全 文 ：!核 农 学 报!"#$%!"&"$## $$’&$ )$’&A
!"#$%&’"()#*’+&$,-$.*#’/#$&’0*.+%*+1
收稿日期!"#$(*$"*$$!接受日期!"#$%*#.*#’
基金项目!浙江省科技计划项目""##&I$"#&$# !浙江省自然科学基金项目"Bc$(]"&###H# !浙江省药用植物种质改良与质量控制技术重点实验
室项目""#$(#%!"#$$/$##$.# !杭州师范大学研究生创新基金优秀硕士学位论文培育项目及浙江省大学生科技创新活动计划暨新苗
人才计划项目""#$(W%"$#H’#
作者简介!何仁锋!男!主要从事药用植物系统发育研究% /*0123$ UXf&&##((4$"H8;J0
通讯作者!王慧中!男!教授!博导!主要从事植物系统生物学及遗传资源研究% /*0123$ eUlH"4$H(8;J0
冯尚国!男!中级实验师!主要从事珍贵药用植物的遗传学研究% /@0123$ PU15LL7J##’4$"H8;J0
文章编号!$###*&..$""#$%#$#*$’&$*#A
药用菊花 ?IJF*VIW反应体系的正交优化
何仁锋$!冯尚国$!陈!喆$!高!岭$!沈晓霞"!沈宇峰"
王志安"!王慧中$
" $ 杭州师范大学生命与环境科学学院!浙江省药用植物种质改良和质量监控重点实验室!
浙江 杭州!($##(H*" 浙江省中药研究所!浙江 杭州!($##"(#
摘!要!为进一步开发利用药用菊花种质资源!为药用菊花的遗传多样性及分子鉴定研究提供技术支持!
建立并优化药用菊花的目标起始密码子多态性 @聚合酶链式反应" ?IJF*VIW#体系!在方差分析基础
上!运用 B".".
H#正交设计在 . 个水平上对影响药用菊花 ?IJF*VIW反应的模板 -E,$ZL" K$:EFVP$B&F
酶$引物 . 个因素进行优化试验!并对 VIW结果进行分析’ 建立了药用菊花 ?IJF*VIW最佳反应体系
""# "B#(模板 -E,$# 5L!引物 #Q& "0J3%B@$!:EFVP#Q" 00J3%B@$!ZL" K "Q# 00J3%B@$!B&F酶 $Q. a!
?IJF反应的影响因素依次为(B&F酶 q引物 q:EFVPqZL" K q模板 -E,’ 优化的 ?IJF*VIW反应体系
在多个药用菊花品种遗传多样性研究中得到了验证!结果表现出良好的稳定性$重复性和多态性丰富等
特点!该体系的建立为药用菊花品种遗传多样性分析$系统发育研究$遗传图谱构建$基因定位和分子标
记辅助育种研究奠定了基础’
关键词!药用菊花&?IJF&优化&正交设计
-SC$$#Q$$&HAT682PP58$##*&..$Q"#$%Q$#8$’&$
!!菊花"L+%=$&%/;+6& 6"$.("’.#6W101[# 是菊科菊属
的多年生草本植物!其干燥头状花序为常用中药材之
一&$’ !0神农本草经1中有+生川泽及田野!久服能轻身
延年,等描述!并将菊列为疏风散热(解毒消肿(利言明
目之上品&"’ % 药用菊花品种是由菊花的药用类群经过
不同的生态环境和长期人工栽培选育等条件形成!我国
药用菊花栽培历史悠久!类型多样!主要有贡菊(湖菊(
小白菊(大白菊(小黄菊(滁菊(亳菊(大马牙(大怀菊等 A
个菊花药用类群栽培变种&(’ % 由于药用菊花品种繁多
且极易变异!地区间药用菊花类型混杂!出现了许多形
态特征多样的生态型和地理居群!导致药用菊花与其同
属的近缘种类在形态特征上鉴定困难&%’ % 因此!单独利
用传统的分类方法难以对种质资源的遗传多样性做出
准确有效评价% 近年来 -E,分子标记技术迅速发展!
