全 文 ：　 核 农 学 报　 ２０１４，２８（１）：０００７ ～ ００１３
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
收稿日期：２０１３⁃０１⁃２５　 接受日期：２０１３⁃０７⁃３１
基金项目：国家“转基因生物新品种培育科技重大专项”重大课题（２０１１ＺＸ０８００９ － ００３）
作者简介：娄腊梅，女，主要从事植物分子遗传研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｌｏｕｌａｍｅｉ＠ １２６． ｃｏｍ
通讯作者：李学勇，男，主要从事水稻重要性状基因克隆与功能验证研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｌｉｘｕｅｙｏｎｇ＠ ｃａａｓ． ｃｎ
赵宝华，男，教授，主要从事分子细菌学研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｚｈａｏｂａｏｈｕａ８６１７８＠ ｓｏｈｕ． ｃｏｍ
文章编号：１０００⁃８５５１（２０１４）０１⁃０００７⁃０７
两个水稻细卷叶等位突变体的基因定位
娄腊梅１，２ 　 解志伟１，３ 　 尹亮４ 　 赵金凤１ 　 袁守江４ 　 张文会３ 　 赵宝华２ 　 李学勇１
（ １ 中国农业科学院作物科学研究所 ／农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程，北京　 １０００８１；２，河北师范大学
生命科学学院，河北 石家庄　 ０５００２４； ３聊城大学生命科学学院，山东 聊城　 ２５２０５９； ４山东省水稻研究所，山东 济南　 ２５０１００）
摘　 要：叶片形态是水稻重要的农艺性状之一。 本研究分离了两个水稻突变体 Ｆ２ － １０２ 和 Ｓ１ － ４，其表
型为叶片宽度减小，叶片半卷及半矮化。 遗传分析表明，这两个突变体均受单一核编码隐性基因控制，
并利用 Ｉｎｄｅｌ标记将其定位在第 １２ 号染色体长臂上。 对定位区间内的编码类纤维素合成酶 Ｄ４ 的基因
ＯｓＣＳＬＤ４ 进行序列分析表明，突变体 Ｆ２ － １０２ 在第二个外显子缺失了 ８ｂｐ，而 Ｓ１ － ４ 在第二个外显子发
生单碱基替换，导致类纤维素合成酶 Ｄ４ 功能缺失，引起细卷叶表型。
关键词：水稻；细卷叶突变体；基因定位； 类纤维素合成酶 Ｄ４
ＤＯＩ：１０：１１８６９ ／ ｊ． ｉｓｓｎ． １００⁃８５５１． ２０１４． ０１． ０００７
　 　 了解植物叶片发育的分子机制，对于提高植物光
合效率及粮食产量尤为重要。 叶片起源于顶端分生组
织（ ｓｈｏｏｔ ａｐｉｃａｌ ｍｅｒｉｓｔｅｍ ） 外围区域的生成细胞
（ｆｏｕｎｄｅｒ ｃｅｌｌ）。 生成细胞分化成叶原基，进而叶原基
沿着 ３ 个轴线分化发育成平整叶片［１ － ３］。 这 ３ 个轴线
包括叶柄到叶尖的基顶轴（ ｐｒｏｘ⁃ｉｍｏｄｉｓｔａｌ ａｘｉｓ），面对
和背对主茎的 ２ 个叶面之间的近远轴（ａｄａｘｉａｌ⁃ａｂａｘｉａｌ
ａｘｉｓ），以叶片中脉为中心、边缘为两侧的中侧轴
（ｍｅｄｉｏｌａｔｅｒａｌ ａｘｉｓ）。 这些轴线的确定对叶片的形态发
生是必需的，如若轴线极性发生变化则导致叶片的不
正常发育，如形成窄叶、卷叶、针状叶等突变性状。，随
着分子生物学的不断发展，利用突变体研究水稻相关
基因的功能，从而在分子水平上阐释水稻叶片的发育
和形态成为新的研究热点［４］。 窄叶性状的研究对改
良水稻株型和提高产量有重要的意义［５］。 目前被定
位的水稻卷叶基因将近 ２０ 个，其中止于经典遗传学分
析的水稻隐性卷叶基因有 ６ 个，即 ｒｌ１、ｒｌ２、ｒｌ３、ｒｌ４、ｒｌ５
及 ｒｌ６；已定位在分子连锁图上的控制单一卷叶性状的
隐性基因有 ６ 个，即 ｕｒｌ１ （ ｔ）、 ｒｌ７、 ｒｌ８、 ｒｌ９、 ｒｌ１０ （ ｔ）及
ｒｌ１１［６ － １２］；还有 ２ 个控制多个性状的隐性基因 ｓｄ⁃ｓｌ 和
　 　 　 　
ｎａｌ３， 前者表现为叶片短而微卷［１３］，而后者主要控制
窄叶，同时也控制矮化、内卷等性状［１４］。 不完全隐性
卷叶基因 ｒｌ（ ｔ）被定位在第 ２ 染色体的标记 ＩｎＤｅｌ １１２．
６ 和 ＩｎＤｅｌ １１３ 之间，物理距离为 １３７ｋｂ［１５］。 沈革志
等［１６］和陈兆贵等［１７］报道了由 Ｔ⁃ＤＮＡ（Ｄｓ）插入导致的
水稻显性卷叶突变体 ＲＬ⁃Ａ２，但未报道基因定位或克
隆的结果；罗远章等［１８］将显性卷叶基因 Ｒｌ１２（ ｔ）定位
于第 １０ 染色体上的 １􀆰 ７ｃＭ区间内。 严长杰等［１９］在粳
稻中花 １１ 中鉴定了 ｒｌ９ 卷叶突变体，并将基因定位于
第 ９ 染色体 ４２ ｋｂ 的区域内，该基因编码一个 ＧＡＲＰ
转录因子。 水稻细卷叶突变体 ｎｒｌ１ 不仅叶片向内卷
