接种在 ＭＳ 培养基上(含
１００μｇ􀅰ｍＬ － １潮霉素 Ｂ)ꎬ选取发芽的抗性种子播种在
土壤中ꎬ以同龄非转基因水稻作为对照ꎬ将转基因水稻
幼苗同时放入 ＬＲＨ￣２５０ＣＬ 生化培养箱中ꎬ进行 ４℃ꎬ
１４ｈ光照处理ꎬ９６ｈ后取出ꎬ置于 ２６℃环境下培养 １ 周
后观察表型恢复情况并统计存活率ꎮ 选择在抗寒试验
中存活率较高的株系ꎬ按上述方法播种ꎬ将 ２５ｄ苗龄的
幼苗置于 ４℃ꎬ１４ ｈ 光照条件下分别处理 ０、２４ 和 ４８ｈ
后ꎬ进行脯酸含量[１１]和丙二醛[１２]含量测定ꎮ 所有试
验重复 ３ 次ꎬ采用 ＳＰＳＳ １１􀆰 ５ 软件进行数据统计分析ꎮ
２ 结果与分析
２􀆰 １ 　 植物冷诱导表达载体 ｐＣＡＭＢＩＡ１３００￣ｒｄ２９Ａ￣
ＩＣＥ１ 的鉴定
在 ＬＡ平板上挑取抗性单菌落ꎬ利用引物 ｒｄ２９Ａｆ
和 ｒｄ２９Ａｒ进行菌落 ＰＣＲ检测ꎬ可以扩增到一条 ９００ｂｐ
左右目的片段(图 ２)ꎬ与 ｒｄ２９Ａ 启动子大小(９６０ｂｐ)基
本相符ꎻ通过双酶(ＢａｍＨⅠ和 ＮｃｏⅠ)切鉴定ꎬ可切下
１０００ｂｐ左右片段(图 ３)ꎬ证明 ｒｄ２９Ａ 启动子已经插入
到 ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１￣ＩＣＥ１ 载体上ꎬ可用于后续的水稻的
遗传转化ꎮ
注:１:ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ１２００ꎻ２￣１０: ｒｄ２９Ａ启动子的菌落 ＰＣＲ产物ꎮ
Ｎｏｔｅ:１:ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ１２００ꎻ２￣１０: Ｃｌｏｎｙ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｒｄ２９Ａ ｐｒｏｍｏｔｅｒ.
图 ２　 重组质粒 ｐＣＡＭＢＩＡ１３００￣
ｒｄ２９Ａ￣ＩＣＥ１ 的菌落 ＰＣＲ鉴定
Ｆｉｇ. ２　 Ｃｏｌｏｎｙ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ
ｐｌａｓｍｉｄ ｐＣＡＭＢＩＡ１３００￣ｒｄ２９Ａ￣ＩＣＥ１
２􀆰 ２　 转基因水稻植株 ＰＣＲ检测
本研究对移栽成活的潮霉素抗性植株进行 ＰＣＲ
检测ꎬ部分转基因植株和阳性对照均能扩增到 １５００ｂｐ
左右的目的条带 (图 ４ )ꎬ与目的基因 ＩＣＥ１ 大小
(１４８５ｂｐ)一致ꎬ呈阳性反应ꎬ而阴性对照却没有扩增
到目的条带ꎬ证明 ｒｄ２９Ａ 冷诱导启动子调控的目的基
因 ＩＣＥ１ 已经整合到水稻基因组中ꎮ
２􀆰 ３　 转基因水稻植株 ＲＴ￣ＰＣＲ检测
对 ＰＣＲ阳性水稻植株的叶片进行 ＲＴ￣ＰＣＲ 检测ꎬ
部分转基因植株和阳性对照均能扩增到 １５００ ｂｐ 左右
的片段(图 ５)ꎬ而阴性对照却没有扩增到目的条带ꎬ进
一步证明目的基因 ＩＣＥ１ 已经整合到水稻基因组中ꎬ并
实现了转录ꎮ
２􀆰 ４　 水稻转基因植株 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ检测结果
选取 ＰＣＲ反应为阳性的部分转基因水稻植株ꎬ以
ｈｐｔ ＩＩ片段为探针进行 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析ꎮ 结果表明ꎬ
转基因水稻植株和阳性对照均显示出 １０００ｂｐ 左右的
２３７
　 ６ 期 转 ｒｄ２９Ａ￣ＩＣＥ１ 冷诱导基因水稻提高抗寒性研究
注:１: 重组质粒 ｐＣＡＭＢＩＡ１３００￣ｒｄ２９Ａ￣ＩＣＥ１￣ｐｏｌｙＡ双酶切ꎻ
２: １ Ｋｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ Ｍａｒｋｅｒꎮ
Ｎｏｔｅ:１: Ｄｏｕｂｌｅ ｅｎｚｙｍｅ ｃｕｔｔｉｎｇ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＣＡＭＢＩＡ１３００￣
ｒｄ２９Ａ￣ＩＣＥ１￣ｐｏｌｙＡꎻ ２: １ Ｋｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ Ｍａｒｋｅｒ.