各类标记如$W,V-&.’ (C??W&H @’’ (?W,V&&’等都在药用菊
花遗传多样性研究中有了初步应用!这些研究为药用菊
花种质资源的遗传多样性分析及分子鉴定研究奠定了
基础% 不过!上述标记如 W,V-是简单的随机标记!存
在重复性和可靠性方面的缺陷!不能全面准确反映药用
菊花的遗传多样性!也无法充分满足药用菊花亲缘关
系(图谱构建(基因定位及图位克隆的研究需求*另外!
也有研究表明 W,V-(C??W等分子标记普遍不能与目标
性状建立准确联系!它们在应用上与其目标也存在一定
的偏差&A’ %
"##A 年!国际水稻研究所 IJ31X: 等 &$#’在水稻中
开发出一种新型分子标记技术---目标起始密码子多
态性"P[1X[;J:J5 [1XL9[9: YJ3M0JXYU2P0?IJF#标记!其
原理是根据植物基因中的 ,FG翻译起始位点侧翼序
列的保守性来设计单引物!扩增产生偏向候选功能基
因区% 该标记技术有效整合和补充了 W,V-(C??W标
$&’$
核!农!学!报 "& 卷
记技术的优点!同时能够有效产生与性状连锁的标记!
作为目的基因标记具有有效跟踪目的性状的优点 &$$’ !
从而快速构建与性状的分子关联% 目前!?IJF标记技
术已成功在玄参 &$"’ (铁皮石斛 &$(’等多种中药材植物
的遗传多样性分析研究中得到初步应用% 然而!有关
?IJF标记技术在药用菊花遗传多样性研究中尚鲜有
报道%
本研究以杭白菊 @金菊 % 号为试验材料!利用 B".
".H #正交设计试验!从模板 -E,(ZL" K( :EFVP(B&F
酶(?IJF( 引物 . 个因素在 . 个水平上对 ?IJF体系进
行优化!旨在建立稳定性和重复性良好的 ?IJF*VIW
反应体系!为进一步对药用菊花种质资源遗传多样性
评价(亲缘关系研究及遗传资源道地性保护提供技术
支持!为实现最大限度地保存药用菊花遗传多样性的
策略提供理论依据%
表 !"药用菊花 7@,%I>@V反应体系中的因素水平
%&’()!"4&82,+;)/351,07@,%I>@V/N/2):0,+:);3831&(=23-*"$12#.)..,3%7,(%).
因素 D1;[JX
水平 B9\93
$ " ( % .
ZL" KT00J3)B@$ $Q## $Q.# "Q## "Q.# (Q##
:EFVPT00J3)B@$ #Q$# #Q"# #Q(# #Q%# #Q.#
B&F-E,聚合酶 B&F-E,YJ3M09X1P9Ta #Q". #Q.# $Q## $Q.# "Q##
引物 VX209XPT"0J3)B@$ #Q"# #Q%# #QH# #Q&# $Q##
模板 -E,[90Y31[9-E,T5L $#Q## "#Q## (#Q## %#Q## .#Q##
!"材料和方法
!#!"材料及主要试剂
试验材料杭白菊品种 @金菊 % 号采自浙江桐乡药
用菊花主产区% ?IJF*VIW反应中的 " a)"B@$ B&F
酶($# 00J3)B@$ :EFVP("# 00J3)B@$ ZL" K($# ‘VIW
<7f9X" $## 00J3)B@$ FX2P*]I3! $## 00J3)B@$
"E]%# " ?S%!$## 00J3)B
@$ kI3!$R FX2[J5i@$##! Y]
&Q&# 均订购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司!
-B"### Z1XN9X购自于 FC,EG/E公司!引物序列参考
IJ31X: 和 Z1;N23&$#’ 等! 引 物 ?IJF( " .n @
I,,I,,FGGIF,II,IIG @ (n#! ?IJF"$ " .n@
,IG,I,FGGIG,III,I,@(n# 及 ?IJF(. " .n@
I,FGGIF,II,IIGGIII@(n#均由北京鼎国昌盛生
物技术有限责任公司合成%
!#$"方法
$Q"Q$!基因组 -E,的提取!采用基因组 -E,抽提
试剂盒提取药用菊花的基因组 -E,!具体步骤如下$
剪取新鲜药用菊花叶片约 $## 0L!剪碎后放入研钵!