曲而且变细，目前已报道了多个 ＮＲＬ１ 基因的等位突
变体，并进行了基因克隆及功能研究［２０ － ２３］。
本研究利用６０Ｃｏ － γ 射线辐照和化学诱变剂甲基
磺酸已酯（ＥＭＳ）分别诱变粳稻品种 Ｆ２ － ２８５ 及日本
晴，获得了两个卷叶突变体，均表现为叶片向内半卷，
宽度减小及植株半矮化。 本文对其进行了表型分析、
遗传分析及基因定位，为研究水稻叶片发育的分子机
制提供了新的种质资源。
７
核　 农　 学　 报 ２８ 卷
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
以６０Ｃｏ － γ射线辐照粳稻品种 Ｆ２ － ２８５，获得了 １
个细卷叶突变体，编号为 Ｆ２ － １０２；用 ＥＭＳ 诱变粳稻
品种日本晴，获得了 １ 个水稻细卷叶突变体，编号为
Ｓ１ － ４，两者经多代自交后稳定遗传。 这两个纯合突变
体分别与广亲和籼稻品种 Ｄｕｌａｒ 杂交构建 Ｆ２ 群体用
于基因定位。
１􀆰 ２　 方法
１􀆰 ２􀆰 １　 突变体性状调查　 调查营养生长期和生殖生
长期 ２ 个突变体及野生型的相关农艺学性状，如株高、
叶长、叶宽、分蘖数等，并进行统计学分析。
１􀆰 ２􀆰 ２　 基因组 ＤＮＡ的提取　 采用改进的 ＣＴＡＢ 法提
取亲本及定位群体的基因组 ＤＮＡ。 用于分离群体分
组分析法（ＢＳＡ）的混池构建参照郭伟伟等［２４］的方法：
调节两个亲本 ＤＮＡ浓度使其一致，等量混合亲本基因
组 ＤＮＡ，构建亲本混池；选取浓度相近的 １０ 株定位群
体单株的基因组 ＤＮＡ，等量混合构建定位群体混池。
表 １　 用于突变体基因定位的分子标记
Ｔａｂｌｅ １　 Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｍａｐ Ｆ２ －１０２ ａｎｄ Ｓ１ －４
分子标记
Ｍａｒｋｅｒ
Ｆ端引物
Ｆｏｒｗａｒｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （５′ － ３′）
Ｒ端引物
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （５′ － ３′）
Ｉｎｄｅｌ⁃ｃ１２ － ６ ＣＡＡＣＴＡＡＡＡＣＣＡＡＣＡＣＡＡＡＡＴＣＣＡ ＴＧＴＣＴＡＧＴＴＧＣＡＴＧＴＣＴＧＡＧＴＧＴＣ
Ｉｎｄｅｌ⁃ｃ１２ － ７ ＧＴＧＧＣＴＧＴＴＴＡＧＧＡＧＣＧＴＴＴ ＣＡＡＣＣＡＡＡＣＡＧＣＡＡＴＧＣＡＡＣ
Ｓ１２ － ９ － ２ ＡＴＴＣＧＣＡＴＣＣＡＴＴＣＣＴＣＡＡＧ ＧＣＡＡＴＧＴＴＣＴＴＣＣＴＣＧＡＡＧＣ
Ｓ１２ － １１ － ４ ＣＴＣＣＣＣＣＴＣＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＣ ＣＧＡＡＡＡＧＡＧＡＣＡＧＣＴＧＣＡＡＧ
ｃｈｒ１２ － ４ ＡＴＡＡＴＧＧＴＴＧＴＣＡＣＣＣＴＡＧＣ ＣＣＣＴＴＴＴＧＧＣＴＴＣＴＴＡＡＧＣＣ
ｃｈｒ１２ － ８ ＴＴＴＧＴＴＧＴＣＧＧＣＴＣＣＡＴＧＣＡ ＣＴＣＡＡＴＡＧＡＴＴＣＧＴＣＴＣＧＣＧ
ｃｈｒ１２ － ９ ＣＡＴＣＡＡＡＧＧＡＣＴＴＴＧＧＧＣＴＧ ＧＴＴＧＴＧＴＣＴＧＧＡＴＴＧＡＡＧＣＣ
１􀆰 ２􀆰 ３　 基因定位　 首先利用本实验室开发的均匀分
布于水稻 １２ 条染色体上的 ２００ 对 Ｉｎｄｅｌ 标记，对群体
混池进行连锁分析，再利用筛选出的可能连锁的标记
对群体单株进行连锁分析。 根据初定位结果，在目标
区间内发展新标记，进行精细定位，所用标记的引物序
列见表 １。 ＰＣＲ总体系为 １０ μＬ，包含 ２􀆰 ０μＬ ５ × ＰＣＲ
ｂｕｆｆｅｒ， ０􀆰 ２μＬ ２􀆰 ５ｍｍｏｌ·Ｌ － １ ｄＮＴＰｓ， ５􀆰 ７μＬ ｄｄＨ２Ｏ，
１􀆰 ０μＬ ２􀆰 ０ｍｍｏｌ·Ｌ － １引物，１􀆰 ０μＬ 模板 ＤＮＡ，０􀆰 １μＬ
２􀆰 ５Ｕμ·Ｌ － １ Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶。 ＰＣＲ 程序为 ９４℃预变
性 ３ｍｉｎ；９４℃变性 ３０ ｓ，５５℃退火 ３０ ｓ，７２℃复性 ３０ ｓ，
共 ３５ 个循环；７２℃延伸 １０ ｍｉｎ。 ＰＣＲ产物在 ８％的非
变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，快速银染法染色观察。
１􀆰 ２􀆰 ４　 突变基因测序及功能分析　 依据相关文献报
道［２０ － ２３］，将水稻细卷叶基因 ＮＲＬ１ 分成 ４ 个片段并分
别设计引物（表 ２），对 ２ 个突变体中的 ＮＲＬ１ 等位基
因进行 ＰＣＲ 扩增和测序分析。 利用 ＮＣＢＩ （ ｈｔｔｐ： ／ ／
ｗｗｗ． ｎｃｂｉ． ｎｌｍ． ｎｉｈ． ｇｏｖ ／ ）上的 ｂｌａｓｔｐ 程序分析 ＮＲＬ１