图 ３　 重组质粒 ｐＣＡＭＢＩＡ１３００￣ｒｄ２９Ａ￣
ＩＣＥ１ 的双酶切鉴定
Ｆｉｇ. ３　 Ｄｏｕｂｌｅ ｅｎｚｙｍｅ ｃｕｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＣＡＭＢＩＡ１３００￣ｒｄ２９Ａ￣ＩＣＥ１
注:１: Ｍａｒｋｅｒ２０００ꎻ ２:质粒(阳性对照)ꎻ ３: 未转化的水稻植株
(阴性对照)ꎻ ４ － １８: 转基因植株ꎮ
Ｎｏｔｅ:１. Ｍａｒｋｅｒ２０００ꎻ ２: ｐｌａｓｍｉｄ(ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ)ꎻ ３: Ｎｏｎ￣Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｉｃｅ
ｐｌａｎｔｓ(ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ)ꎻ ４ － １８: Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓ.
图 ４　 部分转基因植株 ＰＣＲ检测结果
Ｆｉｇ. ４　 ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｓｏｍｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ
注:１: Ｍａｒｋｅｒ Ｖꎻ ２ － ５:转基因植株ꎻ ６: 未转化的水稻植株
(阴性对照)ꎻ ７: 质粒(阳性对照)ꎮ
Ｎｏｔｅ:１. Ｍａｒｋｅｒ Ｖꎻ ２ － ５: Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓꎻ ６: Ｎｏｎ￣Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓ(ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ)ꎻ ７: ｐｌａｓｍｉｄ(ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ) .
图 ５　 部分转基因水稻植株的 ＲＴ￣ＰＣＲ检测
Ｆｉｇ. ５　 ＲＴ￣ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｍｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓ
杂交信号(图 ６)ꎬ呈阳性反应ꎬ而阴性对照却没有杂交
出目的条带ꎬ从而在 ＰＣＲ 基础上进一步证明 ｒｄ２９Ａ 冷
诱导启动子调控的目的基因 ＩＣＥ１ 已经整合到水稻基
因组中ꎮ
注:１:未转化的水稻植株(阴性对照)ꎻ ２: 酶切质粒产物
(阳性对照): ３ － ５: 转基因植株ꎮ
Ｎｏｔｅ:１:Ｎｏｎ￣Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓ(ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ)ꎻ
２: Ｅｎｚｙｍｅ ｃｕｔｔｉｎｇ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ(ｐｏｓｉｔｉｖｅ
ｃｏｎｔｒｏｌ)ꎻ ３ － ５: Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓ.
图 ６　 部分转基因植株 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ检测结果
Ｆｉｇ. ６　 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ
ｓｏｍｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ
注:Ａ:未转基因水稻植株ꎻ Ｂ: 转基因水稻株系ꎮ
Ｎｏｔｅ:Ａ:Ｎｏｎ￣Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓꎻ Ｂ: Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｉｃｅ ｌｉｎｅ.