并将剩余叶片于 @&# ^保存% 往研钵中立即加入液
氮研磨至粉末并迅速转移至 $Q. 0B的离心管中!加入
$ 0BIF,+*fX99缓冲液&#Q. 0J3)B@$ /-F," Y]值 _
&Q##$## 0B($Q# 0J3)B@$ FX2P*]I3" Y]值 _&Q## "##
0B(E1I3$%QH L!定溶至 $ B’缓慢震荡 (# P!于 H. ^
水浴锅中震荡 "# )(# 025 &$%’ !然后使用生工生物工程
"上海#股份有限公司的 /l7Y 柱式植物基因组 -E,
抽提试剂盒!提取药用菊花基因组 -E,%
提取的药用菊花基因组 -E,!用 $R的琼脂糖凝
胶电泳检测其纯度及完整性% 并用生命科学紫外可见
分光光度计"+2J?Y9;*515J#检测 -E,浓度和纯度!将
-E,样品浓度稀释至 ". 5L)"B@$!置于 @"# ^保存
备用%
$Q"Q"!?IJF*VIW反应体系正交设计
以杭白菊品种 @金菊 % 号 -E,为模板!?IJF( 为
引物!在方差分析基础上!对影响药用菊花 ?IJF*VIW
反应的 . 个因素"模板 -E,(ZL" K(:EFVP(B&F酶(引
物#设置了 . 个水平"表 $#!选用 B". ".
H #正交表对药
用菊花 ?IJF*VIW反应进行正交优化"表 "#% 其中每
个处理的 VIW扩增体系为 "# "B!每个处理含 $# ‘
VIW<7f9X"不含 ZL" K#"Q# "B!不足部分用 ::]"S补
足!每个处理重复两次%
$Q"Q(! ?IJF*VIW 扩增及检测 ! 在 /YY95:JXf,G
""(($ ]10<7XL型 VIW扩增仪上完成 VIW扩增!扩增
程序$A% ^预变性 % 025*(. 个循环"A% ^变性 $ 025!
引物F0值复性 $ 025!’" ^延伸 " 025#*’" ^延伸 $#
025!% ^保存% 扩增反应结束后!取 H "BVIW产物与
$ "B的 H ‘BJ1:25L<7f9X混匀!在 $ ‘F,/缓冲系统
下!于含溴化乙锭"/+#的 $Q.R琼脂糖凝胶中进行凝
胶电泳!电压 $.# O!电泳结束后!在紫外凝胶成像系
统上拍照保存%
"&’$
!$# 期 药用菊花 ?IJF*VIW反应体系的正交优化
表 $"7@,%I>@V反应因素水平正交试验设计表 ?$P #P
G $
%&’()$"?$P #P
G $\+29,5,1&(;)/3510,+0&82,+/&1;()Q)(/,07@,%I>@V+)&823,1
试验号
EJ8
ZL" KT
"00J3)B@$ #
:EFVPT
"00J3)B@$ #
B&F-E,聚合酶
B&F-E,YJ3M09X1P9Ta
引物
VX209XPT""0J3)B@$ #
模板 -E,
[90Y31[9-E,T5L
$ $Q# #Q$ #Q". #Q" $#
" $Q# #Q" #Q. #Q% "#
( $Q# #Q( $Q# #QH (#
% $Q# #Q% $Q. #Q& %#
. $Q# #Q. "Q# $Q# .#
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’ $Q. #Q" $Q# #Q& .#
& $Q. #Q( $Q. $Q# $#
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$% "Q# #Q% #Q". #QH .#