蛋白保守的功能结构域和跨膜区，确定突变位点相对
于这些区域的位置。
表 ２　 ＮＲＬ１ 基因测序引物
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＮＲＬ１ ｇｅｎｅ
标记
Ｍａｒｋｅｒ
正向引物
Ｆｏｒｗａｒｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （５′ － ３′）
反向引物
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （５′ － ３′）
ＮＲＬ１ － １ ＧＡＴＴＧＣＴＣＡＣＴＣＡＴＣＧＡＴＣＣ ＡＣＣＴＧＴＡＧＧＧＧＣＴＧＡＧＡＡＴ
ＮＲＬ１ － ２ ＴＴＴＴＣＣＧＴＧＧＴＧＣＡＣＴＣＣＡＴ ＡＣＡＴＣＣＡＣＧＴＧＧＣＣＴＴＣＡ
ＮＲＬ１ － ３ ＧＧＧＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＧＡＡＣＡＡＧＧＴＴＧＣＧＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴ
ＮＲＬ１ － ４ ＴＧＡＴＣＴＣＣＴＧＣＴＴＣＴＡＣＧＡＧ ＣＡＣＡＧＡＣＧＴＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＡ
２　 结果与分析
２􀆰 １　 细卷叶突变体表型鉴定
细卷叶突变体 Ｆ２ － １０２ 苗期无突变性状表现，从
分蘖期开始逐渐表现出半矮化（图 １ － Ａ）、叶片半内
卷（图 １ － Ｂ）及叶片细窄（图 １ － Ｃ）等突变性状。 在抽
穗期对相关性状如叶宽、叶长、株高、分蘖数等进行调
查统计（表 ３）。 结果显示，抽穗期野生型 Ｆ２ － ２８５ 株
高平均为 ８１􀆰 ０５ｃｍ，突变体平均株高为 ６４􀆰 ８３ｃｍ，约为
野生型株高的 ８０％ 。 野生型倒第二叶长为 ２１􀆰 ６６ｃｍ，
突变体叶长为 ２０􀆰 ７９ｃｍ，两者相比变化不明显。 野生
型叶宽为 １８􀆰 ３２ｍｍ，而突变体叶片上卷且变细，叶宽
急剧减少为 ９􀆰 ２ｍｍ，相当于野生型叶宽的一半。 此
外，突变体的叶夹角有一定程度变大，导致株型松散外
８
　 １ 期 两个水稻细卷叶等位突变体的基因定位
Ａ：抽穗期植株； Ｂ：抽穗期剑叶（自然状态）； Ｃ：抽穗期剑叶（平展状态）。
Ａ： Ｇｒｏｓｓ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｔ ｔｈｅ ｈｅａｄｉｎｇ ｓｔａｇｅ； Ｂ： Ｆｌａｇ ｌｅａｖｅ （ｎａｔｕｒａｌ ｓｔａｔｅ）； Ｃ： Ｆｌａｇ ｌｅａｖｅ （ ｆｌａｔｔｅｎｅｄ ｓｔａｔｅ） ．
图 １　 突变体 Ｆ２ －１０２ 与野生型 Ｆ２ －２８５ 表型比较
Ｆｉｇ． １　 Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔ Ｆ２ －１０２ ａｎｄ ｔｈｅ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ Ｆ２ －２８５
Ａ：抽穗期植株； Ｂ： 抽穗期剑叶（自然状态）；
Ｃ：抽穗期剑叶中部（平展状态）。
Ａ： Ｇｒｏｓｓ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｔ ｔｈｅ ｈｅａｄｉｎｇ ｓｔａｇｅ； Ｂ： Ｆｌａｇ ｌｅａｖｅ
（ｎａｔｕｒａｌ ｓｔａｔｅ）； Ｃ： Ｃｅｎｔｒａｌ ｐａｒｔ ｏｆ ｆｌａｇ ｌｅａｖｅ （ ｆｌａｔｔｅｎｅｄ ｓｔａｔｅ） ．
图 ２　 突变体 Ｓ１ －４ 与野生型日本晴表型比较
Ｆｉｇ． ２　 Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ
ｍｕｔａｎｔ Ｓ１ －４ ａｎｄ ｔｈｅ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ
扩（图 １Ａ）；分蘖数目也有一定程度的增加（表 ３）。
　 　 另 １ 个细卷叶突变体 Ｓ１ － ４ 表型更为严重。 抽穗
期表现为矮化（图 ２⁃Ａ），平均株高 ５２􀆰 ０８ｃｍ，为野生型
日本晴的 ４９％ （表 ４）。 叶片小而内卷，不仅变细而且
变短（图 ２⁃Ｂ，２⁃Ｃ）。 抽穗期倒一、倒二和倒三叶的叶
宽分别为野生型的 ４０％ 、 ４３％ 和 ４０％ ，叶长分别为野
生型的 ４７％ 、４７％和 ４０％ （表 ４）。 但与 Ｆ２ － １０２ 不
同，Ｓ１ － ４ 的分蘖数比野生型却减少了（表 ４）。
表 ３　 抽穗期突变体 Ｆ２ －１０２ 与野生型 Ｆ２ －２８５ 性状比较
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｒａｉｔｓ ｂｅｔｗｅｅｎ
ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔ Ｆ２ －１０２ ａｎｄ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ Ｆ２ －２８５
性状
Ｔｒａｉｔｓ ＷＴ（Ｆ２ － ２８５） Ｆ２ － １０２
株高 ／ ｃｍ Ｐｌａｎｔ ｈｅｉｇｈｔ ８１􀆰 ０５ ± ３􀆰 ４９ ６４􀆰 ８３ ± ４􀆰 ６３∗∗
分蘖数 Ｔｉｌｌｅｒ ｎｕｍｂｅｒ １０􀆰 ５２ ± ２􀆰 ４６ １６􀆰 ０８ ± ４􀆰 ３５∗∗
倒二叶长 ／ ｃｍ
Ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｕｐｐｅｒｍｏｓｔ ｌｅａｆ
２１􀆰 ６６ ± ２􀆰 ４４ ２０􀆰 ７９ ± ３􀆰 ９３
倒二叶宽 ／ ｍｍ
Ｗｉｄｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｕｐｐｅｒｍｏｓｔ ｌｅａｆ
１８􀆰 ３２ ± ２􀆰 ０１ ９􀆰 ２０ ± ０􀆰 ６１∗∗
　 　 注：ｎ ＝ ２０；∗和∗∗分别表示在 Ｐ ＜ ０􀆰 ０５ 和 Ｐ ＜ ０􀆰 ０１ 水平上差异显
著。 下同。
Ｎｏｔｅ： ｎ ＝ ２０； ∗， ∗∗ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｔ Ｐ ＜ ０􀆰 ０５ ａｎｄ
Ｐ ＜ ０􀆰 ０１， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｓａｍｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ．
２􀆰 ２　 突变体遗传分析
用纯合突变体 Ｆ２ － １０２ 和 Ｓ１ － ４ 与广亲和籼稻品
种 Ｄｕｌａｒ 杂交，Ｆ１ 植株均表现正常，Ｆ２ 群体出现性状
分离，具有正常叶和细卷叶两种表型，Ｆ２ － １０２ 及 Ｓ１
－ ４ 的 χ２ 检测正常株与突变株符合 ３∶ １分离比，推断
这两个细卷叶突变表型都是受一对隐性核基因控制的
（表 ５）。
２􀆰 ３　 细卷叶突变体基因定位
在 Ｆ２ － １０２ 和 Ｓ１ － ４ 与 Ｄｕｌａｒ 配制的 Ｆ２ 群体中，
分别获得了 ４４ 个和 ２３６ 个突变单株（表 ５），被用于突
变基因定位。 用均匀分布于水稻 １２ 条染色体上的
９
核　 农　 学　 报 ２８ 卷
　 　 　 　表 ４　 突变体 Ｓ１ －４ 与野生型日本晴性状比较
Ｔａｂｌｅ ４　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｒａｉｔｓ ｂｅｔｗｅｅｎ
ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔ Ｓ１ －４ ａｎｄ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ
性状
Ｔｒａｉｔｓ
日本晴
Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ Ｓ１ － ４
株高
Ｐｌａｎｔ ｈｅｉｇｈｔ ／ ｃｍ
１０６􀆰 ０８ ± ２􀆰 ２８ ５２􀆰 ０８ ± ５􀆰 ９３∗∗
分蘖数
Ｔｉｌｌｅｒ ｎｕｍｂｅｒ
１５􀆰 ４４ ± ２􀆰 ５７ １１􀆰 １７ ± ４􀆰 ６３∗∗
倒一叶长
Ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｕｐｐｅｒｍｏｓｔ ｌｅａｆ ／ ｃｍ
３３􀆰 ２ ± ４􀆰 ７２ １５􀆰 ５１ ± ２􀆰 ８６∗∗
倒一叶宽
Ｗｉｄｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｕｐｐｅｒｍｏｓｔ ｌｅａｆ ／ ｃｍ
１６􀆰 ５５ ± １􀆰 ０７ ６􀆰 ７０ ± ０􀆰 ８４∗∗
倒二叶长
Ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｕｐｐｅｒｍｏｓｔ ｌｅａｆ ／ ｃｍ
４６􀆰 ０６ ± ５􀆰 １０ ２１􀆰 ６５ ± ３􀆰 ２５∗∗
倒二叶宽
Ｗｉｄｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｕｐｐｅｒｍｏｓｔ ｌｅａｆ ／ ｍｍ
１３􀆰 ５ ± ０􀆰 ５０ ５􀆰 ７７ ± ０􀆰 ６８∗∗
倒三叶长
Ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｕｐｐｅｒｍｏｓｔ ｌｅａｆ ／ ｃｍ
５０􀆰 ７ ± ３􀆰 ５７ ２２􀆰 ３１ ± ３􀆰 ２５∗∗
倒三叶宽
Ｗｉｄｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｕｐｐｅｒｍｏｓｔ ｌｅａｆ ／ ｍｍ