图 ７　 转基因植株 Ｔ１ 代抗寒性检测结果
Ｆｉｇ. ７　 Ｔｈｅ ｃｏｌｄ ｔｏｒｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ Ｔ１ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｐｌａｎｔｓ
２􀆰 ５　 Ｔ１ 转基因水稻的抗寒性分析
抗寒试验结果表明ꎬ大部分未转基因植株发生叶
面卷曲、萎蔫、植株倒伏现象ꎬ而转基因株系 Ｔ１ － １６ 和
Ｔ１ － ２４ 的大部分植株能恢复正常生长ꎬ表现出明显的
抗寒性(图 ７)ꎬ存活率明显高于对照 １０􀆰 ０％的存活率
(Ｐ < ０􀆰 ０５)ꎮ 在低温胁迫下ꎬ转基因水稻植株和未转
基因水稻植株的游离脯氨酸含量均随胁迫时间的延长
而增加(图 ８)ꎬ但转基因水稻株系游离脯氨酸含量增
加的幅度明显高于未转基因对照株系ꎬ说明在低温下
ＩＣＥ１ 基因的转入促进了水稻中脯氨酸的大量合成ꎮ
在低温胁迫过程中ꎬ转基因株系的丙二醛含量显著低
于对照(图 ９)ꎬ表明转基因株系在低温胁迫过程中受
３３７
核　 农　 学　 报 ２７ 卷
伤害的程度较小ꎬ进一步证明转 ＩＣＥ１ 基因提高了水稻
的抗寒性ꎮ
图 ８　 低温处理对转基因水稻株系脯氨酸含量的影响
Ｆｉｇ. ８　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｒｅｓｓ ｏｎ ｐｒａｌｉｎｅ
ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｉｃｅ ｌｉｎｅｓ
图 ９　 低温对转基因水稻株系丙二醛含量的影响
Ｆｉｇ. ９　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｒｅｓｓ ｏｎ ＭＤＡ
ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｉｃｅ ｌｉｎｅｓ
３　 讨论
植物对低温胁迫的反应是一个积极主动的适应过
程ꎬ许多温带植物暴露在非冰冻温度下一段时间后ꎬ会
诱导一些与冷有关基因表达ꎬ从而提高其抗冻性[１３]ꎮ
植物冷驯化过程中ꎬ会激活一系列基因的表达ꎬ这些被
低温诱导表达的基因称为冷诱导基因(Ｃｏｌｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ
ｇｅｎｅꎬ ＣＯＲ)ꎮ 植物抗寒基因工程一般是将冷诱导基
因导入目标植物进行异源过量表达来提高植物的抗寒
性ꎮ 植物的抗寒性属于数量性状ꎬ一般由多基因控制ꎬ
需要多个抗寒基因的协同作用才能改善植物的抗寒
性ꎬ单个功能性蛋白基因在植物内异源超表达ꎬ难以达
到提高植物抗寒性目的ꎮ 与植物抗寒性直接相关的功
能性蛋白基因的启动子上常含有相同反式因子调控的
顺式元件ꎬ一个转录因子的超表达会激活一系列抗寒
功能性蛋白基因的表达ꎬ从而大幅度提高植物的抗寒
性ꎮ 目前ꎬ已经获得多种超表达各种转录因子的转基
因植物ꎬ其抗寒性得到大幅度提高[７ － ９]ꎮ 本研究中超
表达 ＩＣＥ１ 转录激活因子的水稻株系在低温胁迫下能
够明显增加脯氨酸积累速率ꎬ降低丙二醛积累速率ꎬ提
高了转基因水稻的抗低温能力ꎮ
目前在转基因植物中较常使用的是花椰菜花叶病
毒的 ＣａＭＶ３５Ｓ启动子ꎬ但是ꎬ一些转录因子在组成型
强启动子驱动下在植物中异源超表达ꎬ即使在正常生
长条件下ꎬ也会诱导一系列冷胁迫基因的表达ꎮ 这种
错误的基因表达是植物在正常生长条件下不需要的ꎬ
对植物无疑是一种浪费ꎬ常常造成转基因植株在正常
生长条件下株型变异和植株矮小[１４]ꎮ ｒｄ２９Ａ启动子是
一个受干旱、低温、盐碱诱导表达的启动子ꎬ仅在胁迫
诱导下表达ꎬ目前已被广泛应用植物抗逆基因工程
中[１５]ꎮ 利用胁迫诱导启动子 ｒｄ２９Ａ 代替组成型强启
动子ꎬ可以使外源基因仅在植物遭受外界胁迫时ꎬ在植
物中进行超表达ꎬ这样可以消除在正常生长条件下外
源基因超表达对植物带来的不利影响[１６]ꎮ 本研究转
ＩＣＥ１ 转录激活因子的水稻株系的脯氨酸含量和丙二
醛含量在正常条件下与未转基因水稻株系差异显著而
且转基因水稻生长状态良好ꎬ也证实在植物抗寒基因
工程中ꎬｒｄ２９Ａ 冷诱导启动子的确能弥补组成型启动
子的缺点ꎮ
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[１４] 　 Ｉｔｏ Ｙꎬ Ｋａｔｓｕｒａ Ｋꎬ Ｍａｒｕｙａｍａ Ｋꎬ Ｔａｊｉ Ｔꎬ Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｍꎬ Ｓｅｋｉ Ｍꎬ
Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ Ｋꎬ Ｙａｍａｇｕｃｈｉ￣Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ Ｋ. Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｉｃｅ
ＤＲＥＢ１ / ＣＢＦ￣ｔｙｐｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｃｏｌｄ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ
ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｉｃｅ[ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ
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[１６]　 Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｅｓｃｈｉ Ａꎬ Ｒｅｙｎｏｌｄｓ Ｍꎬ Ｐａｃｈｅｃｏ Ｍꎬ Ｂｒｉｔｏ ＲＭꎬ Ａｌｍｅｒａｙａ Ｒꎬ
Ｙａｍａｇｕｃｈｉ￣Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ Ｋꎬ Ｈｏｉｓｉｎｇｔｏｎ Ｄ. Ｓｔｒｅｓｓ￣ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ
ｗｈｅａｔ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＤＲＥＢ１Ａ ｇｅｎｅ ｄｅｌａｙｓ ｗａｔｅｒ ｓｔｒｅｓｓ
ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｕｎｄｅｒ ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ [ Ｊ] . Ｇｅｎｏｍｅꎬ ２００４ꎬ ４７:
４９３ － ５００
Ｉｎｔｅｇｒａｔｔｉｎｇ Ｃｏｌｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｖｅ Ｇｅｎｅ ｒｄ２９Ａ￣ＩＣＥ１ ｉｎｔｏ
Ｒｉｃｅ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｃｏｌｄ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ
ＷＡＮＧ Ｂｅｉ￣ｙａｎ　 ＹＩＮ Ｋｕｉ￣ｄｅ
(Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ｂａｙｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｄａｑｉｎｇꎬ Ｈｅｉｌｏｎｇ ｊｉａｎｇ　 １６３３１９)
Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ꎬ ｃｏｌｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｖｅ ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ － ｒｄ２９Ａ￣ＩＣＥ１ ｗａｓ
ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ Ｊａｐｏｎｉｃａ ｒｉｃｅ Ｋｏｎｇｙｕ１３１ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ. ＰＣＲꎬＲＴ￣
ＰＣＲ ａｎｄ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ＩＣＥ１ ｇｅｎｅ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｒｉｃｅ ｌｉｎｅｓ ａｎｄ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｎｏｒｍａｌｌｙ. Ａｆｔｅｒ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｒｅｓｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔꎬ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｌｉｎｅｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ＩＣＥ１ ｇｅｎｅ ｈａｄ ｏｂｖｉｏｕｓ ｈｉｇｈｅｒ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｎｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ. Ｉｎ ｔｈｅ ｍｅａｎｔｉｍｅꎬ ｔｈｅ
ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ (ＭＤＡ) ｃｏｎｔｅｎｔ ｗａｓ ｍｕｃｈ ｌｏｗｅｒ. Ｈｉｇｈ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＩＣＥ１ ｇｅｎｅ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｒｅｓｓ
ｔｏｌｅｒａｎｔ ｃａｐａｃｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｉｃｅ ｌｉｎｅｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ:Ｒｉｃｅꎻ ＩＣＥ１ｇｅｎｅꎻ ｒｄ２９Ａ ｐｒｏｍｏｔｅｒꎻ Ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎꎻ Ｃｏｌｄ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ
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