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$& "Q. #Q( #Q". #Q& "#
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"# "Q. #Q. $Q# #Q" %#
"$ (Q# #Q$ "Q# #Q& (#
"" (Q# #Q" #Q". $Q# %#
"( (Q# #Q( #Q. #Q" .#
"% (Q# #Q% $Q# #Q% $#
". (Q# #Q. $Q. #QH "#
!#F"数据统计与处理
参照何正文等 &$.’和姜小凤等 &$H’的方法对电泳结
果打分!主要依据 VIW扩增结果电泳条带的多少(清
晰度以及背景颜色进行打分$$ )"."最差的扩增结果
记+$,分*条带多态性最高(清晰度最好(分散性强和
背景颜色少的最佳扩增结果记+".,分#% 根据打分结
果进行直观分析!在假设不存在交互作用情况下!试验
每一因素下各水平的平均值能够反映影响因素各水平
对反应体系的影响情况!因此本研究首先根据电泳平
均得分求出每一因素下各水平的和 F2!各列各水平重
复 . 次!然后求出每一因素下各水平的均值 k2用以反
映因素各水平的影响大小*最后求出同一因素不同水
平间平均值的极差 W!极差 W值越大!影响越显著*为
更好地估计试验误差!利用 ?V?? $(Q# 对结果进一步
进行方差分析%
!#K"7@,%最佳反应体系的稳定性和通用性检测
在对供试引物进行初步筛选的基础上!随机选取
引物对 & 个不同地域来源的 "% 个品种的 (" 份药用菊
花材料进行 VIW扩增!扩增产物在 $Q.R的琼脂糖凝
胶电泳上进行检测以验证该优化的 ?IJF*VIW反应体
系的稳定性和通用性%
$"结果与分析
$#!"正交设计电泳结果评分
将表 ( 正交设计的 ". 个处理进行 VIW!电泳结果
"图 $#所示!结果表明在 . 个水平上 . 种因素的不同
组合对试验影响差异明显!其中 % 和 & 处理的扩增条
(&’$
核!农!学!报 "& 卷
注$$ )". @处理代号参见表 "* Z*-B"###%
EJ[9$$ )". @[X91[095[570<9X15: [X91[095[1PPUJe9: 25 F1<39"* Z*-B"### 01XN9X8
图 !"药用菊花 7@,%I>@V反应体系正交实验电泳图
435 !"M()82+,.9,+)2,5+&: ,0:);3831&(=23-*"$12#.)..,3%7,(%).7@,%I>@V,+29,5,1&(;)/351
带相对明亮(清晰!多态性也相对较高% 据此进行两次
独立打分统计!得分依次为$"!$$!$"!"%!$A!’!"#!".!
$(!$!$.!""!"(!$!$%!$H!$&!’!$’!.!H!A!$!$#!"$*"!
$$!$"!"%!""!H!"(!".!$(!$!$%!$A!"#!$!$.!$H!$&!
H!$’!.!A!’!$!$#!"$*将两次的处理得分取平均分!根
据平均得分结果进行直观和方差分析%
表 F"正交设计直观分析结果
%&’()F"J12-323Q)&1&(N/3/+)/-(2/,0,+29,5,1&(;)/351
水平
B9\93
ZL" KT
"00J3)B@$ #
:EFVPT
"00J3)B@$ #
B&F-E,聚合酶
B&F-E,YJ3M09X1P9Ta
引物
VX209XT""0J3)B@$ #
模板 -E,
F90Y31[9-E,T5L
F$ HAQ. %HQ. $&Q. %$Q. HAQ.