１２􀆰 ００ ± ０􀆰 ６３ ４􀆰 ７８ ± ０􀆰 ６２∗∗
表 ５　 细卷叶突变体 Ｆ２ －１０２ 及 Ｓ１ －４ 的遗传分析
Ｔａｂｌｅ ５　 Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔｓ Ｆ２ －１０２ ａｎｄ Ｓ１ －４
杂交组合
Ｃｒｏｓｓ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
正常植株
Ｎｏｒｍａｌ
细卷叶植株
Ｎａｒｒｏｗ ａｎｄ
Ｒｏｌｌｅｄ ｌｅａｆ
总数
Ｔｏｔａｌ
ｘ２
（３∶ １）
Ｆ２ － １０２ ／ Ｄｕｌａｒ １５６ ４４ ２００ ０􀆰 ９６
Ｓ１ － ４ ／ Ｄｕｌａｒ ７６４ ２３６ １０００ １􀆰 ０５
Ｉｎｄｅｌ标记在亲本间进行多态性筛选，再用筛选出的多
态性标记对群体进行初步定位。 结果发现，两者都与
１２ 号染色体上的标记 ｓ１２ － ９ － ２ 及 ｓ１２ － １１ － ４ 紧密
连锁。 在这两个标记之间进一步发展新的 Ｉｎｄｅｌ标记，
将基因定位在 ｓ１２ － ９ － ２ 与 ｃｈｒ１２ － ８ 之间（图 ３Ａ）。
该区间的物理距离为 ９３６ｋｂ，含有几十个基因，其中的
ＬＯＣ＿ Ｏｓ１２ｇ３６８９０ 为已报道的细卷叶突变体基因
ＮＲＬ１［２０ － ２３］。 根据突变体表型的相似性，我们将 ＮＲＬ１
做为候选基因。
将 ＮＲＬ１ 基因分成 ４ 个片段分别设计引物，对突
变体 Ｆ２ － １０２ 和 Ｓ１ － ４ 所含 ＮＲＬ１ 基因进行 ＰＣＲ扩增
和序列分析。 结果显示，Ｆ２ － １０２ 突变体中的 ＮＲＬ１
基因第 １２５３ 到 １２６０ 位碱基（共 ８ｂｐ）发生缺失，导致
ＮＲＬ１ 蛋白从第 ４１８ 位氨基酸发生移码突变（图 ３⁃Ｂ）；
Ｓ１ － ４ 突变体中 ＮＲＬ１ 基因第 ３４６８ 位上的碱基由 Ｇ突
变成 Ａ，密码子由 ＴＧＧ 突变成了终止密码 ＴＧＡ，导致
蛋白质的翻译提前终止（图 ３⁃Ｂ）。 因此，Ｆ２ － １０２ 和
Ｓ１ － ４ 是 ＮＲＬ１ 基因的 ２ 个新的等位突变体。
注：Ａ： 突变体基因定位。 标记下面的数字为交换个体数目，上排为
Ｆ２ － １０２，下排为 Ｓ１ － ４；Ｂ：ＮＲＬ１ 基因结构，箭头表示突变位点。
Ｎｏｔｅ： Ａ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｔａｔｅｄ ｇｅｎｅ． Ｆｉｇｕｒｅ ｂｅｌｏｗ ｅａｃｈ
ｍａｒｋｅｒ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ． Ｔｈｅ ｕｐｐｅｒ ｒｏｗ
ｗａｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｆ２ － １０２ ｘ Ｄｕｌａｒ Ｆ２ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ， ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｌｏｗｅｒ ｆｒｏｍ ｔｈｅ
Ｓ１ － ４ ｘ Ｄｕｌａｒ Ｆ２ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ； Ｂ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＮＲＬ１ ｇｅｎｅ． Ａｒｒｏｗｓ
　 　 ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｏｆ Ｆ２ － １０２ ａｎｄ Ｓ１ － ４．
图 ３　 细卷叶突变体 Ｆ２ －１０２ 及 Ｓ１ －４ 的
基因定位和克隆
Ｆｉｇ． ３　 Ｍａｐ⁃ｂａｓｅｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｅｄ
ｉｎ Ｆ２ －１０２ ａｎｄ Ｓ１ －４
２􀆰 ４　 ＮＲＬ１ 蛋白结构分析
ＮＲＬ１ 基因含有 ２ 个外显子及 １ 个内含子
（图 ３⁃Ｂ），编 码 １ 个 类 纤 维 素 合 成 酶 ＯｓＣＳＬＤ４
（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ⁃ｌｉｋｅ Ｄ４）。 该蛋白全长 １２１５ 个氨基
酸，含有 ８ 个跨膜区，其中 ２ 个位于氨基端，其余 ６ 个
聚集在羧基端（图 ４）。 中间为活性区域，含有 １ 个保
守的 Ｄ，Ｄ，Ｄ，ＱＸＸＲＷ基序，该区域不仅是核苷糖结合
位点，也是纤维素合成催化位点。 突变体 Ｆ２ － １０２ 中
第 １２５３ － １２６０ 位碱基缺失，导致 ＮＲＬ１ 蛋白从第 ４１８
位氨基酸发生移码突变，使其后续活性区域及羧基端
六个跨膜区域都不能正常翻译表达。 突变体 Ｓ１ － ４ 的
第 ３４６８ 位碱基由 Ｇ 突变为 Ａ，密码子由 ＴＧＧ 变为终
止密码 ＴＧＡ，致使 ＮＲＬ１ 蛋白从第 １１５６ 位的色氨酸开
始后续氨基酸无法正常合成，导致 ＮＲＬ１ 蛋白的最后
一个跨膜蛋白无法合成。
０１
　 １ 期 两个水稻细卷叶等位突变体的基因定位
注：１．蓝色框为 ８ 个跨膜区； ２．红三角处为 Ｄ，Ｄ，Ｄ，ＱＸＸＲＷ保守区；３．箭头指示不同等位突变体的突变位点。
Ｎｏｔｅ： １． Ｂｌｕｅ ｂｏｘ： ｅｉｇｈｔ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎｓ； ２． Ｒｅｄ ｔｒｉａｎｇｌｅ： ｔｈｅ Ｄ，Ｄ，Ｄ，ＱＸＸＲＷ ｍｏｔｉｆ；３． Ａｒｒｏｗｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈｅ
ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ａｌｌｅｌｉｃ ｍｕｔａｎｔｓ．
图 ４　 ＮＲＬ１ 蛋白结构及 ＮＲＬ１ 等位突变体的突变位点
Ｆｉｇ． ４　 Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＮＲＬ１ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＮＲＬ１ ａｌｌｅｌｉｃ ｍｕｔａｎｔｓ
３　 讨论
目前，对 ＮＲＬ１ 基因的研究已有多篇报道，突变体
ｎｄ１［２０］中，ＮＲＬ１ 基因 ｃＤＮＡ 中的第 ２８９４ 位碱基由 Ｃ
变为 Ｔ，导致第 ９６５ 位氨基酸由丙氨酸变为缬氨酸；
ｎｒｌ１［２１］突变体中，第 ２ 个外显子缺失 ５８ｂｐ，导致第 ７２７
位氨基酸发生移码突变；Ｈｕ 等［２２］将其研究的 ３ 个突
变体分别命名为 ｎｒｌ１ － １、ｎｒｌ１ － ２、 ｎｒｌ１ － ３，这 ３ 个突
变体均发生单碱基替换；ｃｄ１［２３］突变体中，第 １ 个外显
子中插入了 ８ｂｐ，致使发生移码突变，并过早产生终止
（图 ４）。 本试验分离了 ２ 份水稻细卷叶突变体，其表
型与上述突变体相似，均为叶片宽度减小，叶片半卷及
半矮化。 遗传分析表明，这 ２ 个突变体受单一核编码
隐性基因控制。 图位克隆及序列分析表明，突变基因
也为 ＮＲＬ１，其中 Ｆ２ － １０２ 在第 ２ 个外显子上缺失了
８ｂｐ，Ｓ１ － ４ 的第 ３４６８ 位碱基由 Ｇ 突变为 Ａ，导致
ＮＲＬ１ 功能缺失，致使叶片卷曲，植株矮化。 因此，这两
个突变体是 ＮＲＬ１ 基因的 ２ 个新的等位突变体。 截止
本研究，已有 ８ 个 ＮＲＬ１ 基因的等位突变体被报道，诱
变方式包括化学诱变、辐射诱变以及组织培养等。 这
一方面说明 ＮＲＬ１ 位点是基因组中的突变热点，另一
方面也说明 ＮＲＬ１ 基因具有重要的生物学功能。
ＮＲＬ１ 基因编码一个类纤维素合成酶蛋白
ＯｓＣＳＬＤ４，属于类纤维素合成酶家族（ＣＳＬ），该家族中
的蛋白催化各种多聚糖的 β 链接［２５］。 植物基因组中
ＣＳＬ基因家族成员众多，又可分为 ９ 个亚家族，即
ＣＳＬｓ Ａ⁃Ｈ［２６］以及 ＣＳＬＪ［２７］。 ＣＳＬＡ 家族催化甘露聚糖
和葡甘露聚糖的合成［２８ － ３０］，ＣＳＬＣ 家族催化 β － １，４
葡聚糖合成［３１］， ＣＳＬＦ 和 ＣＳＬＨ调节（１，３；１，４） － β －
Ｄ －葡聚糖的合成［３２ － ３４］，ＣＳＬＤ 可能催化阿拉伯木聚
糖的合成［２０］。 单糖组成和糖基连接分析显示 ｎｄ１ 突
变体茎中木聚糖和纤维素含量降低，根尖木聚糖含量
减少不多但分支木糖分布增加［２０］。 因此，破坏 ＣＳＬＤ４
基因功能将会导致细胞壁多糖修饰发生复杂变化，改
变细胞壁结构从而影响细胞形态与植株构型。 朱丽
等［３５］构建了水稻卷窄叶突变相关基因 ＯｓＣＳＬＤ４ 的干
涉载体 ｐＡＮＤＡＨ０５。 转基因阳性植株显示类似于突变
体的表型，叶片明显变窄，卷曲程度增加，株高降低。
表明 ＯｓＣＳＬＤ４ 在水稻叶片形态发育过程中起着非常
重要的作用。
近年来，除 ＮＲＬ１ 基因外，另外 ２ 个水稻内卷叶基
因 ＳＬＬ１ 和 ＳＲＬ１ 也被克隆出来。 ＳＬＬ１ 基因编码
ＫＡＮＡＤＩ家族转录因子，正调控叶片下表面叶肉细胞
向厚壁细胞的分化。 在其功能缺失突变体中由于下表
面不能形成厚壁细胞，机械撑力丧失，从而导致叶片内
卷［３６］。 ＳＲＬ１ 基因编码 ＧＰＩ 锚定蛋白，负调控叶片上
表面泡状细胞（一类特殊大型薄壁细胞）的形成。 在
其功能缺失突变体中叶片上表面泡状细胞数目增多，
机械撑力减弱，也导致叶片内卷［３７］。 本研究中的
ＮＲＬ１ 基因编码类纤维素合成酶 ＯｓＣＳＬＤ４，在其功能
缺失突变体 ｎｄ１ 中细胞壁多糖成分及修饰发生了改