F" H’Q# ’AQ# .#Q# .AQ. HHQ#
F( ’"Q# HHQ# H(Q# .&Q. .&8J
F% H"Q. H.Q# $#HQ. ’%Q# H.Q#
F. %’Q. H"Q# &#Q. &.Q# H#Q#
k$ $(QA AQ( (Q’ &Q( $(QA
k" $(Q% $.Q& $#Q# $$QA $(Q"
k( $%Q% $(Q" $"QH $$Q’ $$QH
k% $"Q. $(Q# "$Q( $%Q& $(Q#
k. AQ. $"Q% $HQ$ $’Q# $"Q#
W %QA HQ. $’QH &Q’ "Q(
!!注$ F2$ 表示任一列上水平号为 2" 本试验中 2_$!"!(!% 或 .#时!所对应的试验结果之和% k2$ k2_F2TP!P为任一列上各水平出现的次数!k2
表示任一列上因素取水平 2时所得试验结果之和% W表示极差%
EJ[9$ F2$ eU95 2_$!"!(!%!JX.! IJXX9PYJ5:25L[J[U9P70Jf[U9[9P[X9P73[P8k2$ k2_F2TP!PX9YX9P95[[U9fX9o795;MJ5 15M329!k2X9YX9P95[eU95 k2
_2![U9P70Jf[U9[9P[X9P73[P8WX9YX9P95[X15L98
"Q$Q$!VIW正交设计直观分析!由正交设计直观分
析结果"表 (#可知!B&F酶的浓度对该反应结果影响
最显著!模板 -E,浓度影响最小!各因素水平的变化
对药用菊花 ?IJF*VIW反应的影响依次为$B&F酶 q引
物 q:EFVPqZL" K q模板 -E,%
"Q$Q"!VIW正交设计方差分析!试验过程中不可避
免的存在误差!而直观分析中的极差不能很好的估计
误差!因此!本研究利用 ?V?? $(Q# 软件对结果进行方
差分析"表 %#$方差分析中的 VIW各因素对本体系的
影响与直观分析结果一致!其中 B&F酶对本试验影响
显著!其他各个因素影响主次也与直观分析一致% 总
体表明试验误差对本试验影响较小!试验结果可行(可
信%
%&’$
!$# 期 药用菊花 ?IJF*VIW反应体系的正交优化
表 K"药用菊花 7@,%I>@V反应体系正交设计方差分析
%&’()K"Z&+3&18)&1&(N/3/,0,+29,5,1&(;)/351,0:);3831&(=23-*"$12#.)..,3%7,(%).7@,%I>@V
变异来源
O1X215;9PJ7X;9
CCC型平方和
?70JfPo71X9P
自由度
=(
均方
Z915 Po71X9P
9值
9\1379
显著性 2值
?2L52f2;15[Jf2\1379
校正模型 IJXX9;[9: 0J:93 $"&AQ(##1 "# H%Q%H. "Q$%% #Q"%#
截距 C5[9X;9Y[ %#.’QHA# $ %#.’QHA# $(%QAH% #Q###
ZL" K ’.Q%H# % $&Q&H. #QH"’ #QHHA
:EFVP $#’QAH# % "HQAA# #Q&A& #Q.%#
B&F-E,聚合酶 B&F-E,YJ3M09X1P9 &HAQ#H# % "$’Q"H. ’Q""’ #Q#%$
引物 VX209X "$AQ%H# % .%Q&H. $Q&". #Q"&’
模板 -E,F90Y31[9-E, $’Q(H# % %Q(%# #Q$%% #QA.H
误差 /XXJX $"#Q"H# % (#Q#H.
总计 FJ[13 .%H’Q".# ".
校正的总计 IJXX9;[9: [J[13 $%#AQ.H# "%
!!注$可决系数 @_#QA$."调整的可决系数 @_#Q%&&# %
EJ[9$ @Po71X9: _#QA$."1:67P[9: @Po71X9: _#Q%&
$#$"五因素各水平的综合优化结果
从直观分析和方差分析结果可知 "表 ((表 % #!
B&F酶浓度对药用菊花 ?IJF*VIW扩增结果的影响最
显著!B&F酶浓度低!VIW扩增产物少甚至没有!B&F
酶浓度过高!表现为非特异性扩增!背景不清晰等现
象!该因素在 . 个水平中 k% 及 F% 值最高!故选择 B&F
酶用量为 $Q. a作为最佳反应浓度%
各因素中对药用菊花 ?IJF*VIW反应的影响其次
为引物浓度!试验设计的 . 个水平引物浓度中!#Q&
"0J3)B@$($Q# "0J3)B@$水平扩增效果均较好!但过高
的引物浓度将提高引物二聚体形成机率!造成遗传多
样性特异性条带鉴别困难% 在考虑经济费用及试验质
量的前提下!引物浓度选择 #Q& "0J3)B@$%
:EFVP是 VIW扩增的原料之一!其浓度大小直接
影响扩增产物的多少% . 个设计水平中 k" 及 F" 值最
高!说明 :EFVP浓度小于 #Q" 00J3)B@$时!直接影响
VIW扩增产物的浓度*而浓度过高时!可能由于 :EFVP
结合大量游离 ZL" K!影响 B&F酶活性!最终使 VIW扩
增受到影响% 因此!选择 :EFVP#Q" 00J3)B@$作为最
佳浓度水平%
游离的 ZL" K主要通过影响 B&F酶的活性影响扩
增效果!当 ZL" K浓度过高!会造成 B&F酶的活性过高!
出现非特异性扩增 &$’’ % . 个设计水平中k( 及 F( 值最
高!即当 ZL" K浓度在 "Q# 00J3)B@$时!其条带的总体
多态性(背景颜色以及条带分散性等较好于其他各个
水平!故选择 "Q# 00J3)B@$作为最佳浓度水平!此结
果与姜小凤等 &$H’对石蒜属植物 ?IJF*VIW反应体系
优化中 ZL" K研究结果相一致%
模板 -E,对药用菊花 ?IJF*VIW反应的影响最
小!方差分析中显示其 D值小于 V值!进一步表明该
因素浓度变化对 ?IJF扩增影响几乎无差异!即本试
验对模板 -E,的浓度要求较为宽松!结合 . 个设计水
平中 k$ 及 F$ 值最高!最终确定模板 -E,最佳用量为
"# "B体系中加 $# 5L模板 -E,%
$#F"优化的 7@,%I>@V反应体系稳定性和通用性检
测
根据已建立的药用菊花 ?IJF*VIW最佳反应体
系!通过引物初步筛选!我们从中随机选取引物
?IJF((?IJF"$ 和 ?IJF(. 分别对 & 个不同地域来源的
"% 个品种的 (" 份药用菊花材料进行 VIW扩增验证!
结果表明均能扩增出多态性丰富(相对清晰的电泳条
带"如图 ’(图 & 和图 A #% 说明该优化的药用菊花
?IJF*VIW反应体系是可行的!可以进一步应用于药用
菊花的分子生物学研究%
F"讨论
目前!基于 VIW扩增的 -E,分子标记技术发展
较快且应用越来越广泛 &$&’ % 其中 ?IJF标记作为一种
新型的目的基因分子标记!不仅具有操作简便(稳定性
和重复性高(成本较低(引物通用性强等特点!而且其
单引物产生的标记能够有效地与目标性状连锁 &$A’ %
该标记方法被有效地运用在有关样品的遗传多样性分
析(目的基因表达差异研究等方面% 但 ?IJF分子标
.&’$
核!农!学!报 "& 卷
图 ]"引物 F 对 ! F^$ 样品扩增结果
4356]"M()82+,.9,+)2,5+&: ,0! F^$ /&:.()/’N >+3:)+F
图 W"引物 $! 对 ! F^$ 样品扩增结果
4356W"M()82+,.9,+)2,5+&: ,0! F^$ /&:.()/’N >+3:)+$!
图 C"引物 FP 对 ! F^$ 样品扩增结果
4356C"M()82+,.9,+)2,5+&: ,0! F^$ /&:.()/’N >+3:)+FP
记技 术 受 VIW反 应 体 系 中 的 多 个 因 素 综 合 影
响 &"# @""’ !不同试材在 ?IJF*VIW反应体系中各因素的
最佳浓度和影响主次也存在差异% 针对不同的研究材
料确定最佳的反应体系是成功应用 ?IJF*VIW标记技
术的前提!对特定的反应体系进行优化是一项基础性
工作!这也是获得理想(可靠的研究结果的关键 &"( @".’ %
H&’$
!$# 期 药用菊花 ?IJF*VIW反应体系的正交优化
张君玉等 &$$’ 对葡萄的研究中!认为 :EFVP是影响
?IJF*VIW反应体系的最主要因素% 侯小改等 &"H’对牡
丹 ?IJF分子标记正交优化得出 ZL" K浓度对试验影响
尤为重要!而赵瑞强等 &"’’却发现铁皮石斛 ?IJF分子
标记正交优化的最显著影响因素为 B&F酶!本试验以
药用菊花为材料的研究结果也表明 B&F酶是影响扩增
结果的最显著因素%
建立一个高效(稳定的 ?IJF@VIW反应体系是
?IJF分子标记技术应用的前提!除 B&F酶外!ZL" K(
:EFVP(引物(模板 -E,的浓度也均影响 ?IJF*VIW扩
增效率% 侯小改等 &"H’对牡丹的 ?IJF正交优化研究发
现引物浓度是影响扩增效果的一个较重要的因素!其
用量直接关系到 VIW产物生成!浓度过低则无法启动