变［２０］，推测其厚壁细胞和泡状细胞的机械撑力也会发
生改变，从而导致叶片内卷。 本文报道的这 ２ 个新的
等位突变体为进一步研究类纤维素合成酶家族在植物
细胞壁合成和株型发育中的作用提供了遗传资源材
料。
４　 结论
水稻突变体 Ｆ２ － １０２ 和 Ｓ１ － ４ 是 ＮＲＬ１ ／ ＯｓＣＳＬＤ４
１１
核　 农　 学　 报 ２８ 卷
基因的 ２ 个新的等位突变体。 类纤维素合成酶 Ｄ４ 的
功能缺失导致叶片变窄并且卷曲，这表明类纤维素合
成酶在水稻叶片形态发育过程中具有重要作用。
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Ｒａｎｄｈａｗａ Ｇ Ｓ， Ｄｏｌａｎ Ｍ， Ｋｉｎｎｅｙ Ａ Ｊ， Ｔｏｍｅｓ Ｄ， Ｎｉｃｈｏｌｓ Ｓ，
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［３０］ 　 Ｌｉｅｐｍａｎ Ａ Ｈ， Ｎａｉｒｎ Ｃ Ｊ， Ｗｉｌｌａｔｓ Ｗ ＧＴ， Ｓøｒｅｎｓｅｎ Ｉ， Ｒｏｂｅｒｔｓ Ａ Ｗ，
Ｋｅｅｇｓｔｒａ Ｋ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｕｐｐｏｒｔｓ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ
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２１
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Ｆｉｎｃｈｅｒ Ｇ Ｂ， Ｎｅｗｂｉｇｉｎ Ｅ， Ｂａｃｉｃ Ａ． Ａ ｂａｒｌｅｙ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ⁃ｌｉｋｅ
ＣＳＬＨ ｇｅｎｅ ｍｅｄｉａｔｅｓ （ １， ３； １， ４ ） － ｂｅｔａ⁃Ｄ⁃ｇｌｕｃａｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ
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ＬＩＫＥ１ ｉｓ ａ ＫＡＮＡＤＩ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｔｈａｔ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｒｉｃｅ ｌｅａｆ
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２００９， ２１（３）： ７１９ － ３５
［３７］　 Ｘｉａｎｇ Ｊ Ｊ， Ｚｈａｎｇ Ｇ Ｈ， Ｑｉａｎ Ｑ， Ｘｕｅ Ｈ Ｗ． Ｓｅｍｉ⁃ｒｏｌｌｅｄ ｌｅａｆ１
ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ⁃ａｎｃｈｏｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ
ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｒｉｃｅ ｌｅａｆ ｒｏｌｌｉｎｇ ｂｙ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｕｌｌｉｆｏｒｍ
ｃｅｌｌｓ ［Ｊ］ ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， ２０１２， １５９（４）：１４８８ － ５００
Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ Ｔｗｏ Ａｌｌｅｌｉｃ
Ｎａｒｒｏｗ ａｎｄ Ｒｏｌｌｅｄ Ｌｅａｆ Ｍｕｔａｎｔｓ ｉｎ Ｒｉｃｅ
ＬＯＵ Ｌａ⁃ｍｅｉ１， ２ 　 ＸＩＥ Ｚｈｉ⁃ｗｅｉ１， ３ 　 ＹＩＮ Ｌｉａｎｇ４ 　 ＺＨＡＯ Ｊｉｎ⁃ｆｅｎｇ１
ＹＵＡＮ Ｓｈｏｕ⁃ｊｉａｎｇ４ 　 ＺＨＡＮＧ Ｗｅｎ⁃ｈｕｉ３ 　 ＺＨＡＯ Ｂａｏ⁃ｈｕａ２ 　 ＬＩ Ｘｕｅ⁃ｙｏｎｇ１
（ １Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｋｅｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙ ｆｏｒ Ｃｒｏｐ Ｇｅｎｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ， Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ，