VIW反应!过高容易产生引物二聚体!且出现非特异
性产物!本试验结果也显示引物的浓度对药用菊花
?IJF*VIW反应的影响仅次于 B&F酶% 其次!:EFVP是
VIW反应的直接原料!浓度高易产生错误掺入!与 B&F
酶竞争性结合 ZL" K!严重制约 B&F酶活性% 反之!浓
度低则造成产物单链化而影响扩增效果!因此!本文在
有效平衡药用菊花 ?IJF*VIW产物量(特异性与合成
忠实性间关系的基础上!将 #Q" 00J3)B@$作为 :EFVP
最佳浓度!取得了较好的试验结果% 另外!ZL" K通过
影响引物与模板的结合效率(产物特异性及引物二聚
体的形成!继而显著的影响 VIW扩增的特异性和产
量% 秦国新等 &"&’在建立草莓属植物 ?IJF体系中却发
现 ZL" K对体系的影响差异不显著!结合本文的方差分
析结果其 D值小于 V值!这也进一步证明了 ZL" K在不
同浓度下几乎没有差异% 模板 -E,在药用菊花 ?IJF
@VIW反应体系中影响最小!模板量过多使非特异性
产物增加!杂质能抑制 B&F酶的活性!最终影响 VIW
的效率!这与姜小凤等 &$H’在石蒜属植物上的研究结果
基本一致% 此外!试验改进了药用菊花提取 -E,的方
法!IF,+*fX99缓冲液有效缓减了药用菊花中的多糖和
多酚类次生代谢产物!提高了 -E,纯度!可为同类其
它植物材料提取基因组 -E,提供借鉴% 综上所述!在
一定范围内 ZL" K(:EFVP(模板 -E,(引物 % 个因素的
用量!对药用菊花 ?IJF扩增结果影响都不大%
优化 ?IJF*VIW反应体系的方法很多!正交试验
设计优化体系能够有效节约人力(物力!同时综合考虑
试验中各个因素以及它们的交互作用!避免了单因素
试验过程中产生的误差!使试验结果更趋于科学(合
理 &$$’ !另外!本文结合方差分析进一步有效评价了试
验误差% 当然!该方法也存在一定的局限性!对实验结
果的评价带有一定的个人主观成分!而打分的高低直
接影响试验结果!因此!客观地建立健全的评价标准体
系有助于药用菊花 ?IJF*VIW反应体系的准确建立和
该方法的广泛应用% 我们在建立的特定的 ?IJF体系
基础上!初步筛选出了一定数量条带清晰(种间差异明
显(多态性丰富的引物!并且随机抽选了引物 ?IJF((
?IJF"$ 和 ?IJF(. 对药用菊花 ?IJF*VIW反应体系进
行验证都能获得清晰(稳定和多态性丰富的扩增结果!
将为以后的药用菊花植物分子遗传学与标记辅助选择
育种研究打下基础%
K"结论
本研究利用正交设计在 . 个水平上对影响药用菊
花 ?IJF*VIW反应的 . 个主要因素进行优化试验!对
VIW结果进行了方差分析!其中只有 B&F酶对试验影
响显著!各因素对药用菊花 ?IJF反应的影响依次$
B&F酶 q引物 q:EFVPqZL" K q模板-E,% 首次建立
了稳定性好(分辨率高的药用菊花 ?IJF*VIW反应体
系$反应总体积 "# "B! -E,模板 $# 5L!引物 #Q&
"0J3)B@$!:EFVP#Q" 00J3)B@$!ZL" K"Q# 00J3)B@$!
B&F酶 $Q.a% 采用 & 个不同地域来源的 (" 个不同药
用菊花材料对优化的反应体系进行了稳定性和通用性
验证!试验结果均扩增出理想的多态性条带% 表明了
优化的 ?IJF*VIW反应体系可以为后期药用菊花分子
生物学研究提供参考!该标记可以进一步应用于药用
菊花物种亲缘关系和系统分类(遗传图谱构建(基因定
位和分子标记辅助育种等方面的研究%
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