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８１； ２Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｈｅｂｅｉ Ｎｏｒｍａｌ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ， Ｈｅｂｅｉ　 ０５００２４； ３Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｌｉａｏｃｈｅｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｌｉａｏｃｈｅｎｇ，
Ｓｈａｎｄｏｎｇ　 ２５２０５９； ４Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｒｉｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｊｉｎａｎ， Ｓｈａｎｄｏｎｇ　 ２５０１００）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｌｅａｆ ｓｈａｐｅ ｉｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ａｇｒｏｎｏｍｉｃａｌ ｔｒａｉｔ ｏｆ ｒｉｃｅ． Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ， ｔｗｏ ａｌｌｅｌｉｃ ｍｕｔａｎｔｓ Ｆ２ － １０２ ａｎｄ Ｓ１ － ４
ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ， ｗｈｉｃｈ ｓｈｏｗｅｄ ｒｅｄｕｃｅｄ ｌｅａｆ ｗｉｄｔｈ， ｓｅｍｉ⁃ｒｏｌｌｅｄ ｌｅａｖｅｓ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｅｇｒｅｅｓ ｏｆ ｄｗａｒｆｉｓｍ． Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ
ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｓｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ｗｅｒｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｂｙ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｇｅｎｅ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｍａｐｐｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｌｏｎｇ ａｒｍ ｏｆ
ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １２ ｕｓｉｎｇ Ｉｎｄｅｌ ｍａｒｋｅｒｓ． Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｃｏｍｐａｓｓｅｄ ＯｓＣＳＬＤ４ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ
ｓｙｎｔｈａｓｅ⁃ｌｉｋｅ Ｄ４ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ａｎ ８ｂｐ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｂａｓｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｅｘｏｎ ｏｆ
ＯｓＣＳＬＤ４， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｕｓ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＯｓＣＳＬＤ４ ｗｅｒｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｎａｒｒｏｗ ａｎｄ ｒｏｌｌｅｄ ｌｅａｆ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｒｉｃｅ； Ｎａｒｒｏｗ ａｎｄ Ｒｏｌｌｅｄ Ｌｅａｆ Ｍｕｔａｎｔ； Ｇｅｎｅ Ｍａｐｐｉｎｇ； Ｃｅｌｌｕｌｏｕｓ Ｓｙｎｔｈａｓｅ⁃Ｌｉｋｅ Ｄ４
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